羅非魚無乳鏈球菌巢式PCR檢測(cè)方法的建立

邵　辰，易　弋，黎　婭，黃　荷，伍時(shí)華，楊　軍

(1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州，545006；

2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西科技大學(xué))，廣西柳州，545006；

3.廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西科技大學(xué))，廣西柳州，545006;

4.柳州市漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣西柳州，545006)

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羅非魚無乳鏈球菌巢式PCR檢測(cè)方法的建立

邵辰1,2,3，易弋1,2,3，黎婭1,2,3，黃荷1,2,3，伍時(shí)華1,2,3，楊軍4

(1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州，545006；

2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西科技大學(xué))，廣西柳州，545006；

3.廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西科技大學(xué))，廣西柳州，545006;

4.柳州市漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣西柳州，545006)

摘要：根據(jù)無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)cfb基因序列，設(shè)計(jì)、合成2對(duì)引物，優(yōu)化擴(kuò)增條件，建立了快速高靈敏度鑒別無乳鏈球菌的巢式PCR方法。結(jié)果顯示：使用該方法對(duì)羅非魚(Oreochromis mossambicus)血液樣品進(jìn)行檢測(cè)，可檢測(cè)到活菌濃度為8.7×104 CFU/mL的無乳鏈球菌。對(duì)采自廣西地區(qū)受無乳鏈球菌感染的19份羅非魚樣品進(jìn)行檢測(cè)，18份可獲得目的片段，擴(kuò)增到的序列均為無乳鏈球菌cfb基因序列，檢測(cè)準(zhǔn)確度達(dá)到94.7%。

關(guān)鍵詞：巢式PCR;無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)；cfb基因；羅非魚(Oreochromis mossambicus)

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的病原菌。世界水產(chǎn)業(yè)每年因無乳鏈球菌病造成的損失均高達(dá)100億美元[1,2]。至今為止，發(fā)現(xiàn)有30多種養(yǎng)殖類淡水魚和50多種海水魚容易受到無乳鏈球菌的感染[3]，其中以羅非魚最易受到該病菌的入侵[4]。無乳鏈球菌病發(fā)病較快，除一部分急性死亡外，并沒有明顯的癥狀[5]，因此從發(fā)病魚的癥狀上很難判斷病原菌的種類，從而對(duì)疾病的有效處理產(chǎn)生影響[6,7]。目前關(guān)于羅非魚無乳鏈球菌的檢測(cè)主要依靠的是病原菌的分離和生理生化鑒定等方法[8]，這些方法操作繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)，不能達(dá)到快速鑒定的目的[9，10]。分子鑒定具有快速、簡(jiǎn)便以及靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，是微生物鑒定的發(fā)展趨勢(shì)。雖然有關(guān)無乳鏈球菌的分子檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道[4，11]，但多數(shù)是利用純培養(yǎng)的菌液進(jìn)行檢測(cè)，直接使用受感染組織作為模板進(jìn)行分子檢測(cè)的研究還未見報(bào)道。本研究采用巢式PCR檢測(cè)無乳鏈球菌，大大提高了檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)了以血液為樣本直接檢測(cè)，為無乳鏈球菌病的預(yù)防和治療奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae) 7-7s，甘油保種， -20 ℃保存，由廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究室提供。

1.1.2培養(yǎng)基

腦心浸出液肉湯(BHI)：購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限公司，配制方法參考產(chǎn)品說明書。

1.1.3細(xì)菌的培養(yǎng)

取甘油保藏的無乳鏈球菌10 μL接種于10 mL的BHI培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h備用。

1.2方法

1.2.1引物的合成與設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中無乳鏈球菌cfb基因的序列設(shè)計(jì)引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。合成后將引物稀釋成10 mmol/L的母液-20 ℃保存。引物序列如下：

PcfbA (5′-TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA-3′)

PcfbS (5′-CGACAGCATCACACGAAAAATACA-3′)

CFBAb (5′-CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC-3′)

CFBSb (5′-ATGATGTATCTATCTGGAACTCT

AGTG-3′)

1.2.2PCR擴(kuò)增

1.2.2.1外側(cè)擴(kuò)增體系

使用引物PcfbA和PcfbS對(duì)無乳鏈球菌菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix(購(gòu)自天根生化科技有限公司)12.5 μL，濃度為10 μmol/mL的引物PcfbA和PcfbS各1 μL，無乳鏈球菌菌液1 μL，加雙蒸水補(bǔ)足25 μL。

擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.2.2內(nèi)側(cè)擴(kuò)增體系

以外側(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用引物CFBAb和CFBSb進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。

PCR混合液組成：2×TaqPCR Master Mix (購(gòu)自天根生化科技有限公司)12.5 μL，10 μmol/mL引物CFBAb和CFBSb各1 μL，第一輪PCR產(chǎn)物1 μL，加雙蒸水補(bǔ)足25 μL。

擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR完成后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.3PCR條件的優(yōu)化

分別使用50、53、55、57、59和61 ℃作為PCR反應(yīng)的退火溫度，按1.2.2的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定最佳的退火溫度。

1.2.4巢式PCR特異性實(shí)驗(yàn)

分別用無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、摩氏摩根菌(Morganellamorganii)、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)、路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)、志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌(Aeromonasjandaei)菌液作為模板，按上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂凝膠電泳分析特異性結(jié)果。

1.2.5靈敏度實(shí)驗(yàn)

將無乳鏈球菌菌液稀釋至8.7×107、8.7×106、8.7×105、8.7×104、8.7×103、8.7×102、8.7×101和8.7×100CFU/mL 8個(gè)不同的濃度，采用上文所述的方法進(jìn)行巢式PCR。在15和30次之間調(diào)整PCR的循環(huán)次數(shù)，以靈敏度為指標(biāo)，優(yōu)化循環(huán)次數(shù)。同時(shí)以ddH2O替代模板作為陰性對(duì)照。

1.2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

配制活菌濃度為8.7×105CFU/mL的樣品，重復(fù)檢測(cè)7次，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性。

1.2.7血液樣品的檢測(cè)

從健康羅非魚尾部抽取新鮮血液，與新鮮無乳鏈球菌菌液按比例混合，配制成活菌濃度分別為8.7×107、8.7×106、8.7×105、8.7×104、8.7×103、8.7×102、8.7×101和8.7×100CFU/mL的血液樣品。利用所優(yōu)化的方法對(duì)血液樣品進(jìn)行檢測(cè)，判斷檢測(cè)靈敏度。

1.2.8臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

自農(nóng)戶處取得患病羅非魚，從魚尾抽取魚血作為模板，使用巢式PCR進(jìn)行檢測(cè)，判斷其是否感染無乳鏈球菌。并對(duì)該魚的腦肝脾腎心等器官進(jìn)行采樣，分離鑒定病原菌，判斷與巢式PCR檢測(cè)結(jié)果是否一致。

2結(jié)果

2.1巢式PCR擴(kuò)增及反應(yīng)條件的優(yōu)化

分別對(duì)cfb基因的兩對(duì)引物的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，當(dāng)退火溫度在55 ℃左右時(shí)，第一輪PCR在1 000 bp附近(圖1a)，第二輪PCR在260 bp附近(圖1b)有較為清晰的條帶，無拖尾現(xiàn)象。

圖1　巢式PCR擴(kuò)增溫度梯度優(yōu)化

a第一輪擴(kuò)增，b第二輪擴(kuò)增;M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.Tm=50 ℃；2.53 ℃;3.55 ℃;4.57 ℃;5.59 ℃;6.61 ℃

2.2特異性實(shí)驗(yàn)

對(duì)已采集到的多種羅非魚致病菌，與無乳鏈球菌同時(shí)進(jìn)行巢式PCR，作為特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其引物的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無乳鏈球菌條帶清晰，大小正確；而其他菌株及陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出任何條帶(見圖2)。說明該實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驈膶?duì)羅非魚致病的多種細(xì)菌中特異性的區(qū)分出無乳鏈球菌，而不會(huì)與其他的致病菌混淆。

圖2　PCR反應(yīng)特異性實(shí)驗(yàn)

a第一輪擴(kuò)增，b第二輪擴(kuò)增；M.DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae);2.陰性對(duì)照(negative control);3.金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus);4.嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila);5.摩氏摩根菌(Morganellamorganii);6.維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii);7.路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii);8.志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides);9.蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis);10.簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌(Aeromonasjandaei)

2.3靈敏度實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.2.5中所述的方法，對(duì)巢式PCR的靈敏度進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果見表1。多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在第一輪25次循環(huán)和第二輪25次循環(huán)時(shí)，巢式反應(yīng)能得到最高的靈敏度。再增加反應(yīng)次數(shù)會(huì)導(dǎo)致陰性對(duì)照出現(xiàn)假陽性條帶，而降低反應(yīng)次數(shù)會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)靈敏度下降。因此，選擇第一輪和第二輪均為25次循環(huán)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，7次反應(yīng)均能在260 bp附近擴(kuò)增出清晰條帶(見圖3)，而陰性對(duì)照均無擴(kuò)增產(chǎn)物，說明本方法重復(fù)性較好。

表1　巢式PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)

圖3　巢式PCR重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

M.DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.無乳鏈球菌7-7-小;2.無乳鏈球菌001;3.無乳鏈球菌002;4.無乳鏈球菌003;5.無乳鏈球菌004;6.無乳鏈球菌005;7.無乳鏈球菌006;8.陰性對(duì)照

2.5血液樣品靈敏度實(shí)驗(yàn)

按1.2.7所述方法配制含無乳鏈球菌的羅非魚血液樣品，采用優(yōu)化后的方法進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示當(dāng)血液中無乳鏈球菌含量大于8.7×104CFU/mL時(shí)，均能擴(kuò)增得到目的條帶(圖4)。

圖4　血液樣品靈敏度實(shí)驗(yàn)

M.DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1-8.無乳鏈球菌含量分別為 8.7×107、8.7×106、8.7×105、8.7×104、8.7×103、8.7×102、8.7×101、8.7×100CFU/mL的血液樣品;9.陰性對(duì)照

2.6臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

自柳州市三千村的農(nóng)戶處取得患病羅非魚，抽取血液進(jìn)行檢測(cè)，得出陽性結(jié)果，陰性對(duì)照未出現(xiàn)條帶(圖5)。同時(shí)從患病羅非魚的腦肝脾等器官中分離出了無乳鏈球菌，與PCR檢測(cè)結(jié)果一致。從2014年5-8月，在廣西桂中地區(qū)共采集到患病羅非魚樣品29份，其中有19份感染無乳鏈球菌。在這19份樣品中18份獲得目的片段，擴(kuò)增到的序列均為無乳鏈球菌cfb基因序列，檢測(cè)準(zhǔn)確度達(dá)到94.7%。

圖5　臨床檢測(cè)結(jié)果

3討論

毒力因子及其相關(guān)基因是致病菌的特有基因，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于水生動(dòng)物致病菌的快速檢測(cè)[12-14]。cfb基因是無乳鏈球菌的特有基因，它能編碼一種膜外蛋白——CAMP因子，該因子具有促進(jìn)溶血的作用，在與金黃色葡萄球菌分泌的β溶血毒素共同作用下，增強(qiáng)對(duì)羊血細(xì)胞的溶血程度和胞膜成分的溶解，即所謂的CAMP反應(yīng)，目前無乳鏈球菌CAMP因子已成為鑒別無乳鏈球菌的重要指標(biāo)。

王均等[15]針對(duì)無乳鏈球菌莢膜多糖的cpsF基因和CAMP因子的cfb基因序列建立了無乳鏈球菌雙重PCR的檢測(cè)方法，該方法具有特異高的優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)靈敏度要遠(yuǎn)低于巢式PCR。賈玉萍等[16]利用巢式PCR對(duì)牛源無乳鏈球菌進(jìn)行檢測(cè)，取得了較好的結(jié)果，但其選用的目標(biāo)基因16S RNA對(duì)鏈球菌屬的其他細(xì)菌可能會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)特異性影響。而且其檢測(cè)模板是人工配制的含菌牛奶樣品的DNA提取液，同本研究直接用血液相比，多了DNA提取的操作步驟，同時(shí)也未曾對(duì)患病奶牛進(jìn)行檢測(cè)。本研究選擇無乳鏈球菌cfb基因?yàn)槟繕?biāo)基因，首次建立了羅非魚源的無乳鏈球菌巢式PCR檢測(cè)方法，以血液為模板能直接檢測(cè)出無乳鏈球菌含量大于8.7×104CFU/mL的血液樣品，而常規(guī)PCR無論反應(yīng)次數(shù)多高，都無法在此濃度下獲得陽性結(jié)果。此方法使用血液進(jìn)行采樣和檢測(cè)比較簡(jiǎn)便易行，除了應(yīng)用于診斷魚類無乳鏈球菌病外，還可用于監(jiān)測(cè)和普查養(yǎng)殖生產(chǎn)中羅非魚感染無乳鏈球菌的狀況，可預(yù)見性提前做好預(yù)防，防止此病的發(fā)生。

靈敏度實(shí)驗(yàn)中，巢式PCR可以從1 μL的模板中檢測(cè)出活菌濃度為8.7×100CFU/mL的無乳鏈球菌。在此濃度下，1 μL的模板中所含活菌數(shù)基本沒有，理論上無法得到陽性結(jié)果。分析認(rèn)為無乳鏈球菌在培養(yǎng)過程中有大量細(xì)胞死亡后并未降解，或者降解后DNA片段釋放，使得反應(yīng)體系中模板的DNA片段拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于活菌數(shù)量，參與了PCR，使得實(shí)驗(yàn)靈敏度高于預(yù)期值。在使用羅非魚血液樣品進(jìn)行巢式PCR時(shí)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)的靈敏度低于純培養(yǎng)的細(xì)胞樣品。這可能是因?yàn)檠褐械膹?fù)雜成分，如血細(xì)胞、血紅素、血脂、金屬離子等，對(duì)PCR的擴(kuò)增效率造成了一定的影響[17]。此外，DNA聚合酶是PCR反應(yīng)得以進(jìn)行的最關(guān)鍵因素之一，不同來源的DNA聚合酶擴(kuò)增效率不一樣，會(huì)得到不同的檢測(cè)靈敏度。因此，在使用本方法檢測(cè)無乳鏈球菌時(shí)，若使用了不同品牌的DNA聚合酶、甚至同一品牌不同批次的聚合酶時(shí)，都需重新使用標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)靈敏度的校對(duì)。

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(責(zé)任編輯：鄧薇)

Development of nested PCR for detection of Streptococcus agalactiae from tilapia

SHAO Chen1,2,3,YI Yi1,2,3,LI Ya1,2,3,HUANG He1,2,3,WU Shi-hua1,2,3,YANG Jun4

(1.CollegeofBiologicalandChemicalEngineering,GuangxiUniversityofScienceandTechnology,Liuzhou545006，Guangxi，China;2.GuangxiKeyLaboratoryofGreenProcessingofSugarResources，GuangxiUniversityofScienceandTechnology,Liuzhou545006，Guangxi，China;3.KeyLaboratoryforProcessingofSugarResourcesofGuangxiHigherEducationInstitutes,GuangxiUniversityofScienceandTechnology,Liuzhou545006，Guangxi，China;4.LiuzhouFisheryTechnicalExtensionStation,Liuzhou545006,Guangxi,China)

Abstract：Based on the cfb gene sequence of Streptococcus agalactiae,two pairs of primers were designed and synthesized and the amplification conditions were optimized to establish the nested PCR method which could identify S.agalactiae with high sensitively.The results showed that S.agalactiae could be directly detected from blood sample at a minimum concentration as 8.7×104 CFU/ml by this method.Nineteen clinical S.agalactiae-infected tilapia samples collected from Guangxi province were applied to verify this method.The results showed that 260 bp fragment could be amplified in 18 samples and the sequencing analysis revealed that all the amplified fragment were cfb gene of S.agalactiae. The detection accuracy of this method was 94.7%.

Key words：nested PCR; Streptococcus agalactiae;cfb gene;tilapia (Oreochromis mossambicus)

中圖分類號(hào)：S941.42

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6907-(2016)02-0040-05

作者簡(jiǎn)介：第一邵辰(1988-)，男，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)致病菌的研究。通訊作者：楊軍。E-mail:yangjun_yyz@163.com

收稿日期：2014-11-12；

修訂日期：2015-06-17

資助項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金“國(guó)家羅非魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系”(CARS-49)；柳州市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃課題(2013E020602)