金錢草總黃酮提取液抑制大鼠草酸鈣結石形成機制的研究

陶婷婷 呂伯東 黃曉軍 傅駿 馬寅鋒

浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科，浙江杭州310005

金錢草總黃酮提取液抑制大鼠草酸鈣結石形成機制的研究

陶婷婷 呂伯東 黃曉軍 傅駿 馬寅鋒

浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科，浙江杭州310005

目的探討金錢草總黃酮提取液抑制大鼠草酸鈣結石形成機制的研究。方法常規(guī)飼養(yǎng)大鼠1周，采用乙二醇飲水和氯化銨灌胃造模草酸鈣結石大鼠模型，將30只SD大鼠隨機分為空白對照組（A組）、草酸鈣結石模型組（B組）和金錢草總黃酮組（C組）。給藥4周后收集各組大鼠24 h尿液，檢測尿pH值及24 h尿鈣、尿草酸、尿酸、尿葡胺聚糖和尿凝血酶原片段-1的含量。結果金錢草總黃酮組大鼠24 h尿量較草酸鈣結石模型組增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。金錢草總黃酮組大鼠與草酸鈣結石模型組大鼠比較，其24 h尿鈣和尿草酸含量均降低，而尿凝血酶原片段-1的含量增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而三組間尿pH值、尿酸經(jīng)比較均無明顯差異（P＞0.05）。結論金錢草總黃酮提取液可能通過增加大鼠24 h尿量，降低尿液中成石因子-尿鈣和尿草酸的含量，增加尿液中抑石因子-尿凝血酶原片段-1含量，從而抑制草酸鈣結石的形成。

草酸鈣；結石；金錢草總黃酮；凝血酶原片段-1

泌尿系結石是泌尿科最常見的疾病［1］，在歐美國家，5%～10%在一生中至少發(fā)生一次泌尿系結石，歐洲泌尿系結石年新發(fā)病率約100/10萬～400/10萬人［2］。我國泌尿系結石發(fā)病率為1%～5%，年新發(fā)病率約150/10萬～200/10萬人［3］。泌尿系結石的成分有草酸鈣、磷酸鈣、尿酸、磷酸鎂銨、胱氨酸等，其中草酸鈣及含草酸鈣的結石約占泌尿系結石的80%以上［4］。

泌尿系結石的形成受到尿液中許多成分的影響，如尿中鈣、草酸等成分促進結石生成，稱為成石因子。而尿液中又有許多抑制結石形成的物質(zhì)，它們在正常人尿液中濃度或活力高，而在結石患者中含量低。這些抑石因子大體可分為小分子抑制物和大分子抑制物，其中小分子抑制物包括枸櫞酸鹽、鎂、焦磷酸鹽、α-亞麻酸等［5］，而大分子抑制物包括腎鈣素、蛋白多糖、骨橋蛋白、凝血酶原片段、α-胰蛋白酶抑制物片段、核糖核酸、酸性黏多糖、黏液素［6-8］。成石抑制物的研究已成為泌尿系結石的重要研究方向。

中醫(yī)藥治療泌尿系結石有悠久的歷史，療效顯著，且副作用少，但中草藥抑制結石形成的機制報道甚少，至今尚不清楚，尤其是對其中單味中藥的研究更少。金錢草是目前大多數(shù)排石方劑中最常見的一味要藥［9］，其中黃酮類化合物為其主要成分［10，11］，本次研究旨在觀察金錢草總黃酮類化合物對尿液中成石因子和抑石因子等成分的影響，從而探討金錢草防治草酸鈣結石的機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用8周齡SD健康雄性大白鼠30只，體重200～250 g［浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，許可證編號：SCXK（滬）2008-0016］。

1.2 金錢草總黃酮提取液的制備

金錢草干燥全草（購于浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院中藥房）10 kg粉碎后經(jīng)體積分數(shù)為80%乙醇提取，加熱回流2次，每次3 h，回收得到約1 kg浸膏，通過溶劑萃取得到石油醚部分與水部分。水部分經(jīng)大孔樹脂柱色譜，以水-乙醇梯度洗脫，得到總黃酮部分約150 g，加入蒸餾水定容至1mg/L（由浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院藥劑科制備）。

1.3 草酸鈣結石模型造模

采用1%乙二醇（EG）飲水+2%氯化銨（AC），每天灌胃2mL/只。

1.4 實驗動物分組及給藥方法

隨機分為3組，每組10只?？瞻讓φ战M（A組）：自來水飲水2 mL/只/d+生理鹽水2 mL/只/d灌胃；草酸鈣結石模型組（B組）：1%乙二醇（EG）飲水+2%氯化銨（AC）2 mL/只/d+生理鹽水2 mL/只/d灌胃；金錢草總黃酮組（C組）：1%EG飲水+2%AC 2mL/只/d+金錢草總黃酮提取液2mL/只/d灌胃。各組大鼠均標準喂養(yǎng)，飼養(yǎng)5周，第1周先適應環(huán)境，從第2周開始給藥。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22℃～25℃，濕度：50%～60%。

1.5 觀察指標

灌胃4周后大鼠單獨置入代謝籠中，收集其24 h尿液，標本中加入0.02%疊氮化鈉防止細菌分解，統(tǒng)計24 h尿量。檢測24 h尿液中鈣、草酸、pH值、尿酸、葡胺聚糖、凝血酶原片段-1的含量。尿鈣、尿草酸、尿酸由我院生化室全自動生化儀檢測。尿葡胺聚糖購買人糖胺聚糖（GAG）ELISA試劑盒（上海拜力生物科技有限公司）進行檢測，凝血酶原片段-1購買人凝血酶原片段F1+2（F1+2）ELISA試劑盒（上海順科生物科技有限公司）檢測。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多個樣本均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組一般情況比較

A組大鼠毛色光澤，緊密貼身，雙目有神，反應靈敏，食欲旺盛，飲水適度，體重增加較快，大便呈顆粒狀，尿色淡黃。B組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)欠光澤，飲食減少，活動量較少，尿量減少，大便稀溏。而C組精神飲食活動基本正常。經(jīng)比較，三組間尿量差異有統(tǒng)計學意義（F=4.89＞F0.05（2，27），P＜0.05）。而A組和B組、B組和C組之間比較差異均有統(tǒng)計學意義（tAB=2.632，P＜0.05；tBC=2.873，P＜0.05），A組和C組間比較差異無統(tǒng)計學意義（t=1.324，P＞0.05），見表1。

表1 三組24 h尿量比較（±s，m L）

表1 三組24 h尿量比較（±s，m L）

注：與B組比較，*P＜0.05

組別n 24 h尿量空白對照組（A組）草酸鈣結石模型組（B組）金錢草總黃酮組（C組）10 10 10 24.4±3.3*16.6±2.8 26.3±3.1*

2.2 三組尿鈣、草酸、pH值、尿酸比較

三組間尿pH值（F=1.562，P＞0.05）、尿酸（F= 2.352，P＞0.05）比較差異無統(tǒng)計學意義。而三組間尿鈣（F=4.156，P＜0.05）和尿草酸（F=5.112，P＜0.05）比較差異有統(tǒng)計學意義。A組和C組的尿鈣和尿草酸含量明顯低于B組，差異有統(tǒng)計學意義（尿鈣：tAB=3.062，P＜0.05；tBC=2.973，P＜0.05；尿草酸：tAB=4.113，P＜0.05；tBC= 3.492，P＜0.05），見表2。

表2 三組尿鈣、草酸、pH值、尿酸比較（±s）

表2 三組尿鈣、草酸、pH值、尿酸比較（±s）

注：與B組比較，*P＜0.05

組別n pH值鈣（mmol/L）草酸（mmol/L）尿酸（mmol/L）空白對照組（A組）草酸鈣結石模型組（B組）金錢草總黃酮組（C組）10 10 10 6.74±0.35 6.49±0.23 6.60±0.38 1.32±0.41*3.78±0.31 2.05±0.37*0.78±0.21*2.13±0.59 1.20±0.33*0.78±0.07 0.81±0.06 0.85±0.19

2.3 三組尿葡胺聚糖和凝血酶原片斷-1比較

三組間尿葡胺聚糖和凝血酶原片段-1的含量均有差異（F=4.968，P＜0.05）。B組的尿葡胺聚糖和凝血酶原片段-1的含量均較A組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（t葡胺聚糖=2.362，P＜0.05，t凝血酶原片段-1=3.718，P＜0.05）。C組的尿葡胺聚糖含量比B組有所增加，但差異尚無統(tǒng)計學意義（t=1.894，P＞0.05），而尿凝血酶原片段-1的含量與B組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=4.137，P＜0.05），見表3。

表3 三組尿葡胺聚糖、凝血酶原片段-1比較（±s）

表3 三組尿葡胺聚糖、凝血酶原片段-1比較（±s）

注：與B組比較，*P＜0.05

組別n 葡胺聚糖（mg/L）凝血酶原片段-1（nmol/L）空白對照組（A組）草酸鈣結石模型組（B組）金錢草總黃酮組（C組）10 10 10 0.85±0.04*0.78±0.15 0.81±0.23 0.08±0.02*0.03±0.01 0.12±0.02*

3 討論

泌尿系結石是人體尿液中固體成分析出而形成，是人體內(nèi)的一種病理性生物礦化。病因復雜，大致包括代謝異常、遺傳因素、尿路局部因素（感染、梗阻、異物等）等個體因素，以及飲食、氣候、藥物、職業(yè)等環(huán)境因素。目前，泌尿系結石的形成機制尚未明確，目前已知有多種學說與之有關，如結石基質(zhì)學、鈣化斑學說、異質(zhì)促進成核學說、過飽和結晶學等。但各類學說都是基于泌尿系結石的兩大主要成分—晶體和基質(zhì)進行研究。研究認為，成核是結石形成的起始步驟，然后按生長、聚集的過程進一步發(fā)展形成固相晶核的過程。因此，我們認為要想預防結石的發(fā)生，首先必須通過防止尿液濃縮或過飽和，增強成石抑制因素，減少促進因素等［12-14］措施阻斷結石的成核過程。

金錢草是報春花科植物過路黃的干燥全草［15］，性甘、咸，微寒，歸肝、膽、腎、膀胱經(jīng)，具有清利濕熱、通淋、消腫的作用，其含有酚性成分、黃酮類、甙類、鞣質(zhì)、揮發(fā)油、氨基酸、膽堿、甾醇、氯化鉀、內(nèi)脂類等多種有效成分［16］，而對其中黃酮類物質(zhì)的研究較為深入，目前已分離出10種黃酮類化合物，黃酮苷類化合物有預防乙二醇和維生素D3造成的大鼠草酸鈣尿路結石形成的作用?，F(xiàn)代藥理研究表明：金錢草能增加尿量，增強輸尿管蠕動，抑制結晶形成，調(diào)節(jié)尿液pH值，另外金錢草還具有消炎、止痛、抗氧化、抑制肝臟脂質(zhì)過氧化等作用［16，17］。

本次研究采用1%的乙二醇和2%氯化銨誘導形成草酸鈣結石大鼠。研究證實，大鼠服用乙二醇后可增加草酸的合成，促進草酸鈣結晶的形成，而服用氯化銨后，可導致腎小管上皮損害，進行性功能障礙，有利于草酸鈣結石的逐漸形成［18，19］。在整個實驗過程中，模型組大鼠出現(xiàn)精神疲倦，毛發(fā)枯槁，活動減少，飲食少等一系列患病癥狀。實驗結束時模型組與空白對照組比較，24 h尿量降低，而尿鈣、尿草酸含量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明草酸鈣結石的存在，與泌尿系結石的臨床特征基本吻合。可見，大鼠造模成功，且實驗周期不長，方法經(jīng)濟、簡單易行、成石率高、穩(wěn)定性好，符合我們的實驗要求。

研究顯示［20］，金錢草中的黃酮類成分中的羧基和酚羥基可與尿液及晶體表面的鈣離子絡合，從而降低鈣離子濃度，減小草酸鈣的過飽和度，并能阻止晶體進一步生長、聚集以及互相轉(zhuǎn)化，而其羥基還可以與草酸根的羧基發(fā)生強烈的氫鍵作用，降低草酸根離子濃度，減少尿液中草酸鈣的過飽和度。本次實驗通過金錢草總黃酮提取液每日灌胃，結果顯示，4周后大鼠24 h尿量顯著增加，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。并且，金錢草總黃酮組大鼠的24 h尿鈣和尿草酸含量較模型組大鼠降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明金錢草總黃酮提取液可以通過增加尿量，降低24 h尿鈣和尿草酸的含量，從而防止尿液的過飽和，抑制草酸鈣結晶的形成。

目前研究證實，尿液中的很多大分子物質(zhì)是結石基質(zhì)的重要組成部分，如葡胺聚糖、尿凝血酶原片段-1、腎鈣素、Tamm-Horsfall蛋白、間α胰蛋白酶抑制物等［21］，這些大分子物質(zhì)能調(diào)節(jié)基質(zhì)成核、聚集和生長，能促進或抑制結石的聚集和生長。而尿凝血酶原片段-1是草酸鈣結石基質(zhì)中含量最為豐富的大分子物質(zhì)，被認為是最主要的內(nèi)源性尿草酸鈣結石形成抑制因子［22］。本課題通過對尿液中的大分子物質(zhì)葡胺聚糖和尿凝血酶原片段-1的檢測，發(fā)現(xiàn)模型組兩者的含量均較空白對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而造模后的大鼠每日給予金錢草總黃酮提取液后，尿葡胺聚糖含量比模型組有所增加，但差異尚無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而尿凝血酶原片段-1的含量與模型組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明金錢草總黃酮能夠通過增加尿液中尿凝血酶原片段-1的含量，從而抑制草酸鈣結石的形成。大量研究已經(jīng)證實尿凝血酶原片段-1［23，24］可能通過其與草酸鈣晶體結合，封閉晶體表面的生長點，改變晶體的表面特性等機制抑制草酸鈣晶體的生長和聚集。

綜上所述，金錢草作為傳統(tǒng)治療泌尿系結石的植物藥，其主要成分金錢草總黃酮提取物能有效抑制草酸鈣結晶的形成，經(jīng)過本課題對尿液中各項成分的研究，我們將其抑制草酸鈣結晶可能的機制總結如下：①金錢草總黃酮類物質(zhì)具有顯著的利尿作用，可降低24 h尿鈣和尿草酸的濃度，并且由于尿量的增加，尿液沖刷作用利于微小結石的排出。②金錢草總黃酮類物質(zhì)可能通過增加尿液中凝血酶原片段-1的含量，從而抑制草酸鈣結石的形成。但本課題尚未對泌尿系結石的全部影響因素進行研究，如骨橋蛋白、腎鈣素、黏液素等。因此，需要進一步的試驗研究全面了解金錢草總黃酮提取液對草酸鈣結石的作用機制。

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Study on the total flavone extract of lysimachia on calcium oxalate stone formation in rats

TAO Tingting LV Bodong HUANG Xiaojun FU Jun MA Yinfeng
Department of Urology Surgery，the Second Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310005，China

Objective To discuss themechanism of the total flavone extract of lysimachia on calcium oxalate stone formation in rats.M ethods Conventional breeding rats for aweek，the ratmodel of calcium oxalate stonewasmade by using ethylene glycol drinking water and ammonium chloride.30 adultmale SD ratswere randomized to three groups，the control group（group A），the stone group（group B），and the total flavone extract of lysimachia group（group C）.All rats were bred 4 weeks，the 24 hours'urine of rats were collected，and then the pH value，the calcium，oxalate acid，uric acid，the GAGs and the prothrombin fragment-1 of the urine were detected.Results The 24 hours'urine volume of the total flavone extract of lysimachia group were increased than the stone group，there was significant difference（P＜0.05），while therewas no significant difference compared with the control group（P＞0.05），and the calcium，oxalate acid of the urine of the total flavone extract of lysimachia group were reduced，and the urinary prothrombin fragment-1 increased compared with the stone group（P＜0.05），while there was no significant difference in pH value and uric acid of the urine among three groups（P＞0.05）.Conclusion The total flavone extract of lysimachia can increase the 24 hours'urine vol ume，and can decrease the promoting stone factors-calcium，oxalate acid of the urine，can increase the urinary prothrombin fragment-1，thereby inhibiting the formation of calcium oxalate stones.

Calcium oxalate；Stone；Total flavone extract of lysimachia；Urinary prothrombin fragment-1

R285.5

A

1673-9701（2016）18-0030-04

2016-01-27）

浙江省中醫(yī)藥優(yōu)秀青年人才基金項目（2014ZQ 015）