向日葵菌核病生防菌的篩選與鑒定

何思宇，李婷婷，郭晶晶，李曉全，韓 冰

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

菌核病是向日葵的一種常見(jiàn)病，又稱爛盤病、白腐病，病原為核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）。自發(fā)現(xiàn)該病以來(lái)，它的發(fā)病面積一直在不斷擴(kuò)大，發(fā)病率也在不斷地上升，這種病害在向日葵主產(chǎn)區(qū)里每年發(fā)病率在50%左右，有時(shí)可高達(dá)70%以上[1]。對(duì)向日葵的品質(zhì)和產(chǎn)量影響很大，也給農(nóng)民帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。菌核病是由核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）真菌侵染引起的病害。在條件適宜的情況下，菌核開(kāi)始萌發(fā)，可直接形成菌絲侵染寄主，也可形成子囊盤產(chǎn)生子囊和子囊孢子，子囊孢子隨風(fēng)雨傳播到寄主表面后，發(fā)芽成菌絲，侵染致使向日葵發(fā)病。該病導(dǎo)致向日葵的莖折、根莖部腐爛、花盤、葉及種仁腐爛等。花盤受害時(shí)，從底面到表面布滿白色絨毛狀菌絲層，內(nèi)有黑色菌核。莖部發(fā)病時(shí)，病部表面有白色絨毛狀的薄膜，褪色后，形成灰白色圓形或橢圓形斑點(diǎn)[2]。

目前，應(yīng)用的防治方法主要是藥劑防治，用40%紋枯利800～1000倍液或50%托布津可濕性粉劑1000倍液在向日葵現(xiàn)蕾前或在盛花期噴灑1～2次。用50%速克靈500～1000倍液在苗期或開(kāi)花期噴灑[3]。目前，雖然藥劑防治和抗病育種的方面取得了一些成果，但藥物防治成本高且會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，而抗病育種的收效不大。

生物防治具有安全、環(huán)保、成本低等特點(diǎn)。許多學(xué)者在生物防治方面都做了嘗試。張一名從向日葵根圍土壤中分離得到1株枯草芽孢桿菌，通過(guò)拮抗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)核盤菌菌絲生長(zhǎng)點(diǎn)附近出現(xiàn)明顯的異常分枝和囊泡狀畸形，在距該菌株一定范圍內(nèi)核盤菌不能形成菌核[4]。王鵬研究表明，一種非致病菌尖孢鐮刀菌產(chǎn)生的環(huán)孢素a能夠抑制核盤菌菌絲的生長(zhǎng)和菌核的形成，因此環(huán)孢素a可作為生防劑；同時(shí)發(fā)現(xiàn)假單胞菌的2個(gè)不同菌株能很好地抑制核盤菌子囊孢子初期萌發(fā)[5]。還有其他研究表明，鏈霉菌、地衣芽孢桿菌、辣椒溶桿菌、油菜假單胞菌均屬于向日葵菌核病生防菌[6]。本研究通過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)、盆栽試驗(yàn)方法對(duì)從內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市采摘的向日葵花盤和根進(jìn)行生防菌的系統(tǒng)分離篩選，以期找到對(duì)向日葵菌核病菌有顯著抑制作用并能適應(yīng)內(nèi)蒙古生態(tài)條件的優(yōu)良生防菌株。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

生防細(xì)菌分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗采集的5株未感染病的向日葵根及花盤。向日葵菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

菌株的分離、純化：將供試向日葵的根和花盤表面消毒后，加無(wú)菌水和石英砂充分研磨，稀釋成10-1、10-2、10-3共3個(gè)梯度，吸取每個(gè)梯度研磨液20 μL分別涂布3個(gè)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）和3個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）。置于24°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～7 d，依據(jù)菌落形態(tài)、顏色、透明度、光滑度等特征，挑取單菌株，純化保存。

1.3 生防菌的篩選

1.3.1 拮抗菌的初篩 采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行拮抗試驗(yàn)。在PDA平板上中心處接種直徑6 mm病原菌菌餅，在距離中心3 cm互相垂直的4個(gè)點(diǎn)接種不同的待測(cè)菌株，每一組合重復(fù)3次，以中央只接種病原真菌的平板為對(duì)照，放于培養(yǎng)箱中24°C培養(yǎng)。

1.3.2 拮抗菌的復(fù)篩 將病原菌菌餅反貼于PDA培養(yǎng)基中央，于24°C下培養(yǎng)，待病原菌菌落直徑長(zhǎng)到2 cm時(shí)，用接種環(huán)挑取待測(cè)菌株，從病原真菌的一側(cè)沿與其生長(zhǎng)方向相交的方向劃線接種[7]；對(duì)照實(shí)驗(yàn)：以S.sclerotiorum為指示菌，以枯草芽孢桿菌為測(cè)試菌，作陽(yáng)性對(duì)照組；以不接菌株和以無(wú)菌水代替測(cè)試菌為空白對(duì)照組；以培養(yǎng)基代替測(cè)試菌為環(huán)境對(duì)照組。

1.3.3 抑菌帶的測(cè)量 以S.sclerotiorum為指示菌，將病原菌菌種預(yù)先培養(yǎng)在PDA平板上待菌落長(zhǎng)至5 cm直徑，用打孔器打取6 mm直徑菌塊，接種在培養(yǎng)皿中央，在周圍等距離用穿刺法接種待測(cè)菌株，24°C下72 h后觀察抑菌帶寬度。并觀察抑菌帶附近菌絲形態(tài)。

1.4 菌株N9、N22的形態(tài)特征和細(xì)菌生理生化特征的測(cè)定

參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]中假單胞菌屬和沙雷氏菌屬的鑒定方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)、革蘭氏染色、氧化酶、接觸酶、淀粉水解、檸檬酸鹽利用、膿青素的產(chǎn)生、明膠液化、耐鹽度等特性的鑒定。

1.5 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

1.5.1 菌種DNA提取 CTAB法提取DNA[9]。用1%濃度瓊脂糖水平凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。

1.5.2 PCR擴(kuò)增16S rDNA序列 以細(xì)菌總DNA為模板，27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物擴(kuò)增N9和N22的16S rDNA序列，目的片段長(zhǎng)度為1400 bp 左右。 PCR 體系為：10×PCR Buffer 5.0 μL，2.5 mM dNTPs 4.0 μL，F(xiàn)orward Primer（10 μM）1.0 μL，Reverse Primer （10 μM）1.0 μL，模板 DNA 3.0 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，加ddH2O至終體積50.0 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性35 s；55℃退火 45 s；72℃ 延伸 1.5 min；30個(gè)循環(huán)后；72℃延伸8 min。

1.5.3 16S rDNA序列測(cè)定及分析 將PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析，采用MEGA 6.0程序的Neighborjoining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 盆栽向日葵的生防實(shí)驗(yàn)

1.6.1 向日葵種子的處理 在超凈臺(tái)中，用75%的酒精和1%的次氯酸鈉對(duì)向日葵種子表面消毒后用發(fā)酵48 h生防菌原液浸泡種子30 min。

1.6.2 土壤處理 將購(gòu)買的營(yíng)養(yǎng)土與蛭石1∶1混合，土壤高溫滅菌后裝入15 cm×15 cm的花盆內(nèi)，將處理過(guò)的向日葵種子播種，出苗后每盆留苗1株。每盆接入菌核5 g[10]，撒于盆栽表土上，上覆2 cm厚的薄土，用前面所篩效果最好的兩種生防菌N9和N22發(fā)酵原液處理土壤，發(fā)酵原液按用量分別為25 mL、50 mL、100 mL 3個(gè)梯度處理[10]，B為只接病原菌處理、C為空白對(duì)照各3個(gè)處理（表1）。對(duì)照植株發(fā)病后測(cè)定發(fā)病率和防治效果。

發(fā)病率/%=［病株數(shù)/總處理株數(shù)］×100

防治效果/%=［（對(duì)照發(fā)病率-處理發(fā)病率）/對(duì)照發(fā)病率］×100[11]

表1 實(shí)驗(yàn)處理

1.6.3 生物量及株高的測(cè)定[12]實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)量向日葵的株高，再置于65°C條件下烘干至恒重。分別記錄地上生物量、地下生物量、總生物量。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的篩選

從向日葵植株的根及花盤中分離得到187個(gè)分離物，經(jīng)過(guò)平板對(duì)峙法的初篩和復(fù)篩獲得4株具有拮抗作用的細(xì)菌，分別為 N3、N9、N18、N22。從平板對(duì)峙法的結(jié)果看，N9和N22在不同時(shí)期都對(duì)核盤菌有較好的抑制效果?？莶菅挎邨U菌（陽(yáng)性對(duì)照）抑菌帶寬度為0.5 mm、N22抑菌帶寬度為3.0 mm、N9抑菌帶寬度為2.8 mm。

設(shè)枯草芽孢桿菌為陽(yáng)性對(duì)照，由圖1看出N22、N9的拮抗效果比枯草芽孢桿菌的拮抗效果強(qiáng)。與空白對(duì)照組比較，菌株N22、N9抑菌帶附近的核盤菌在一定范圍內(nèi)不能形成菌核；空白組菌絲生長(zhǎng)旺盛，有菌核生成。由于培養(yǎng)核盤菌的培養(yǎng)基與培養(yǎng)N22、N9的培養(yǎng)基不同，為排除培養(yǎng)基成分對(duì)核盤菌生長(zhǎng)的影響，特設(shè)環(huán)境對(duì)照組表明培養(yǎng)基成分對(duì)核盤菌生長(zhǎng)無(wú)影響。

2.2 N9、N22的形態(tài)學(xué)鑒定

透射電鏡下，放大20000倍后觀察到，N9為桿狀菌且有極生鞭毛，菌體大小為（0.3～0.4）μm×（0.9～1.2）μm，革蘭氏染色為陰性。在NA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24 h后，菌落可產(chǎn)生橙色色素，圓形，不透明，表面凸起，光滑，較黏稠，易挑起，邊緣整齊。N22為短桿狀菌且有周生鞭毛，菌體大小為（0.5～0.7）μm×（1.5.～1.8）μm，革蘭氏染色為陰性。在NA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24 h后，菌落表面光滑不透明，可產(chǎn)生紅色色素，圓形，較黏稠，易挑起，邊緣整齊。

2.3 生理生化特征分析

N22、N9及標(biāo)準(zhǔn)菌株黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的生理生化特征進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。生理生化實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株：黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）從中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）購(gòu)買。

由表2可知，N9能水解精氨酸雙水解酶、脂酶、氧化酶、過(guò)氧化氫酶、檸檬酸鹽、明膠，不水解淀粉，也不產(chǎn)生H2S，能利用卵磷脂酶，不產(chǎn)生膿青素，也不進(jìn)行反硝化作用。最適生長(zhǎng)的NaCl濃度為2%～5%，當(dāng)NaCl濃度為5%時(shí)菌落顏色為白色，NaCl濃度為7%時(shí)不生長(zhǎng)。

表2 細(xì)菌生理生化特征分析

N22能水解脂酶、過(guò)氧化氫酶、明膠、七葉靈、不水解精氨酸雙水解酶、氧化酶、脲酶、苯丙氨酸脫氨酶、也不產(chǎn)生H2S，能利用檸檬酸鹽、丙二酸。最適生長(zhǎng)的NaCl濃度為2%～7%，NaCl濃度為7%時(shí)只有少量單菌落，菌落顏色為白色，NaCl濃度為10%時(shí)不生長(zhǎng)。

2.4 16S rDNA序列分析

將N9和N22的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析后。結(jié)果表明，N9與假單胞菌屬有較高的同源性，與綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis，DQ682655）有99%的相似性。N22與沙雷氏菌屬的細(xì)菌有較高同源性，與深紅沙雷氏菌（Serratia rubidaea，AB004571）相似性達(dá)100%。

將N9和N22的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析后，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖 3，N9與Pseudomonas chlororaphis形成最小分支，N22與Serratia rubidaea形成最小分支。依據(jù)N9和N22的生理生化特征及建樹(shù)結(jié)果，將N9鑒定為綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis），N22鑒定為深紅沙雷氏菌（Serratia rubidaea）。

2.5 盆栽向日葵的生防實(shí)驗(yàn)

將篩選到的N9和N22作為供試菌，試驗(yàn)所用向日葵供試種子為GE817，進(jìn)行盆栽向日葵菌核病的防治效果比較。結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)結(jié)果表明，N9和N22兩株供試拮抗菌發(fā)酵原液處理土壤的不同用量對(duì)向日葵菌核病均表現(xiàn)出一定的控制效果。其中N22拮抗菌株25 mL發(fā)酵原液處理土壤后對(duì)向日葵菌核病的防效均達(dá)到最高，其防治效果為100%。從防治效果看（表3），2個(gè)菌株處理土壤的發(fā)酵原液用量對(duì)向日葵菌核病的防效存在顯著差異，同比之下N22的防治效果更好一些。N9與N221∶1混合發(fā)酵原液處理的向日葵有明顯的促生長(zhǎng)作用（表4）；其中50 mL發(fā)酵液處理的向日葵株高效果最佳，其中100 mL發(fā)酵液處理的向日葵生物量最高。

表3 拮抗菌株N9和N22對(duì)向日葵菌核病盆栽防治效果

表4 拮抗菌株N9和N22對(duì)向日葵植物生長(zhǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

化學(xué)藥劑防治菌核病，不僅會(huì)使核盤菌產(chǎn)生抗藥性，并且對(duì)環(huán)境也造成了嚴(yán)重的污染，給食品安全問(wèn)題帶來(lái)了隱患。利用生防菌防治向日葵菌核病是生物防治的重要手段，此方法具有不產(chǎn)生抗性，不污染環(huán)境，僅抑制或殺傷防治對(duì)象，保持生態(tài)平衡，能參與生態(tài)環(huán)境調(diào)控，起到長(zhǎng)效作用等優(yōu)點(diǎn)。因此，篩選拮抗能力穩(wěn)定的生防菌對(duì)菌核病的防治具有重要的意義。生物防治是目前植物病害防治研究的熱點(diǎn)之一，但主要集中于生防菌的分離、篩選、生物學(xué)特征以及拮抗機(jī)理等方面的研究，但應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際并具有良好防治效果的相關(guān)報(bào)道較少。

N9和N22兩種菌株對(duì)向日葵的菌核病均有一定的防治效果，但嘗試將兩種菌株混合在一起后處理被核盤菌侵染的向日葵，拮抗效果并不好，可能由于菌種之間的相互作用降低了對(duì)病原菌的拮抗作用，其抑菌機(jī)理還有待進(jìn)一步研究，但卻發(fā)現(xiàn)N9與N22發(fā)酵原液混合后處理未染病的向日葵有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的作用。根據(jù)形態(tài)觀察和生理生化指標(biāo)測(cè)定，查看《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》可知，菌株N9的生理生化結(jié)果與綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）相符；菌株N22的生理生化結(jié)果與深紅沙雷氏菌（Serratia rubidaea）基本相符，但N22的V.P實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，而查看《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，深紅沙雷氏菌（Serratia rubidaea）的V.P實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，懷疑N22為深紅沙雷氏菌（Serratia rubidaea）的另一亞種。

N9鑒定為綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis），大量研究表明此菌為重要的生防菌，陳懷谷研究發(fā)現(xiàn)綠針假單胞菌對(duì)于小麥全蝕病具有明顯的防治效果，由于綠針假單胞菌菌株能在小麥根際定植，所以由該菌株制成的生防菌劑有較長(zhǎng)的持效期，并且其使用不會(huì)帶來(lái)環(huán)境問(wèn)題，有利于小麥的無(wú)公害生產(chǎn)[13]。王遠(yuǎn)山研究表明綠針假單胞菌對(duì)煙草黑脛病病原菌煙草疫霉有很強(qiáng)的拮抗作用，該菌株對(duì)煙草疫霉菌絲體有很強(qiáng)的抑制作用，并且可以完全抑制煙草疫霉游動(dòng)孢子對(duì)煙草幼苗的侵染[14]。何延靜從甜椒根際土壤中分離得到綠針假單胞菌，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)辣椒疫霉具有強(qiáng)拮抗作用[15]。但對(duì)向日葵菌核病的防治國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，綠針假單胞菌對(duì)核盤菌也有很好的抑制效果。為向日葵菌核病的生物防治提供了理論基礎(chǔ)。

N22鑒定為深紅沙雷氏菌（Serratia rubidaea）。沙雷氏菌（Serratia）屬腸桿菌科，在自然界分布很廣，能產(chǎn)生非水溶性黃、紫、紅色素的革蘭氏陰性小桿菌，一般存在于土壤、水、植物、動(dòng)物以及人類的腸道和呼吸道中。是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌。姜立春以華鎣山香菇作為研究材料，培養(yǎng)得到一株附生細(xì)菌，并鑒定為深紅沙雷氏菌[16]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于深紅沙雷氏菌在植物方面的報(bào)道很少，其對(duì)向日葵菌核病的防治國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。

本研究證實(shí)了綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）和深紅沙雷氏菌（Serratia rubidaea）對(duì)向日葵菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）有很好的抑制作用。經(jīng)盆栽防效試驗(yàn)所篩生防菌N9和N22，還需要在田間對(duì)其生防效果作進(jìn)一步測(cè)試。此外，它的生物學(xué)特性、抑菌機(jī)理、活性物質(zhì)成分也值得進(jìn)一步研究，以探明其在生物防治中的應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)：

［1］楊 濤，李漢華，段 維，等.向日葵菌核病的防治現(xiàn)狀及前景［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，2014（10）：24-25.

［2］高宏博，趙 清，王冬艷，等.向日葵幾種常見(jiàn)病害的識(shí)別與防治［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（22）：119-128.

［3］卜浩宇，張 貴，侯亞光，等.不同向日葵品種資源對(duì)菌核病抗性的田間鑒定［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014（5）：30-37.

［4］張一名，李小娟，王 穎，等.抑制向日葵核盤菌菌核形成的生防菌S-16的鑒定及其生防作用研究［J］.中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2014，30（1）：121-127.

［5］劉新濤，劉玉霞，倪云霞，等.西瓜枯萎病拮抗細(xì)菌的篩選［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，37（9）：94-96.

［6］劉建軍.向日葵菌核病的發(fā)生及防治［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1986，14（11）：38.

［7］侯啟會(huì)，杜秉海，靳 奉，等.向日葵菌核病拮抗菌XRK5的篩選與鑒定［J］.微生物學(xué)報(bào)，2010，37（8）：1200-1204.

［8］東秀珠.常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［9］浦寅芳，馬桂珍，暴增海，等.核盤菌菌核重寄生菌的分離篩選［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，37（11）：80-83.

［10］王 春，王 芊.黑龍江向日葵菌核病拮抗菌株的分離與篩選［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（33）：346-350.

［11］李小娟.向日葵菌核病生防菌的篩選鑒定及其綜合防治［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［12］梁 曦，蘇德榮，楊云貴.灌水對(duì)冷季型混播草坪生物量的影響［J］.草地學(xué)報(bào)，2008，16（1）：60-64.

［13］陳懷谷.一種綠針假單胞菌及其應(yīng)用［P］.中國(guó)發(fā)明專利，CN103602621，2014（2）：26.

［14］王遠(yuǎn)山，王 平，胡正嘉.綠針假單胞菌PL9菌株對(duì)煙草疫霉的拮抗作用研究［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21（3）：248-251.

［15］何延靜，劉海明，胡洪波，等.一株拮抗辣椒疫霉的假單胞菌的分離與鑒定［J］.微生物學(xué)報(bào)，2006，46（4）：516-521.

［16］姜立春，甘 毅，阮期平.一株產(chǎn)紫紅色色素的沙雷氏菌的分離與鑒定［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（28）：12082-12084.