烏塌菜與薹菜變種間雜交后代硫代葡萄糖苷組分及含量分析

馮希環(huán) 孫 艷 劉倩倩 汪俏梅 劉維信*

（1青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，青島市園藝植物遺傳改良與育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109；2浙江大學(xué)園藝系，農(nóng)業(yè)部園藝植物生長(zhǎng)發(fā)育與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310029）

烏塌菜與薹菜變種間雜交后代硫代葡萄糖苷組分及含量分析

馮希環(huán)1孫 艷1劉倩倩1汪俏梅2劉維信1*

（1青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，青島市園藝植物遺傳改良與育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109；2浙江大學(xué)園藝系，農(nóng)業(yè)部園藝植物生長(zhǎng)發(fā)育與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310029）

以烏塌菜品種上海小八葉、薹菜品種平度薹菜及變種間雜交后代6-1和6-5為試材，采用高效液相色譜法（HPLC）分析葉片及葉柄中硫代葡萄糖苷的組分與含量，以期了解不結(jié)球白菜變種間雜交后代的硫苷變化。結(jié)果表明：4份材料的葉片、葉柄中均檢測(cè)到組分相同的脂肪族硫苷、吲哚族硫苷各4種，而芳香族硫苷只在變種間雜交后代6-1的葉片和葉柄中檢測(cè)到；參試各材料葉片中總脂肪族硫苷含量、總吲哚族硫苷含量和總硫苷含量均高于葉柄。變種間雜交后代6-1葉片、葉柄中有益人體健康的2-苯乙基硫苷（NAS）和吲哚-3-甲基硫苷（GBC）含量均高于親本上海小八葉和平度薹菜，表明變種間雜交可以用于改良不結(jié)球白菜硫苷組分及含量。

烏塌菜；薹菜；變種間雜交；硫代葡萄糖苷；高效液相色譜法

硫代葡萄糖苷（glucosinolates，簡(jiǎn)稱硫苷）又稱黑芥子苷、芥子油苷，廣泛存在于十字花科植物中，是一種含硫的次生代謝物質(zhì)（Halkier & Gershenzon，2006）。在植物體中已鑒定出逾120種硫苷，根據(jù)側(cè)鏈R基團(tuán)的不同可以分為3類：脂肪族硫苷、吲哚族硫苷、芳香族硫苷。硫苷及其降解產(chǎn)物與抵御病蟲害、構(gòu)成十字花科蔬菜特殊風(fēng)味以及抗癌作用等密切相關(guān)（Giamoustaris & Mithen，1995；Murillo & Mehta，2001；Tierens et al.，2001；Lankau，2007）。大量研究表明，食用蕓薹屬蔬菜可以降低癌癥的發(fā)生率（Nijhoff et al.，1995；Tawfiq et al.，1995；宋曙輝和薛穎，1997；汪俏梅和曹家樹，2001；王永飛 等，2004；Maria & Richard，2009）；但脂肪族硫苷、吲哚族硫苷、芳香族硫苷的抗癌活性及其作用機(jī)理不同（袁高峰等，2009）。硫苷及其降解產(chǎn)物的生物學(xué)效應(yīng)在植物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)等許多領(lǐng)域中引起研究者的關(guān)注；同時(shí)，改變蕓薹屬蔬菜硫苷組分、提高其有益硫苷含量也成為蔬菜育種的新目標(biāo)。

目前，硫苷與白菜類蔬菜風(fēng)味形成關(guān)系的研究較深入。白菜類蔬菜風(fēng)味的形成來(lái)源于3-丁烯基硫苷（gluconapin，NAP）、4-戊烯基硫苷（glucobrassicanapin，GBN）和苯乙基硫苷（gluconasturtiin，GNST）降解產(chǎn)生相應(yīng)的異硫氰酸酯化合物（何洪巨 等，2002）。研究發(fā)現(xiàn)，3-丁烯基硫苷和4-戊烯基硫苷在所有白菜基因型中含量豐富（Padilla et al.，2007；Kim et al.，2010；Cartea et al.，2012）。Kliebenstein等（2001）報(bào)道，AOP2是控制3-丁烯基硫苷和4-戊烯基硫苷生成的關(guān)鍵基因。王輝等（2011a）推測(cè)，BrAOP可能是控制白菜中3-丁烯基硫苷生物合成的關(guān)鍵候選基因。硫苷的組分與含量在蕓薹屬不同植物種類間表現(xiàn)出很大變異（Rosa et al.，1997；李鮮 等，2006），這為選育高硫苷含量以及不同硫苷組分的白菜類蔬菜新品種奠定了基礎(chǔ)。起源于中國(guó)的白菜亞種的兩個(gè)變種——薹菜〔Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. tai-tsai Hort〕和烏塌菜〔Brassicacampestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. rosularis Tsen et Lee〕是黃淮中下游地區(qū)深受群眾喜愛并廣泛栽培的特色蔬菜，關(guān)于薹菜的硫苷含量及組分已有報(bào)道（何洪巨 等，2002；宋延宇 等，2008），但鮮有關(guān)于烏塌菜硫苷組分的報(bào)道。筆者在前期分析不結(jié)球白菜種質(zhì)資源時(shí)發(fā)現(xiàn)薹菜與烏塌菜硫苷含量以及組分均存在顯著差異（孫艷，2013），為探討通過(guò)變種間雜交選育不同硫苷含量及組分的白菜類蔬菜新品種的可行性，本試驗(yàn)比較了烏塌菜品種上海小八葉和薹菜品種平度薹菜與它們的雜交后代間葉片、葉柄中硫苷組分及含量的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試薹菜品種為平度薹菜自交系，烏塌菜品種為上海小八葉自交系，是青島農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜課題組分別從山東青島地方品種平度薹菜和上海地方品種上海小八葉經(jīng)連續(xù)6代自交選育而成的親本材料。育種系6-1和6-5是由平度薹菜自交系與上海小八葉自交系雜交產(chǎn)生F1，再以上海小八葉自交系為輪回親本連續(xù)回交4代，在回交后代的自交群體中（BC4F2）篩選出的2個(gè)優(yōu)良株系。

上述4份材料均于2014年9月1日播種于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，10月9日定植，株距18 cm，行距20 cm，每小區(qū)30株，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)。11月9日取樣，每小區(qū)隨機(jī)選取5株，葉片與葉柄分別用液氮迅速冷凍，真空冷凍干燥（Virtis，USA）后研磨成粉末，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 硫苷組分及含量分析

參照J(rèn)ia等（2009）的方法，取0.1 g凍干粉于15 mL離心管中，加入5 mL ddH2O，沸水浴10 min后3 000 r·min-1離心10 min，采用Eppendorf移液器吸出提取液；再加入5 mL ddH2O，沸水浴10 min，再次離心（3 000 r·min-1，10 min），合并提取液，置于-20 ℃冰箱保存。

通過(guò)DEAE-Sephadex將提取液柱吸附、洗脫，得到純化樣品，過(guò)濾后進(jìn)行HPLC（Waters，USA）分析。HPLC條件：檢測(cè)波長(zhǎng)為226 nm，流速為110 mL·min-1，色譜柱為C18反相色譜柱。以oNPG為內(nèi)標(biāo)（響應(yīng)因子為0.17），采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算硫苷含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏塌菜、薹菜及變種間雜交后代葉片和葉柄中硫代葡萄糖苷構(gòu)成

由圖1和表1、2可知，4份參試材料的葉片和葉柄中都檢測(cè)到了組分相同的4種脂肪族硫苷和4種吲哚族硫苷，其中4種脂肪族硫苷為：順-2-羥基-3-丁烯基硫苷（PRO）、5-甲基亞硫酰基戊基硫苷（5MSOP）、3-丁烯基硫苷（NAP）和4-戊烯基硫苷（GBN）；4種吲哚族硫苷為：4-羥基-3-吲哚基甲基硫苷（4OH）、吲哚-3-甲基硫苷（GBC）、4-甲氧吲哚-3-甲基硫苷（4ME）和1-甲氧吲哚-3-甲基硫苷（NEO）。而芳香族硫苷僅檢測(cè)到1種，即2-苯乙基硫苷（NAS），且只在變種間雜交后代6-1中檢測(cè)到，親本上海小八葉和平度薹菜中均未檢測(cè)到。

圖1 上海小八葉葉片中硫代葡萄糖苷檢測(cè)HPLC圖譜

2.2 烏塌菜、薹菜及變種間雜交后代葉片和葉柄中脂肪族硫苷含量

由表1、2可知，上海小八葉、平度薹菜和變種間雜交后代6-5的葉片和葉柄中的脂肪族硫苷含量均超過(guò)了總硫苷含量的50%，而變種間雜交后代6-1葉柄中的脂肪族硫苷含量只占總硫苷含量的35.33%；其中，6-5葉柄中的總脂肪族硫苷含量明顯高于其他3份材料。在參試材料所含的4種脂肪族硫苷中，PRO含量在上海小八葉、平度薹菜和6-1的葉片和葉柄中均為最低；而GBN含量占總硫苷含量的比例均為最高（除平度薹菜葉片外），其中上海小八葉葉片中GBN含量超過(guò)了總硫苷含量的50%。

2.3 烏塌菜、薹菜及變種間雜交后代葉片和葉柄中吲哚族硫苷含量

比較兩個(gè)親本材料可以看出，盡管平度薹菜的總吲哚族硫苷含量低于上海小八葉，但占總硫苷含量的比例卻高于上海小八葉，分別是后者的2.00倍（葉片）和1.44倍（葉柄）。而2份變種間雜交后代的總吲哚族硫苷含量的占比則出現(xiàn)明顯分化，6-1的總吲哚族硫苷含量的占比較高，與平度薹菜接近；6-5的總吲哚族硫苷含量的占比則低于上海小八葉（表1、2）。

2.4 烏塌菜、薹菜及變種間雜交后代葉片和葉柄中芳香族硫苷含量

在4份參試材料中，只有變種間雜交后代6-1的葉片和葉柄中檢測(cè)到芳香族硫苷NAS，葉片中的含量是葉柄中的2.05倍（表1、2）。

表1 烏塌菜、薹菜及變種間雜交后代葉片中硫代葡萄糖苷組成與含量

表2 烏塌菜、薹菜及變種間雜交后代葉柄中硫代葡萄糖苷組分及含量

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，參試4份材料葉片中的總硫苷含量均高于葉柄，與陳新娟等（2006）、宋延宇等（2008）的報(bào)道一致。變種間雜交后代6-1和6-5葉片中總硫苷含量介于雙親之間，6-1葉柄中總硫苷含量也介于雙親之間，但6-5葉柄中總硫苷含量高于雙親，表明烏塌菜與薹菜雜交后代的總硫苷含量發(fā)生了變化。

本試驗(yàn)中，親本與變種間雜交后代的葉片和葉柄中的NAP、GBN含量均較高；除平度薹菜葉片外，其余材料的脂肪族硫苷中均以GBN所占比例最高。王輝等（2011b）測(cè)定了64份普通白菜DH系材料硫苷成分的構(gòu)成及含量，發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)種植的普通白菜中NAP的占比平均在50%左右，GBN則平均未超過(guò)30%。本試驗(yàn)中上海小八葉葉片和葉柄中GBN的占比均高于45%，變種間雜交后代6-5也獲得了上海小八葉該硫苷組分占比較高的性狀。

另一值得關(guān)注的是PRO，作為特殊風(fēng)味物質(zhì)前體（van Doorn et al.，1998），可能是致甲狀腺腫素5-乙烯唑烷-2-硫酮的前體（Heaney & Fenwick，1995），但亦有相反結(jié)果的報(bào)道（McMillan et al.，1986）。本試驗(yàn)中變種間雜交后代6-5的PRO含量明顯高于兩個(gè)親本，而6-1與兩親本相近。

本試驗(yàn)檢測(cè)到變種間雜交后代的硫苷組分較之親本不同，尤其是部分有益于人體健康的硫苷組分得以增加。芳香族硫苷NAS是蕓薹屬蔬菜的重要風(fēng)味物質(zhì)，其降解產(chǎn)物異硫氰酸鹽對(duì)白血病細(xì)胞增殖有顯著抑制作用（Adesida et al.，1996）。NAS在上海小八葉和平度薹菜中均未檢出，但6-1的葉片〔0.78 μmol·g-1（DW）〕和葉柄〔0.38 μmol·g-1（DW）〕中的NAS含量高于薹菜、蕪菁和普通白菜（宋廷宇 等，2008；孫文彥 等，2009；王輝 等，2011b），表明烏塌菜和薹菜雜交使部分后代的芳香族硫苷含量得到明顯提高。

另?yè)?jù)報(bào)道，GBC的降解產(chǎn)物吲哚-3-甲醇具有一定的抗癌活性（Rosa & Heaney，1993）。本試驗(yàn)中，變種間雜交后代6-1葉片中GBC含量高于親本上海小八葉和平度薹菜。

本試驗(yàn)中烏塌菜與薹菜變種間雜交后連續(xù)回交，獲得的新品系在總硫苷含量和組分上均與親本不同，尤其是部分有益于人體健康的硫苷組分（NAS、GBC）得以增加，這可能與雜交導(dǎo)致的基因重組有關(guān)。新品系因硫苷組分變化獲得有益于人體健康的特性以及風(fēng)味的變化有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Analysis of Glucosinolates Composition and Content in Filial Lines Derived from Inter-Varietal Cross of Savoy and Tai-tsai by HPLC

FENG Xi-huan1，SUN Yan1，LIU Qian-qian1，WANG Qiao-mei2，LIU Wei-xin1*
（1College of Horticulture，Qingdao Agricultural University，Qingdao Key Laboratory of Genetic Improvement and Breeding in Horticultural Plants，Qingdao 266109，Shandong，China；2Department of Horticulture，Zhejiang University，Key Laboratory of Horticultural Plant Growth，Development and Quality Improvement，Ministry of Agriculture，Hangzhou 310029，Zhejiang，China）

To understand the variation of glucosinolates composition in backcrossing lines derived from inter-varietal crosses in pakchoi，the content and composition of glucosinolates were analyzed by high performance liquid chromatography（HPLC）for savoy〔Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. rosularis Tsen et Lee〕cv.‘Shanghaixiaobaye’，tai-tsai〔Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. tai-tsai Hort〕cv.‘Pingdutaicai’，and 2 lines selected from F2populations of 4 times backcrossing of（‘Shanghaixiaobaye’בPingdutaicai’）with‘Shanghaixiaobaye’as the recurrent parent．The results showed that each of 4 kinds of aliphatic and indole glucosinolate were detected in the leaf and petiole of 4 tested materials．The total contents of aliphatic glucosinolate，indole glucosinolate and total glucosinolate in leaves were higher than petioles，and also different with 4 tested materials．The contents of health-beneficial compounds 2-phenylethyl glucosinolate（NAS）and glucobrassicin（GBC）were higher in leaves of‘6-1’than both its parents‘Shanghaixiaobaye’and‘Pingdutaicai’，indicating that inter-varietal crosses could be used in breeding new pakchoi cultivars with improved glucosinolate composition．

Savoy；Tai-tsai；Inter-varietal cross；Glucosinolate；HPLC

馮希環(huán)，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜生理與育種，E-mail：15806584583@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：劉維信，教授，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：白菜遺傳育種，E-mail：liuweixin2006@163.com

2016-09-19；接受日期：2016-11-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401864），山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2016CM15），青島市自主創(chuàng)新計(jì)劃應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（16-5-1-74-jch）