基于SERS法的蘋果中農(nóng)藥殘留的定性及定量分析

趙琦，劉翠玲，孫曉榮，苗雨晴

(北京工商大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院，北京　100048)

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基于SERS法的蘋果中農(nóng)藥殘留的定性及定量分析

趙琦，劉翠玲*，孫曉榮，苗雨晴

(北京工商大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院，北京100048)

摘要:使用共焦顯微拉曼光譜儀，結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS)技術(shù)，采集含有農(nóng)藥馬拉硫磷和二嗪農(nóng)的蘋果汁樣本的基于銀納米溶膠的表面增強(qiáng)拉曼光譜，采用距離匹配和判別分析的方法對(duì)其進(jìn)行定性分析。然后結(jié)合偏最小二乘(Partial Least Squares,PLS)方法對(duì)兩種農(nóng)藥的表面增強(qiáng)拉曼光譜分別進(jìn)行數(shù)學(xué)建模分析。結(jié)果表明表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)技術(shù)對(duì)無(wú)損快速定性分析馬拉硫磷和二嗪農(nóng)具有較高的準(zhǔn)確性，而定量分析二者的含量也具有較高的可行性。

關(guān)鍵詞：表面增強(qiáng)拉曼散射；銀納米溶膠；定性分析；定量分析

1引言

1874年歐特馬·琴德勒首次合成DDT，1939年瑞士化學(xué)家P.H.Müller發(fā)現(xiàn)了化合物DDT強(qiáng)大的殺蟲劑功效，使農(nóng)藥從天然藥物與無(wú)機(jī)合成農(nóng)藥并存的階段直接進(jìn)入了合成有機(jī)農(nóng)藥的階段。當(dāng)農(nóng)藥使農(nóng)作物產(chǎn)量增加、提高經(jīng)濟(jì)效益的時(shí)候，帶來(lái)的問題也逐漸顯露。美國(guó)環(huán)境工作組(EWG)連續(xù)10年發(fā)布的受農(nóng)藥污染最嚴(yán)重的農(nóng)產(chǎn)品排行榜中，約65%的農(nóng)產(chǎn)品樣本檢測(cè)呈陽(yáng)性，其中蘋果位居12種農(nóng)藥污染排行榜之首，幾乎每個(gè)樣本的農(nóng)藥殘留量都高達(dá)99%，殘留農(nóng)藥種類至少有一種。針對(duì)這一問題，自上世紀(jì)70年代開始，相關(guān)農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析技術(shù)逐漸發(fā)展進(jìn)步。如今，經(jīng)典測(cè)試方法有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣-質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、液-質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等，現(xiàn)已發(fā)展的十分成熟，是農(nóng)藥殘留測(cè)定最常用且不可或缺的手段[1-3]。試紙法和傳感器法也被廣泛應(yīng)用于田間地頭的初步快速篩查。但這些方法也存在一些弊端，經(jīng)典檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高，但樣品前處理復(fù)雜，即使是現(xiàn)在比較流行的QuEChERS快速樣品前處理技術(shù)，也要經(jīng)過(guò)樣品稱量、渦旋、離心、萃取、過(guò)濾等多步后才能進(jìn)行上機(jī)[4]。試紙法和傳感器法適用于快速檢測(cè)，但檢測(cè)產(chǎn)生的大量有毒試紙?jiān)噭┤绲貌坏桨踩行У奶幚?，又?huì)對(duì)環(huán)境造成更加嚴(yán)重的二次污染。光譜技術(shù)(原子熒光光譜法、紫外-可見光譜法、紅外光譜法、拉曼光譜法、高光譜成像檢測(cè)技術(shù)等)則因其快速、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)成為近些年逐漸發(fā)展起來(lái)的農(nóng)殘檢測(cè)方法。而拉曼光譜技術(shù)特別是表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)因其高分辨率、高靈敏度，不易受水的干擾等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越多的應(yīng)用于痕量物質(zhì)[5-6]，如農(nóng)獸藥殘留、違法添加劑的檢測(cè)研究等[7-10]。

國(guó)內(nèi)外在應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)果蔬農(nóng)藥殘留中取得了一定的進(jìn)展。其中，F(xiàn)an等[11]采用金溶膠作為表面增強(qiáng)劑利用SERS法檢測(cè)蘋果中的亞胺硫磷，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液的亞胺硫磷檢出限可達(dá)到1 μg/mL，蘋果提取物的亞胺硫磷檢出限可達(dá)到1 μg/g，表明其方法一定程度上可用于痕量污染物分析復(fù)雜食品基質(zhì)中亞胺硫磷。李小舟[12]等選用蘋果和有機(jī)磷農(nóng)藥倍硫磷、甲拌磷為研究對(duì)象，采用SERS技術(shù)探索了兩種農(nóng)藥在蘋果表面的快速無(wú)損檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：表面增強(qiáng)拉曼散射光譜可有效識(shí)別倍硫磷和甲拌磷的特征信號(hào)，然后分別以728 cm-1、1512 cm-1波段處的拉曼信號(hào)作為兩種農(nóng)藥定標(biāo)峰建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，為表面增強(qiáng)拉曼散射光譜技術(shù)定量分析甲拌磷、倍硫磷的含量提供了參考。Jitraporn[13]等分別使用金、銀納米溶膠粒子作為表面增強(qiáng)基底獲得了農(nóng)藥地蟲磷的表面增強(qiáng)拉曼散射光譜，發(fā)現(xiàn)地蟲磷分子在兩種金屬表面的吸附特性不同，特征信號(hào)的增強(qiáng)效果也不同，其中基于銀納米粒子的地蟲磷檢測(cè)限可達(dá)10 ppm。Shintaro[14]等采用納米銀做表面增強(qiáng)基底研究了水胺硫磷、氧化樂果、甲拌磷和丙溴磷四種農(nóng)藥的表面增強(qiáng)拉曼散射光譜，主成分分析顯示四種農(nóng)藥的檢測(cè)限分別為1 ppm、5 ppm、0.1 ppm和5 ppm。

本研究采用共焦顯微拉曼光譜儀結(jié)合SERS技術(shù)，分別采集蘋果汁中有機(jī)磷農(nóng)藥二嗪農(nóng)和馬拉硫磷的表面增強(qiáng)拉曼光譜，之所以以蘋果汁作為樣本背景，沒有選擇農(nóng)藥最易殘留的蘋果皮，是因?yàn)楦鶕?jù)GB2763-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中的規(guī)定，最大殘留量的限定單位為mg/kg，如果選取蘋果皮，殘留量標(biāo)準(zhǔn)不易換算。之后采用判別分析和距離匹配兩種定性分析方法建立兩種農(nóng)藥的定性分析模型，再采用偏最小二乘(PLS)建模方法建立其定量模型，旨在探索表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)定性及定量分析有機(jī)磷農(nóng)藥的可行性及準(zhǔn)確性，找出最佳建模方法，以期找到更加綜合全面、高效省時(shí)的農(nóng)藥殘留拉曼檢測(cè)方法。

2材料與方法

2.1試劑與儀器

甲醇中馬拉硫磷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：標(biāo)準(zhǔn)值1.00 mg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(%)(k=2)為4；甲醇中二嗪農(nóng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：標(biāo)準(zhǔn)值1.00 mg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(%)(k=2)為1。置于冷藏室中避光保存，使用前于室溫(20±3℃)平衡，購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所。

表面增強(qiáng)劑：Easy Peak(舒峰TM)科研型銀納米溶膠，購(gòu)自上海納騰儀器。

DXR激光共焦顯微拉曼光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)，實(shí)驗(yàn)前用聚乙烯對(duì)拉曼光譜儀進(jìn)行峰位校準(zhǔn)。儀器參數(shù)設(shè)置：激光波長(zhǎng)780 nm，激光能量24 mW，光柵400 lines/mm，光闌50，估計(jì)分辨率4.7~8.7 cm-1，物鏡MPlan 10x/0.25，采集曝光時(shí)間5 s，熒光修正。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1樣本制備

將市購(gòu)有機(jī)蘋果用去離子水洗凈晾干后粉碎，并經(jīng)過(guò)濾取其汁液為背景，配制馬拉硫磷(國(guó)標(biāo)最大殘留量2 mg/kg)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.1~15.3 mg/kg的梯度樣本35個(gè)作為預(yù)測(cè)樣本，配制二嗪農(nóng)(國(guó)標(biāo)最大殘留量0.2 mg/kg)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.02~3.29 mg/kg的樣本23個(gè)，該質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分布都在國(guó)標(biāo)最大殘留量附近，具有實(shí)際意義。

2.2.2光譜數(shù)據(jù)采集

分別取2.2.1中配制好的樣本200 μL與銀(Ag)納米溶膠1∶1(v∶v)混合均勻后注入液體池中，在室溫及光照環(huán)境相對(duì)恒定的條件下采集光譜待分析。在光譜采集前先要對(duì)樣本進(jìn)行聚焦，首先利用顯微鏡頭進(jìn)行觀察，將光源聚焦在液體池底部，如圖1所示。再通過(guò)微調(diào)將載物臺(tái)緩緩向下移動(dòng)，直至池底逐漸模糊，有時(shí)可觀察到樣本中的細(xì)微雜質(zhì)，如圖2所示即確定正確聚焦在蘋果汁樣品上。

Fig.1Focus micrograph of bottom of the liquid pool

Fig.2Focus micrograph of the apple juice sample

采集的光譜如圖3所示。再對(duì)單一蘋果汁樣本按上述方法進(jìn)行拉曼光譜采集，并將蘋果汁樣本光譜圖與加入了農(nóng)藥的樣本進(jìn)行了對(duì)比，對(duì)比圖如圖4所示。圖中的三條光譜分別為單一蘋果汁樣本和兩種農(nóng)藥樣本中的最高及最低濃度樣本的拉曼光譜。

Fig.3　Surface enhanced Raman spectroscopy of two kinds of pesticides

Fig.4　Contrastive spectroscopy(background/residues)

3分析與建模

3.1定性分析

如圖3、圖4所示，肉眼并不能直觀的從光譜圖中直接分辨出兩種農(nóng)藥，所以需要借助一些定性分析算法。本文選取的是距離匹配和判別分析兩種定性分析算法。

另外本研究為提高信噪比，減小隨機(jī)噪音，消除基線偏移并放大和分離重疊信息，對(duì)2.2.2中采集的光譜采用一階導(dǎo)數(shù)+Norris Derivative濾波進(jìn)行預(yù)處理，然后分別采用判別分析及距離匹配兩種方法建立定性模型，并從每種農(nóng)藥中各隨機(jī)挑選3個(gè)樣本對(duì)模型進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如圖5、圖6所示，橫縱坐標(biāo)分別代表每個(gè)樣品相對(duì)兩類樣品的判別距離，d代表二嗪農(nóng)(diazinon)，m代表馬拉硫磷(malathion)。

Fig.5Discriminant analysis model and the test results

Fig.6Distance matching model and the test results

從測(cè)試結(jié)果圖中可以看出，兩種方法的6個(gè)測(cè)試樣本均被準(zhǔn)確無(wú)誤地分到各自的類別中，定性鑒別正確率為100%，多次隨機(jī)更換測(cè)試樣本，都能得到相同結(jié)論。

3.2定量分析

從圖4中也可看出，不同殘留物濃度樣品的光譜圖的直觀差別并不明顯，所以本文考慮借助定量分析算法進(jìn)行進(jìn)一步的研究。同樣對(duì)2.2.2中采集的光譜采用一階導(dǎo)數(shù)+Norris Derivative濾波進(jìn)行預(yù)處理后，采用PLS法分別建立兩種農(nóng)藥的定量分析模型，并各挑選三個(gè)樣本作為測(cè)試集，檢驗(yàn)所建模型的預(yù)測(cè)效果。因光譜中可能含有一些無(wú)法直接觀察到的有用信息，為防止人為忽略，本次定量研究選取全波段光譜進(jìn)行分析。

基于PLS法的兩種農(nóng)藥的定量分析模型擬合效果都較好，其中如圖7所示，馬拉硫磷定量模型的相關(guān)系數(shù)為0.99，校正均方根誤差為0.02，校正樣本的擬合值與真實(shí)值的最大殘差為0.059 mg/kg。

而測(cè)試樣本(圖中箭頭所指)的預(yù)測(cè)效果相對(duì)于校正樣本的擬合效果要差，具體結(jié)果如表1所示。

Table.1　Predicting result of malathion

可以看到，三個(gè)測(cè)試樣本的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值的偏差分別為0.46,0.3,0.24 mg/kg，濃度越高的樣本預(yù)測(cè)效果越好。

二嗪農(nóng)定量模型的相關(guān)系數(shù)為0.99(見圖8)，校正均方根誤差為0.01，校正樣本的擬合值與真實(shí)值的最大殘差為0.03 mg/kg。

同樣，測(cè)試樣本(圖中箭頭所指)的預(yù)測(cè)效果相對(duì)于校正樣本的擬合效果要差，具體結(jié)果如表2所示。

Table.2　Predicting result of diazinon

與馬拉硫磷的定量模型的效果相比，二嗪農(nóng)的整體預(yù)測(cè)效果更好，三個(gè)測(cè)試樣本的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值的偏差分別為0.2，-0.14，-0.1 mg/kg，但也存在高濃度樣本預(yù)測(cè)精準(zhǔn)，低濃度樣本預(yù)測(cè)較差的現(xiàn)象。

Fig.7　Calculated curve and residual plot (malathion)

Fig.8　Calculated curve and residual plot (diazinon)

4結(jié)論

本研究采集了含有有機(jī)磷農(nóng)藥二嗪農(nóng)與馬拉硫磷的蘋果汁樣本的基于納米銀溶膠的表面增強(qiáng)拉曼光譜，并建立了二者的定性與定量模型。研究表明，基于定性模型可以準(zhǔn)確完全的區(qū)分兩種農(nóng)藥，正確率為100%，適用于快速定性分析蘋果中含有何種農(nóng)藥。而定量模型中二嗪農(nóng)的效果優(yōu)于馬拉硫磷，且兩個(gè)模型都是校正擬合效果較好，測(cè)試樣本的預(yù)測(cè)效果稍差，特別是對(duì)于低濃度的樣本，殘差百分比相對(duì)較高，所以所建模型較適用于高濃度樣本的快速檢測(cè)。對(duì)于低濃度樣本，應(yīng)該從提高其預(yù)測(cè)精度的角度入手再進(jìn)行后續(xù)研究。

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Qualitative and Quantitative Analyzing on Pesticide Residue in Apple Using SERS

ZHAO Qi，LIU Cui-ling*，SUN Xiao-rong，MIAO Yu-qing

(SchoolofComputerandInformationEngineering，BeijingTechnologyandBusinessUniversity，Beijing100048，China)

Abstract:Confocal micro Raman spectrometer combined surface enhanced Raman scattering (SERS) was introduced in collecting surface-enhanced Raman spectroscopy of apple juice samples contained pesticide malathion and diazinon.Distance match and discriminant analysis methods were used to build two kinds of mathematical models for qualitative analysis respectively.Then partial least squares was used to building the quantitative model,the results show that the qualitative analysis based on surface-enhanced Raman scattering (SERS) to detect trace levels of malathion and diazinon has high accuracy,and the quantitative analysis can be accurate and feasible.

Key words:surface-enhanced Raman scattering (SERS);silver(Ag) sol; qualitative analysis; quantitative analysis

中圖分類號(hào)：S-123

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi:10.13883/j.issn1004-5929.201601003

作者簡(jiǎn)介：趙琦(1992-)，女，碩士研究生，光譜檢測(cè)技術(shù)與智能信息化處理，E-mail:zqbyzgz@163.com通訊作者：劉翠玲，E-mail:liucl@btbu.edu.cn

基金項(xiàng)目：北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(4142012)；北京市教委科研計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(KZ201310011012)；北京市教委科技創(chuàng)新平臺(tái)(PXM_2012_014213_000023)

收稿日期：2015-07-03; 修改稿日期:2015-10-29

文章編號(hào)：1004-5929(2016)01-0006-06