高血壓腦出血血腫周圍C反應(yīng)蛋白變化與凋亡細(xì)胞的關(guān)系

常海剛　王雅瀟　馬鵬舉　周　祥　惠　磊　徐　翀　周文科　金保哲(通訊作者)

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院　衛(wèi)輝　453100

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高血壓腦出血血腫周圍C反應(yīng)蛋白變化與凋亡細(xì)胞的關(guān)系

常海剛王雅瀟馬鵬舉周祥惠磊徐翀周文科金保哲(通訊作者)

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院衛(wèi)輝453100

【摘要】目的探討高血壓腦出血患者血腫周圍C反應(yīng)蛋白表達(dá)及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。方法選取20例高血壓腦出血患者血腫灶周圍腦組織標(biāo)本為實(shí)驗(yàn)組，5例手術(shù)通道血腫遠(yuǎn)隔部位腦組織標(biāo)本為對(duì)照組。根據(jù)腦出血量大小實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本分為3組A(出血量35～45 mL)、B(出血量45～70 mL)、C(出血量≥70 mL)組。所有標(biāo)本均行TUNEL染色、C反應(yīng)蛋白免疫組化染色。對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)分析。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組血腫周圍腦組織都有不同程度TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞和C反應(yīng)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞；越遠(yuǎn)離血腫周圍，對(duì)照組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞和C反應(yīng)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少，同時(shí)血腫量較大者，血腫周圍TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞和C反應(yīng)蛋白表達(dá)更為顯著。結(jié)論腦出血血腫周圍腦組織大量表達(dá)C反應(yīng)蛋白，TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞亦較明顯，而血腫遠(yuǎn)隔部位CRP不表達(dá)或僅少量表達(dá)，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)亦減少，CRP可能直接參與腦出血血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡過程。

【關(guān)鍵詞】C反應(yīng)蛋白；腦出血；細(xì)胞凋亡

腦出血是神經(jīng)科常見病、多發(fā)病，是一種最具破壞性的腦血管病，占所有腦卒中的15%，其發(fā)病率、致殘率、復(fù)發(fā)率及病死率均較高[1]，且預(yù)后極差[2-3]。近年來，隨著腦血管病患者數(shù)的不斷上升，腦血管病已成為威脅人類健康的首發(fā)疾病，腦血管病變的診治日益受到重視。研究表明，腦出血后出血部位和周圍組織存在炎性反應(yīng)，是腦出血后繼發(fā)性腦損害病理生理的重要環(huán)節(jié)[4-5]。C反應(yīng)蛋白(CRP)為一種反映各種急慢性炎癥的時(shí)相蛋白[6]，正常情況存在于血清或血漿中，機(jī)體在急性炎癥或創(chuàng)傷時(shí)，體內(nèi)炎性反應(yīng)系統(tǒng)被激活，CRP水平顯著升高[7-8]。研究證實(shí)CRP是與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、演變進(jìn)展有關(guān)的促炎因子[9]，可預(yù)測(cè)未來心腦血管事件的發(fā)生。它在冠心病、腦梗死、周圍血管栓塞等疾病診斷和預(yù)測(cè)中發(fā)揮越來越重要的作用，甚至被認(rèn)為是心、腦血管病危險(xiǎn)評(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)[10]。大量研究也證實(shí)，在自發(fā)性腦出血患者中，血清CRP增高并和患者預(yù)后有密切相關(guān)性，以往研究主要集中在全身及血清中CRP的表達(dá)，而對(duì)腦組織中CRP參與病理生理直接證據(jù)較少，尤其對(duì)自發(fā)性腦出血血腫周圍的CRP表達(dá)及與細(xì)胞凋亡關(guān)系等研究更少。本文旨在研究高血壓腦出血血腫周圍CRP表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料研究對(duì)象為新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治手術(shù)患者20例，男12例，女8例，年齡38～65歲，平均50歲。家屬簽署知情同意書。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)符合1995年第4屆腦血管會(huì)議修訂的腦出血診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)病前4周內(nèi)出現(xiàn)潛在的感染、創(chuàng)傷、手術(shù)史、放化療及抗炎藥物治療史；糖尿病、肝腎疾病、肺結(jié)核、慢性阻塞性肺疾病、心功能衰竭、自身免疫性疾病。所有患者行CT檢查，測(cè)量血腫量，出血量計(jì)算采用多田方法T=π/6×a×b×c，a為血腫最大層面最大直徑(cm)，b為血腫最大層面與a垂直的直徑，c為血腫出現(xiàn)的層數(shù)。實(shí)驗(yàn)組按血腫量分為3組，A組：出血量35～45 mL；B組：出血量45～70 mL；C組：出血量≥70 mL；

1.3標(biāo)本采集臨床病例腦組織標(biāo)本在手術(shù)中經(jīng)皮層“造瘺"清除血腫時(shí)，將手術(shù)入路通道中鄰近血腫約0.5 cm范圍內(nèi)的腦組織保存下來，作為病例組標(biāo)本。將部分超早期手術(shù)組患者皮層“造瘺”起始處，即遠(yuǎn)隔血腫部位腦組織保留下來，作為對(duì)照組標(biāo)本。標(biāo)本立即放入4%多聚甲醛固定溶液固定，遂行石臘包埋、切片。

石蠟切片：組織脫水、滲透與包埋：①脫水：70%乙醇(60 min)→85%乙醇(60 min)→95%乙醇(60 min)→100%乙醇(60 min)→100%乙醇(60 min)。②透明：二甲苯Ⅰ(30 min)→二甲苯Ⅱ(30 min)。③滲透：石蠟Ⅰ(60 min)→石蠟Ⅱ(60 min),62 ℃烘箱中。④包埋：將組織放入盛有石蠟的模具中，擺好位置，于石蠟包埋機(jī)的冷臺(tái)上冷卻。

切片和貼片：將包埋好的組織塊于切片機(jī)中約5 μm，放于漂片機(jī)中展開，再將切片撈于多聚賴氨酸附膜載玻片上，編號(hào)，70 ℃干烤1 h，貼片后60 ℃烤5 h。

1.4C反應(yīng)蛋白免疫組化方法檢測(cè)步驟(1)熱修復(fù)：將載玻片放入容器中，加10 mM的枸櫞酸鈉緩沖液，pH 6.0；(2)標(biāo)本用正常封閉血清封閉，PBS沖洗3次，每次5 min。(3)與一抗孵育60 min。(4)與熒光標(biāo)記的二抗一起溫浴45 min(用于免疫組化的二抗)。(5)用液態(tài)封固劑或90%甘油PBS液封片。(6)用適當(dāng)?shù)臑V鏡在熒光顯微鏡下閱片。陰性對(duì)照：每組各抽取切片2張用抗體稀釋液代替一抗，其余步驟同上。

1.5腦組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟、水合→細(xì)胞通透→加TUNEL反應(yīng)液→加converter-POD→與底物DAB反應(yīng)顯色→光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)并拍照。

具體操作步驟：(1)用二甲苯浸洗2次，每次5 min；(2)用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3 min；(3)PBS漂洗2次；(4)用Proteinase K工作液處理組織15～30 min在21～37 ℃(溫度、時(shí)間、濃度均需摸索)或加細(xì)胞通透液8 min；(5)PBS漂洗2次；(6)制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50 μL TdT+450 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻；而陰性對(duì)照組僅加50 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽(yáng)性對(duì)照組先加入100 μL DNase 1，反應(yīng)在15～25 ℃下10 min，后面步驟同處理組。(7)玻片干后，加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液(陰性對(duì)照組僅加50 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液)于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37 ℃×1 h。(8)PBS漂洗3次；(9)可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞(激發(fā)光波長(zhǎng)為450～500 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為515～565 nm)；(10)玻片干后加50 μL converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37 ℃×30 min。(11)PBS漂洗3次；(12)在組織處加50～100 μL DAB底物，反應(yīng)15～25 ℃×10 min；(13)PBS漂洗3次；(14)拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。(15)加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞(共200～500個(gè)細(xì)胞)并拍照?？山Y(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征綜合判斷(未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理選用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，雙變量相關(guān)分析采用計(jì)算相關(guān)系數(shù)，查r界值表確定P值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞凋亡情況見圖1。腦出血后6 h經(jīng)TUNEL檢測(cè)對(duì)照組偶見或未見凋亡細(xì)胞；而實(shí)驗(yàn)組血腫周圍有凋亡細(xì)胞明顯高于對(duì)照組，出血量最大組明顯高于出血量較小組，不同出血量組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=439.573,P<0.01)。

2.2血腫周圍C反應(yīng)蛋白表達(dá)情況見圖2。對(duì)照組各視野間有少量C反應(yīng)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞；血腫量愈大，血腫周圍C表達(dá)愈顯著；且血腫周圍CRP表達(dá)明顯，遠(yuǎn)離血腫腦組織表達(dá)降低，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=327.99,P<0.01)。

2.3CRP蛋白表達(dá)與凋亡的關(guān)系對(duì)CRP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和凋亡陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明二者有相關(guān)性(r=0.99,P<0.01)。見表1。

表1　不同組別TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞

注：不同出血量組陽(yáng)性細(xì)胞比較，P<0.01

a　　　　　　　　　　b　　　　　　　　　　　c　　　　　　　　　　a　　　　　　　　　　b圖1 a:出血量≥70 mL組血腫周圍TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況，可見凋亡細(xì)胞數(shù)較多，左側(cè)靠近血腫側(cè)，距離血腫側(cè)愈遠(yuǎn)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)愈少　b:出血量30～45 mL組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況，可見凋亡細(xì)胞數(shù)較前組有減少，下側(cè)靠近血腫側(cè)　c:對(duì)照組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況　圖2 a：出血量30～45 mL組血腫周圍C反應(yīng)蛋白表達(dá)情況，可見少量C反應(yīng)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，右側(cè)靠近血腫側(cè)　b：出血量≥70 mL組血腫周圍C反應(yīng)蛋白表達(dá)情況，可見大量C反應(yīng)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，右側(cè)靠近血腫側(cè)，可見距離血腫愈遠(yuǎn)，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)愈少

3討論

高血壓腦出血發(fā)病率、致殘率、致死率、復(fù)發(fā)率高，無(wú)論國(guó)內(nèi)或國(guó)外，仍缺乏特別有效的改善預(yù)后的治療方法，帶來沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而探討腦出血的病理生理機(jī)制，從而尋求有效的治療方案成為目前研究的熱點(diǎn)。近年來，研究腦出血的病理生理機(jī)制主要包括：出血血腫壓迫周圍腦組織及繼發(fā)性缺血[11]，血腫及分解殘物毒性作用[12-13]，炎癥反應(yīng)[14-15]等，而關(guān)于腦出血血腫周圍的炎癥反應(yīng)研究越來越多。CRP是炎癥、感染、組織損傷、壞死和惡性腫瘤的一個(gè)重要標(biāo)志。研究認(rèn)為，超敏CRP>3 mg/L時(shí)，心、腦血管事件的發(fā)生危險(xiǎn)較高，其在冠心病、腦梗死、周圍血管栓塞等疾病診斷和預(yù)測(cè)中發(fā)揮越來越重要的作用，甚至被認(rèn)為是心、腦血管病危險(xiǎn)評(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)。而CRP同樣可以預(yù)測(cè)腦出血患者的預(yù)后，與腦出血患者的致殘率及病死率密切相關(guān)，并以此為治療腦出血提供新的策略。以往對(duì)腦出血后血清CRP的研究較多，主要集中在血清CRP的檢測(cè)及變化過程，從而研究血清CRP表達(dá)與疾病發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。以往研究證實(shí)血清CRP主要有肝臟釋放分泌，且在炎癥介質(zhì)尤其IL-6介導(dǎo)下表達(dá)增多，腦出血后血清CRP明顯升高主要在發(fā)病后24 h左右，在超早期6 h內(nèi)甚至在正常范圍內(nèi)，而以往對(duì)腦出血后血腫周圍CRP的研究極少。CRP僅是腦出血后的全身應(yīng)激反應(yīng)，還是直接參與腦出血的病理生理機(jī)制需進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血血腫周圍腦組織大量表達(dá)CRP，且血腫量愈大，CRP表達(dá)愈顯著；CRP表達(dá)與凋亡細(xì)胞表達(dá)有相關(guān)性，提示CRP可能參與腦出血后血腫周圍腦細(xì)胞凋亡過程；在腦出血超早期，血腫周圍已有CRP大量表達(dá)，推測(cè)除肝臟可以釋放CRP外，神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞亦能分泌CRP，這在以往研究中鮮有報(bào)道。腦出血不僅引起腦組織局部炎癥反應(yīng)，也會(huì)導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)應(yīng)激。腦出血致?lián)p傷腦組織釋放大量炎癥介質(zhì)，如IL-6。IL-6可誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生急性反應(yīng)蛋白，主要是血清CRP的升高較為明顯。而本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血血腫周圍有大量CRP表達(dá)，且遠(yuǎn)離血腫，其表達(dá)減少。由此認(rèn)為，腦出血后血清CRP表達(dá)增加，主要有肝臟產(chǎn)生釋放于循環(huán)系統(tǒng)中，血清CRP參與全身系統(tǒng)器官損傷過程，同時(shí)血腫周圍大量表達(dá)CRP，據(jù)此推測(cè)血腫周圍腦組織神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞可能表達(dá)分泌CRP，這與Di Napoli等[16]的研究結(jié)果一致，并且血腫周圍局部CRP參與腦損傷過程，如細(xì)胞凋亡過程、水腫反應(yīng)、血腦屏障破壞等繼發(fā)損傷。以往研究證實(shí)，CRP通過一些信號(hào)途徑介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致局部血流障礙，從而形成類似腦梗死半暗帶的低血流量區(qū)域[17]，且最近研究[18]也顯示CRP通過直接誘導(dǎo)P53介導(dǎo)凋亡，本研究發(fā)現(xiàn)血腫周圍腦組織高表達(dá)CRP區(qū)域凋亡細(xì)胞亦較豐富，提示CRP可能通過阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖導(dǎo)致腦組織缺血而能量匱乏或直接通過P53基因參與出血后血腫周圍細(xì)胞的凋亡過程，甚至加重血腫周圍膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)參與腦出血的病理生理機(jī)制，由此阻斷CRP或成為治療腦出血的新策略，為下一步研究提供思路。

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(收稿2015-08-13)

【中圖分類號(hào)】R743.34

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-5110(2016)06-0033-03