氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測香菇中香菇素的含量

周佳欣，白 冰，周昌艷*，邵 毅

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 201403）

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測香菇中香菇素的含量

周佳欣，白 冰，周昌艷*，邵 毅

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 201403）

建立測定香菇中香菇素的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法。以乙腈提取樣品，F(xiàn)lorisil柱凈化，使用氣相色譜-質(zhì)譜儀以選擇離子監(jiān)測模式進(jìn)行分析測定。在設(shè)定色譜條件下，香菇素在1.0～20.0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好；添加10.0、20.0、30.0 mg/kg香菇素溶液的平均回收率在86.61%～98.48%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.92%～4.28%之間，檢出限為0.10 mg/kg，定量限為0.25 mg/kg。本方法操作方便、重復(fù)性良好，為香菇中香菇素的定性和定量檢測提供可靠的分析方法。

固相萃取；氣相色譜-質(zhì)譜法；香菇素

香菇不僅具有較高的營養(yǎng)和保健價(jià)值，還具有獨(dú)特的風(fēng)味，深受消費(fèi)者青睞[1-2]。已經(jīng)證實(shí)香菇鮮美之味主要來源于其核酸分解酶催化底物核酸生成的核苷酸物質(zhì)[3-5]，而香菇的風(fēng)味取決于其中含有的揮發(fā)性芳香物質(zhì)[6]。含硫化合物通常能影響菇體整體的芳香，是香菇中最重要的香味來源[7-11]。香菇素化學(xué)名稱為l,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷，是一種具有強(qiáng)烈的香菇特征風(fēng)味的含硫雜環(huán)化合物，是由前體物質(zhì)香菇酸在谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶的作用下產(chǎn)生二硫雜環(huán)丙烷中間體聚合而成的[10,12]，1966年被發(fā)現(xiàn)并命名為香菇素、香菇精[13-14]?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 香菇素化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of 1′2′3′5′6-pentathiepane

作為香菇中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的重要成分之一，香菇素的檢測技術(shù)研究受到廣泛關(guān)注。國內(nèi)外已有學(xué)者運(yùn)用水蒸氣蒸餾法[15]、溶劑萃取法、同時(shí)蒸餾萃取法[16]、固相微萃取法[17]、超臨界萃取法[18]對香氣成分進(jìn)行萃取，并應(yīng)用色譜、質(zhì)譜及嗅聞技術(shù)對香菇的特征風(fēng)味作了研究，鑒定了組成香菇特征風(fēng)味的化合物[19-24]。但對于香菇素的定性、定量檢測，國內(nèi)外并沒有檢測標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)對香菇中香菇素的含量檢測方法進(jìn)行研究，以香菇鮮樣和香菇干樣為研究對象，運(yùn)用固相萃取、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對香菇的特征風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析測定，旨在確定一種香菇中香菇素的檢測分析方法，為香菇質(zhì)量評(píng)價(jià)、風(fēng)味改良、蘑菇風(fēng)味料開發(fā)提供技術(shù)參數(shù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)用鮮香菇和干香菇由上海市周邊地區(qū)某食用菌生產(chǎn)基地提供。鮮樣：分取約500 g，切碎，用組織搗碎機(jī)勻漿后，置于密閉容器中。干樣：分取約200 g，機(jī)械粉碎，過380 μm篩，混勻置于密閉容器中。

乙腈、正己烷、丙酮（均為色譜純） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；弗羅里硅土柱（Florisil：3 mL，500 mg） 美國Agilent公司；香菇素標(biāo)準(zhǔn)品 中國Langchem公司。香菇素標(biāo)準(zhǔn)品用丙酮配制成質(zhì)量濃度1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，梯度稀釋為1、2、5、10、20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 儀器與設(shè)備

6890-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（帶有分流/不分流進(jìn)樣口及電子電離源） 美國Agilent公司； HR2096組織搗碎機(jī) 荷蘭Philips公司；HY-5回旋式振蕩器常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠；Visiprer DL固相萃取裝置 美國Supelco公司；QGC-361氮吹儀 上海泉島公司。

1.3 方法

1.3.1 提取

稱取香菇鮮樣5.00 g，香菇干樣0.50 g需加入4.5 mL水混勻，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈，在回旋振蕩器上以150 r/min轉(zhuǎn)速振搖45 min后過濾，將濾液收集至加入4 g氯化鈉的具塞量筒中，劇烈振蕩1 min，靜置15 min以上待分層。吸取2 mL上層有機(jī)相于燒杯中，50 ℃氮吹至近干，加入2 mL正己烷溶液溶解，待凈化。

1.3.2 凈化

參考NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》的凈化方法并優(yōu)化[25]，將Florisil柱用3 mL正己烷-丙酮（9∶1，V/V）溶液、2 mL正己烷溶液依次淋洗，當(dāng)溶劑液面到達(dá)吸附層表面時(shí)，立即倒入上述待凈化溶液，用試管接收洗脫液，用3 mL正己烷-丙酮溶液重復(fù)沖洗2 次，將裝有洗脫液的試管置于氮吹儀上，50 ℃氮吹至近干，用2 mL正己烷溶液定容，在旋渦混合器上混勻，移入進(jìn)樣瓶中，待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：HP-5MS毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）；升溫程序：初始溫度50 ℃保持1 min，以10 ℃/min升溫至280 ℃保持5 min，后運(yùn)行1 min；載氣（He）流速1.0mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；不分流進(jìn)樣。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度220 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～550；選擇離子監(jiān)測（selected ion monitoring，SIM）方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜分析條件的優(yōu)化

圖2 GC-MS 全掃描（A）、SIM（B）模式檢測香菇素總離子流圖Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of 1′2′3′5′6-pentathiepane standard

圖3 鮮香菇（A）、干香菇（B）的GC-MS選擇離子檢測圖Fig.3 GC-MS total ion chromatograms of 1′2′3′5′6-pentathiepane in fresh and dry Lentinula edodes

用弱極性HP-5MS毛細(xì)管柱，采用全掃描方式在m/z 50～550范圍內(nèi)分析香菇素標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后根據(jù)保留時(shí)間和質(zhì)譜圖，確定其在SIM測定方式中的結(jié)束采集時(shí)間和監(jiān)測離子。采用全掃描方式得到香菇素含量為1.0 mg/kg的總離子流圖，如圖2A所示，出峰時(shí)間為15.305 min。根據(jù)全掃描模式條件下的離子碎片豐度，選擇m/z 142作為香菇素的定量離子，選擇m/z 78、124、188作為香菇素的定性離子。以SIM模式得到香菇素含量為1.0 mg/kg的總離子流圖，如圖2B所示。以SIM模式檢測干香菇和鮮香菇的樣品，分別得到樣品的選擇離子掃描圖，如圖3所示。可以看到，在本實(shí)驗(yàn)條件下，香菇素得到了很好地分離，沒有受到干擾，符合檢測的方法要求。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

根據(jù)香菇素在日常檢測中的含量范圍，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20 μg/mL，其線性方程如圖4所示。結(jié)果表明，香菇素在1～20 μg/mL范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.992 8。

圖4 香菇素質(zhì)量濃度1～20 120μg/mL范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of 1′2′3′5′6-pentathiepane

從測定標(biāo)準(zhǔn)溶液（RSN＜20）的質(zhì)量濃度得到的色譜圖中，以3 倍信噪比（RSN=3）為檢出限，以10 倍以上信噪比（RSN≥10）為定量限，計(jì)算得到香菇素的檢出限為0.10 mg/kg，定量限為0.25 mg/kg。將實(shí)際樣品稀釋至該質(zhì)量濃度進(jìn)行相應(yīng)的計(jì)算，結(jié)果顯示，香菇素質(zhì)量濃度為0.10 μg/mL時(shí)，可以完全響應(yīng)，香菇素質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL時(shí)，可準(zhǔn)確計(jì)算其含量。

2.3 方法的準(zhǔn)確度

選取香菇鮮樣、香菇干樣作為空白基質(zhì)做添加回收實(shí)驗(yàn)，在10.0、20.0 mg/kg和30.0 mg/kg 3 個(gè)水平進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)（n=3）。結(jié)果如表1所示，香菇素的平均回收率在86.61%～98.48%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在2.92%～4.28%之間，證實(shí)該方法的準(zhǔn)確度較高，滿足測定要求。

表1 香菇鮮樣、香菇干樣的加標(biāo)回收率和RRSSDDTable1 Spiked recovery and RSD of 1′2′3′5′6-pentathiepane in fresh and ddrryy Lentinula edooddeess

2.4 方法的精密度

選取香菇鮮樣、香菇干樣作為樣品，按照上述方法分別平行測定5 次，求平均值和RSD，RSD分別為4.13%和3.60%，結(jié)果表明該方法精密度較高（表2）。

表2 香菇鮮樣、香菇干樣的香菇素精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Precision (expressed as RSD of the method for replicate determinations of fresh andd ddrryy Lentinula edodes

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)針對香菇中香菇素建立一種固相萃取、GC-MS-SIM檢測方法。利用乙腈良好的提取能力，F(xiàn)lorisil層析柱的凈化效果，達(dá)到了操作簡單、處理快速、節(jié)省溶劑的目的。在GC-MS-SIM模式下，方法檢出限為0.10 mg/kg，定量限為0.25 mg/kg，添加10.0、20.0、30.0 mg/kg 3 個(gè)水平條件下的平均回收率在86.61%～98.48%之間，RSD在2.92%～4.28%之間。采用固相萃取進(jìn)行樣品的前處理方 法耗時(shí)短、選擇性好、基質(zhì)干擾小，而GC-MS-SIM方法準(zhǔn)確度和精密度高，滿足了檢測的要求。

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Determination of 1′2′3′5′6-Pentathiepane in Lentinula edodes by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

ZHOU Jiaxin BAI Bing ZHOU Changyan*′SHAO Yi
(Institute for Agri-Food Standards and Testing Technology Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai 201403′China)

A simple and rapid method was developed for determining 1,2,3,5,6-pentathiepane in Lentinula edodes by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Samples were extracted by acetonitrile, purifi ed by solid-phase fl orisil column and detected by GC-MS under selective ion monitoring mode. Good linear correlation was obtained within the concentration range of 1,2,3,5,6-pentathiepane between 1.0 and 20.0 μg/mL, under the chromatographic conditions used in this study. The average recovery rates of 1,2,3,5,6-pentathiepane at spiked concentrations of 10.0, 20.0 and 30.0 mg/kg were between 86.61% and 98.48%, with relative standard deviation of 2.92%?4.28%. The detection limit and quantifi cation limit were 0.10 and 0.25 mg/kg, respectively. This method has the advantages of convenient operation and good reproducibility, which is suitable for determining 1,2,3,5,6-pentathiepane in Lentinula edodes.

solid-phase extraction; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); 1,2,3,5,6-pentathiepane

O657

A

1002-6630（2015）06-0151-04

10.7506/spkx1002-6630-201506028

2014-07-08

2014年國家食用菌質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目（GJFP2014005）；上海市市級(jí)農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長計(jì)劃課題（滬農(nóng)青字（2014）第1-7號(hào)）

周佳欣（1982—），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留分析、食用菌風(fēng)味物質(zhì)。E-mail：zhou_jx@126.com

*通信作者：周昌艷（1969—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)槭秤镁修r(nóng)藥殘留檢測技術(shù)。E-mail：changyanz@sina.com