10 kDa以上幽門螺桿菌感染相關(guān)尿液差異表達(dá)蛋白的高效液相色譜-質(zhì)譜分析*

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10 kDa以上幽門螺桿菌感染相關(guān)尿液差異表達(dá)蛋白的高效液相色譜-質(zhì)譜分析*

張慧芳#孟凡亮何利華張建中肖迪&

中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(102206)

感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心

背景：除消化性潰瘍和胃癌外，幽門螺桿菌(Hp)感染尚與多種胃腸外疾病密切相關(guān)。目前臨床上尚無Hp感染的體液檢測方法。目的：鑒定相對(duì)分子質(zhì)量在10 kDa以上的Hp感染相關(guān)尿液差異表達(dá)蛋白，為Hp感染的體液診斷提供潛在生物學(xué)標(biāo)記物。方法：志愿者留取晨起中段尿，并行13C-尿素呼氣試驗(yàn)以明確Hp感染情況。Hp陰性和陽性尿液樣本各取15例，分別混合后提取蛋白，以高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)分離蛋白、采集數(shù)據(jù)，行l(wèi)abel-free定量分析。另取Hp陰性尿液樣本15例和陽性尿液樣本11例，對(duì)差異表達(dá)分析結(jié)果進(jìn)行全掃描驗(yàn)證。應(yīng)用IPA軟件對(duì)鑒定出的尿液差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果：Label-free定量分析共檢測到475個(gè)尿液蛋白，并確定其中42個(gè)為差異表達(dá)蛋白。經(jīng)外部掃描驗(yàn)證，最終鑒定出11個(gè)顯著上調(diào)的差異表達(dá)蛋白。生物信息學(xué)分析揭示了這些差異表達(dá)蛋白的分子功能、參與的生物學(xué)通路、相關(guān)疾病等信息。結(jié)論：鑒定出的11個(gè)10 kDa以上尿液差異表達(dá)蛋白有望成為診斷Hp感染的生物學(xué)標(biāo)記物，并可為Hp感染與胃腸外疾病的相關(guān)性研究提供分子水平的證據(jù)。

關(guān)鍵詞幽門螺桿菌；尿；蛋白質(zhì)組學(xué)；生物學(xué)標(biāo)記；診斷

High Performance Liquid Chromatogram-Mass Spectrometry forHelicobacterpyloriInfection-associated Differentially Expressed Proteins in Urine with Relative Molecular Mass More than 10 kDa

ZHANGHuifang,MENGFanliang,HELihua,ZHANGJianzhong,XIAODi.

StateKeyLaboratoryofInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing(102206);CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,Hangzhou

Correspondence to: XIAO Di, Email: xiaodi@icdc.cn

Background:Helicobacterpylori(Hp) is an important pathogen for peptic ulcer and gastric cancer, and is reportedly associated with a variety of extragastrointestinal diseases. However, there is no body fluid detection technique for Hp infection in clinical practice. Aims: To identify Hp infection-associated differentially expressed proteins in urine with relative molecular mass more than 10 kDa and provide potential biomarkers for diagnosis of Hp infection through body fluid detection. Methods: Midstream urine was collected from volunteers in the morning, and13C-urea breath test was performed to determine Hp infection. Each of 15 Hp-negative and 15 Hp-positive urine samples were mixed respectively for protein extraction. Spectra data were acquired by high performance liquid chromatogram-mass spectrometry, and label-free technology was used for relative quantitative analysis. The other 26 urine samples (15 Hp-negative and 11 Hp-positive) were used for validation by full scan. IPA software was employed for bioinformatics analysis. Results: A total of 475 urinary proteins were detected by label-free quantitative analysis and 42 differentially expressed proteins were identified. Finally, 11 significantly up-regulated differentially expressed proteins were confirmed by external scanning validation. Bioinformatics analysis revealed the molecular functions, biological pathways, and related diseases of these differentially expressed proteins. Conclusions: These 11 differentially expressed proteins more than 10 kDa identified in urine might be potential biomarkers for diagnosis of Hp infection and provide molecular evidence for the correlation of Hp infection with extragastrointestinal diseases.

Key wordsHelicobacterpylori;Urine;Proteomics;Biological Markers;Diagnosis

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)是一種革蘭陰性微需氧彎曲狀桿菌，主要寄居于人體胃部，其為目前惟一明確對(duì)人類有致癌作用的細(xì)菌性病原微生物，已被WHO正式列為Ⅰ類致癌原[1]。近30年來的研究顯示，Hp感染不僅可導(dǎo)致胃腸道疾病，而且與心血管疾病[2]、免疫系統(tǒng)疾病[3]、糖尿病[4]、腎病[5]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[6]、血液系統(tǒng)疾病[7]、肝臟疾病[8]、皮膚疾病[9]等多種胃腸外疾病密切相關(guān)。目前臨床上常用的非侵入性Hp感染檢測方法主要有13C-尿素呼氣試驗(yàn)(13C-UBT)、Hp糞便抗原檢測(HpSA)等，13C-UBT敏感性高，但價(jià)格相對(duì)較高，HpSA則存在假陰性率過高的缺點(diǎn)；而侵入性的血清學(xué)Hp IgG檢測只能判斷既往感染，無法確定現(xiàn)癥感染。

尿液成分較血液簡單，易于獲得且穩(wěn)定性好，多種疾病相關(guān)代謝物均在尿液中有所體現(xiàn)，因此尿液蛋白質(zhì)組學(xué)分析或可反映疾病早期的病理變化[10]，并成為尋找新的非侵入性疾病診斷標(biāo)記物的理想途徑[11-12]。本課題組前期研究[13]采用弱陽離子磁珠富集、高效液相色譜-質(zhì)譜分析(HPLC-MS)分離鑒定、ClinProt系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集和分析等一系列方法篩選出Hp感染患者尿液中相對(duì)分子質(zhì)量在1～10 kDa(1 Da=0.992 1 u)范圍內(nèi)的多肽，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)潛在的Hp感染相關(guān)尿液生物學(xué)標(biāo)記物。本研究擬采用HPLC-MS和非標(biāo)記(label-free)定量分析技術(shù)對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在10 kDa以上的Hp感染相關(guān)尿液蛋白進(jìn)行全面分析并確定Hp陽性與陰性組間差異表達(dá)蛋白，以期為Hp感染的體液診斷提供潛在生物學(xué)標(biāo)記物，同時(shí)為探索Hp感染與胃腸外疾病的相關(guān)性提供分子水平的線索。

材料與方法

一、研究對(duì)象和尿液樣本采集

研究對(duì)象為在校研究生志愿者，采樣時(shí)間為2014年11月20日。為避免研究對(duì)象自身因素對(duì)尿液樣本的影響，選擇志愿者時(shí)剔除有糖尿病、腎病、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病史以及近一個(gè)月內(nèi)使用過抗菌藥物者，女性尿液樣本采集時(shí)避開生理期。共入選志愿者60例，其中男26例，女34例，年齡20～35歲，平均23歲。入選者自愿完整填寫調(diào)查表，按要求用統(tǒng)一提供的樣品管留取晨起中段尿50 mL，并空腹行13C-UBT以明確Hp感染情況。尿液樣本的采集和使用通過中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所倫理委員會(huì)審核，入選志愿者均簽署知情同意書。

二、樣本制備

尿液樣本采集后4 ℃保存，2 h內(nèi)12 000×g離心10 min，取上清液分裝備用。選擇Hp陰性尿液樣本30例和Hp陽性尿液樣本26例，各取15例用于差異表達(dá)蛋白分析，其余15例Hp陰性樣本和11例Hp陽性樣本用于差異表達(dá)蛋白驗(yàn)證。

用于差異表達(dá)蛋白分析的樣本每例取50 μL，按Hp陰性和陽性分別混合成兩個(gè)樣本，采用丙酮沉淀法提取蛋白。主要步驟：以10 kDa超濾管超濾濃縮尿樣，加入10倍體積-20 ℃含0.2%二硫蘇糖醇(DTT)、20%三氯乙酸(TCA)的丙酮溶液，邊加邊攪拌，-20 ℃冰箱過夜；12 000×g4 ℃離心 15 min，棄上清液，水化液溶解沉淀，以25 mmol/L碳酸氫銨進(jìn)行溶解液置換。使用Direct Detect紅外微定量分析儀對(duì)蛋白樣本進(jìn)行定量，Hp陰性和陽性尿液蛋白樣本各取100 μg，按1∶50的比例加入胰蛋白酶，37 ℃ 酶解過夜。用于驗(yàn)證的樣本采用同樣方法提取蛋白和酶解。

三、Label-free定量分析

1. 液相蛋白樣本分離：每一尿液蛋白樣本取3 μL 進(jìn)樣至納升級(jí)EASY-nLC 1000液相色譜儀(Thermo Fisher Scientific Inc.)進(jìn)行分離。預(yù)柱：PepMap 100，nanoViper C18，100 ?，5 μm，100 μm×2 cm；分析柱：PepMap 100，nanoViper C18，100 ?，3 μm，75 μm×25 cm。液相梯度設(shè)置：A相(99.9% H2O，0.1%甲酸)2 min，5%B相(99.9%乙腈，0.1% 甲酸)45 min，28%B相5 min，80%B相 8 min，流速均為 300 nL/min。

2. 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集：使用與液相色譜儀串聯(lián)的Q ExactiveTMPlus組合型四極桿OrbitrapTM質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific Inc.)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。以可加熱電噴霧離子源(HESI)陽離子模式，F(xiàn)ull MS/dd-MS2(TopN)串聯(lián)模式采集數(shù)據(jù)。全掃描一級(jí)譜圖范圍m/z 350～1 600，分辨率70 000，最大積分時(shí)間250 ms，離子目標(biāo)值3×106個(gè)。而后選擇10個(gè)最強(qiáng)母離子進(jìn)行二級(jí)數(shù)據(jù)采集，高能碰撞解離，分辨率17 500，最大積分時(shí)間120 ms，離子目標(biāo)值2×105個(gè)。應(yīng)用XcaliburTM軟件(Version 3.0.63，Thermo Fisher Scientific Inc.)記錄譜圖。

3. 數(shù)據(jù)分析：應(yīng)用Proteome DiscovererTM軟件(Version 1.4，Thermo Fisher Scientific Inc.)搜索Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫。選擇兩個(gè)酶解漏切位點(diǎn)；半胱氨酸脲甲基化(carbamidomethyl)為固定修飾，蛋氨酸氧化(oxidation)為可變修飾；肽質(zhì)量偏差為10 ppm，離子片段偏差為0.02 Da。以反轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)庫去除假陽性鑒定。應(yīng)用SIEVETM差異表達(dá)分析軟件(Version 2.1，Thermo Fisher Scientific Inc.)對(duì)所有檢測到的蛋白進(jìn)行定量分析，定量前對(duì)所有樣本原始譜圖強(qiáng)度進(jìn)行總離子流強(qiáng)度歸一化處理。表達(dá)量變化超過兩倍、方差分析P<0.05、重復(fù)數(shù)據(jù)原始質(zhì)譜強(qiáng)度變異系數(shù)在30%以內(nèi)且重復(fù)過程中未缺失任一數(shù)值的蛋白定義為差異表達(dá)蛋白。

四、差異表達(dá)蛋白驗(yàn)證

使用Q ExactiveTMPlus組合型四極桿OrbitrapTM質(zhì)譜儀對(duì)26例驗(yàn)證用尿液蛋白樣本進(jìn)行全掃描，Proteome DiscovererTM軟件進(jìn)行蛋白檢索確認(rèn)，與差異表達(dá)分析結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，剔除假陽性結(jié)果。

五、生物信息學(xué)分析

應(yīng)用IPA軟件(Ingenuity Pathway Analysis Soft-ware)對(duì)鑒定出的尿液差異表達(dá)蛋白進(jìn)行包括分子功能、參與的生物學(xué)通路、相互作用網(wǎng)絡(luò)、與疾病的相關(guān)性等在內(nèi)的生物信息學(xué)分析。

結(jié)果

一、差異表達(dá)蛋白鑒定

通過HPLC-MS/MS分析，選取95% CI范圍內(nèi)的肽段進(jìn)行鑒定。Label-free定量分析共檢測到475個(gè)尿液蛋白，并確定其中42個(gè)為差異表達(dá)蛋白(表1)。經(jīng)26例尿液蛋白樣本的外部掃描驗(yàn)證，最終鑒定出11個(gè)顯著上調(diào)的差異表達(dá)蛋白，分別為木糖基轉(zhuǎn)移酶1(xylosyltransferase 1)、肽聚糖識(shí)別蛋白1(peptidoglycan recognition protein 1)、α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(alpha-N-acetylglucosaminidase)、神經(jīng)分泌蛋白VGF(neurosecretory protein VGF)、凝溶膠蛋白(gelsolin)、原鈣黏蛋白16(protocadherin-16)、凝聚素(clusterin)、內(nèi)皮蛋白C受體(endothelial protein C receptor)、細(xì)胞黏附分子4(cell adhesion molecule 4)、生物素酶(biotinidase)和6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(6-phosphogluconolactonase)。

二、差異表達(dá)蛋白生物信息學(xué)分析

通過IPA軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，揭示了11個(gè)差異表達(dá)蛋白的分子功能、參與的生物學(xué)通路、相關(guān)疾病、體液分布、是否可作為疾病檢測生物學(xué)標(biāo)記物等信息(表2)及其參與的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(圖1)。

討論

Hp感染是人類最常見的細(xì)菌感染之一，其與消化性潰瘍和胃癌之間的密切聯(lián)系已被公認(rèn)。近年來，研究者對(duì)Hp感染與胃腸外疾病的相關(guān)性亦作了廣泛的探討，發(fā)現(xiàn)Hp感染在一定意義上可能是一種“全身性”疾病。研究顯示Hp感染與心血管疾病有關(guān)[2]，高血清Hp IgG水平與高血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平密切相關(guān)，可能在冠心病動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。Hp感染與糖尿病[4]、不明原因缺鐵性貧血[7，15]、自身免疫性甲狀腺疾病[16]、肝纖維化和肝硬化[8]、慢性阻塞性肺病[17]、精子活力降低[18]等疾病之間的相關(guān)性亦已得到闡述。Hp感染者存在Hp相關(guān)免疫紊亂，表現(xiàn)為血清類風(fēng)濕因子、抗核抗體水平增高等，可能與自身免疫性疾病的發(fā)生和惡化有關(guān)[19]；根除Hp對(duì)特發(fā)性血小板減少性紫癜患者的輕度血小板減少有一定治療作用[20]，能改善急性特發(fā)性中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變患者的視網(wǎng)膜中心敏感性[21]，并可能使肝硬化輕微肝性腦病患者獲益[22]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)Hp感染可能增加結(jié)直腸腫瘤[23]、胰腺癌[24]、肺癌[25]等腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。尋找Hp感染診斷標(biāo)記物對(duì)上述疾病的預(yù)防和診治具有重要臨床意義。目前臨床上常用的Hp感染檢測方法有13C-UBT或14C-UBT、血清Hp IgG、HpSA檢測等，但尚無相關(guān)體液檢測方法。

尿液可通過非侵入性途徑大量獲得，用于分析和評(píng)估具有可重復(fù)性，是一種理想的生物學(xué)標(biāo)記物分析介質(zhì)，且因能從同一個(gè)體重復(fù)采樣而有利于縱向研究；此外，尿液中的蛋白和多肽高度可溶且性狀穩(wěn)定，在采集后數(shù)小時(shí)內(nèi)不會(huì)發(fā)生明顯降解[26]，便于樣本制備和檢測。本研究通過HPLC-MS和label-free定量分析鑒定出11個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量在10 kDa 以上的Hp感染相關(guān)尿液蛋白，這些蛋白在Hp感染者尿液中的含量顯著增加，后續(xù)通過免疫學(xué)方法確定相關(guān)閾值后，有望成為Hp感染尿液診斷的生物學(xué)標(biāo)記物。進(jìn)一步對(duì)這些尿液蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示生物素酶(P43251)可能影響機(jī)體營養(yǎng)狀態(tài)和體質(zhì)量；凝聚素(P10909)可調(diào)節(jié)ATP酶活性，并能與蛋白結(jié)合，參與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用信號(hào)、FXR/RXR激活、LXR/RXR激活等信號(hào)通路，與阿爾茨海默病、結(jié)腸癌、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、動(dòng)脈硬化、肝癌、糖尿病、心血管疾病等相關(guān)；凝溶膠蛋白(P06396)可與肌動(dòng)蛋白、鈣離子、肌球蛋白以及蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合，參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號(hào)、生殖細(xì)胞睪丸支持細(xì)胞連接信號(hào)、破骨細(xì)胞RANK信號(hào)以及成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用等信號(hào)通路，與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、皮膚病、結(jié)腸癌等相關(guān)；α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(P54802)與體質(zhì)量減輕、糖尿病、肝纖維化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等相關(guān)；內(nèi)皮蛋白C受體(Q9UNN8)能與蛋白C末端結(jié)合并具有受體活性，參與介導(dǎo)血小板減少癥、血栓性疾病、心肌梗死等的發(fā)生。對(duì)上述Hp感染相關(guān)尿液差異表達(dá)蛋白分子功能、相關(guān)信號(hào)通路以及與疾病相關(guān)性的分析，從另一個(gè)角度印證了既往文獻(xiàn)報(bào)道的Hp感染與胃腸外疾病的相關(guān)性。

表1　Label-free定量分析差異表達(dá)蛋白及其驗(yàn)證結(jié)果

a：驗(yàn)證匹配實(shí)際數(shù)目；b：驗(yàn)證匹配理論數(shù)目；*差異表達(dá)蛋白；▲本實(shí)驗(yàn)使用超濾管截留10 kDa以上的蛋白，屬于物理意義上的截留，此蛋白可能是以多聚體形式存在而被截留；#陽性樣本表達(dá)量為0

表2　11個(gè)尿液差異表達(dá)蛋白生物信息學(xué)分析

PGLS：6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶；PROCR：內(nèi)皮蛋白C受體；GSN：凝溶膠蛋白；CADM4：細(xì)胞黏附分子4；NAGLU：α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶；CLU：凝聚素；BTD：生物素酶；PGLYRP1：肽聚糖識(shí)別蛋白1；VGF：神經(jīng)分泌蛋白VGF；XYLT1：木糖基轉(zhuǎn)移酶1；DCHS1：原鈣黏蛋白16

圖111個(gè)尿液差異表達(dá)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)

綜上所述，本研究通過對(duì)Hp感染和非感染志愿者尿液中相對(duì)分子質(zhì)量在10 kDa以上的蛋白行HPLC-MS和label-free定量分析，鑒定出11個(gè)差異表達(dá)蛋白，這些尿液蛋白有望成為診斷Hp感染的生物學(xué)標(biāo)記物，并可為Hp感染與心血管疾病、阿爾茨海默病、糖尿病、免疫系統(tǒng)疾病等胃腸外疾病的相關(guān)性研究提供分子水平的證據(jù)。

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(2015-09-09收稿；2015-09-17修回)

*基金項(xiàng)目：傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主項(xiàng)目(2014SKLID102)；中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所科研課題

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.03.003

#Email: zhanghuifang@icdc.cn

&本文通信作者，Email: xiaodi@icdc.cn