基于萘酰亞胺骨架的雙光子熒光探針構(gòu)建及應(yīng)用

祝新月，張海霞

（蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，甘肅省有色金屬化學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，功能有機(jī)分子化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000）

基于萘酰亞胺骨架的雙光子熒光探針構(gòu)建及應(yīng)用

祝新月，張海霞*

（蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，甘肅省有色金屬化學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，功能有機(jī)分子化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000）

熒光成像技術(shù)作為一種可以在無損條件下可視化探究生命活動的手段，近年來得到了廣泛的關(guān)注。雙光子熒光顯微鏡因擁有背景熒光低，光致?lián)p傷小，樣品穿透深度大，成像觀測時間長等其它成像方法無法比擬的優(yōu)勢已經(jīng)成為了熒光成像不可或缺的工具。雙光子熒光探針作為成像過程中熒光信號的承擔(dān)者在雙光子成像過程中起著至關(guān)重要的作用，在目前已報道的眾多雙光子成像的材料中，基于有機(jī)小分子構(gòu)建的雙光子熒光探針因具有細(xì)胞穿透能力強(qiáng)，成像速度快，特異性強(qiáng)，易修飾等特點(diǎn)得到了蓬勃的發(fā)展。該文綜述了近兩年雙光子熒光探針成像研究的進(jìn)展，并對雙光子熒光探針的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

雙光子;探針;成像

0 引言

一花一世界，一葉一菩提，人類對于微觀世界的探索從未止歇。顯微鏡的問世為人們揭開了微觀世界的面紗，但是簡單的觀察已經(jīng)不能滿足人們探尋生命奧秘的渴求，研究生命體內(nèi)分子間的相互作用，獲得更直觀有效的生命信息，已經(jīng)成為了生命科學(xué)的一個發(fā)展趨勢。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，科研工作者開發(fā)了大量的分析和成像手段，操作簡單，靈敏度高的熒光成像作為一種可以對生命體進(jìn)行無損成像方法得到了廣泛關(guān)注。雙光子成像更是因?yàn)楸尘盁晒獾?，光致?lián)p傷小，樣品穿透深度大，成像觀測時間長等獨(dú)特的優(yōu)勢在細(xì)胞和組織甚至活體成像中得到了廣泛的應(yīng)用。

1 雙光子激光掃描顯微鏡

1931年Maria G?eppert-Mayer提出分子可以同時吸收兩個光子被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，建立了雙光子成像的理論基礎(chǔ)[1]，這一光物理過程于1963年被Kaiser和Garret用實(shí)驗(yàn)證明。經(jīng)過了前期漫長的探索，也得益于工業(yè)技術(shù)發(fā)展，1990年Denk.Webb及其合作者成功的發(fā)明雙光子激光掃描顯微鏡[2]，開啟了3D活體成像的新篇章。

區(qū)別于傳統(tǒng)的單光子激光共聚焦成像技術(shù)，雙光子激光掃描顯微鏡利用兩個同時發(fā)射的近紅外區(qū)段的低能量的光子作為激發(fā)光源[3]，由于雙光子材料要同時吸收兩個光子以達(dá)到激發(fā)態(tài)，只有光通量最高的區(qū)域才能夠被成功的激發(fā)，這一特性使得雙光子顯微鏡擁有了局域性成像的性質(zhì)，有效的降低了背景熒光的干擾(圖1)。同時位于生物窗口(600～950 nm)的近紅外區(qū)段的長波激發(fā)也避免了生物大分子自發(fā)熒光的干擾 (血紅蛋白和組織色素的吸收和發(fā)射在紫外可見區(qū))，降低了光漂白和光損傷，使得生物材料可以長期的保持活性，可以為人們提供更長的觀測時間和更深的組織深度的成像信息。

圖1 單(a)/雙(b)光子熒光激發(fā)發(fā)射過程[3]Fig.1 The process of One(a)/Two(b)photon fluorescence excitation and emission[3]

1.1 雙光子吸收材料

具有雙光子吸收性能的材料是雙光子熒光成像的關(guān)鍵所在，隨著雙光子熒光顯微鏡的發(fā)展，大量的雙光子材料被設(shè)計和研究(圖2)，包括金納米材料[4]， 石墨烯材料[5]，有序納米硅材料[6]，有機(jī)量子點(diǎn)[7]，有機(jī)小分子[8]和聚合物[9]。

其中有機(jī)小分子熒光探針因易修飾，毒性低，細(xì)胞滲透快等特點(diǎn)得到了廣泛的關(guān)注，大量基于有機(jī)小分子骨架的熒光探針被合成和應(yīng)用。常用的小分子骨架包括(圖3)：苯并咪唑[10]，香豆素[11]，部花菁[12]，芴[13]，羅丹明[14]，喹啉[15]，吡唑硼[16]，苯并吡喃酮[17]，芘[18]，萘酰亞胺[19]，萘[20]，苯乙烯吡嗪[21]，哌洛寧[22]等，基于這些骨架，科研工作者基于的光物理過程和識別機(jī)理開展了大量的工作。

2 雙光子探針設(shè)計機(jī)理

常用的熒光探針構(gòu)建機(jī)理主要包括光致電子轉(zhuǎn)移(photo-induced electron transfer,PET)，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移 (intramolecular charge transfer,ICT)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence/F?rster resonance energy transfer,FRET)。近年來科研工作者又發(fā)現(xiàn)了跨鍵能量轉(zhuǎn)移 (through-bond energy transfer,TBET)，聚集誘導(dǎo)熒光發(fā)射 (aggregation-induced emission,AIE)，激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移 (excited-state intramolecular proton transfer，ESIPT)，碳氮雙鍵異構(gòu)化 (C=N isomerization)，共價聚集 (covalentassembly)等新的探針構(gòu)建機(jī)理，這些機(jī)理在熒光探針的設(shè)計中發(fā)揮著重要的作用。

圖2 具有雙光子吸收性能的材料Fig.2 Materials have two-photon absorption properties

2.1 光致電子轉(zhuǎn)移（PET）

光致電子轉(zhuǎn)移體系通常由熒光團(tuán)(flurescence)和識別基團(tuán)(receptor)兩部分通過非共軛連接的方式組成。基于前線軌道理論（圖4）[23]，當(dāng)分子中識別基團(tuán)可以提供一個空軌道，而該軌道的能級介于熒光團(tuán)的最高占有軌道(Highest Occupied Molecular Orbital,HOMO)和最低未占軌道能級 (Lowest Unoccupied Molecular Orbital, LUMO)之間，即可實(shí)現(xiàn)該過程，基于該機(jī)理設(shè)計的探針通常具有優(yōu)異的熒光off-on性質(zhì)。PET作為經(jīng)典的熒光探針設(shè)計機(jī)理，提出至今，已被廣泛的應(yīng)用于實(shí)踐中[24]。

2.2 分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）

分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移通常發(fā)生在同時具有吸電子基團(tuán)(A-acceptor)和給電子基團(tuán)(D-donor)的共軛體系中(D-π-A)，當(dāng)外界環(huán)境變化導(dǎo)致給電子（吸電子）基團(tuán)的給電子（吸電子）能力改變時，分子的電荷分布發(fā)生變化，其熒光性質(zhì)也會隨之產(chǎn)生相應(yīng)的變化（圖5）。基于該機(jī)理設(shè)計的探針通常擁有優(yōu)異的比率熒光性能，目前已有大量的研究被報道[25]。

2.3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）

1948年Theodor F?rster建立了熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程的理論基礎(chǔ)[26]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移是熒光團(tuán)之間的能量傳遞過程，這種非輻射的能量傳遞一般發(fā)生在分子間距離小于100 ?的兩個分子之間，以熒光素 (Fluorescein)和羅丹明(Rhdamine)的體系為例（圖6），能量供體熒光素(Donor)的發(fā)射光譜與受體羅丹明(Acceptor)的吸收光譜有一定的光譜重疊(Spectral Overlap)，體系被激發(fā)后，受體分子吸收由供體分子非輻射弛豫形式所發(fā)出的能量，完成該過程的能量傳遞，同時完成供體與受體分子之間的熒光信號的傳遞。由于可用于構(gòu)建FRET過程的能量供體和受體的資源非常豐富，所以大量基于該機(jī)理的探針被設(shè)計[27]。

2.4 跨鍵能量轉(zhuǎn)移（TBET）

跨鍵能量轉(zhuǎn)移也是一種兩個分子間非輻射的能量傳遞過程，于1987年由Verhoeven等首次提出[28]， 近年來得到了廣泛的關(guān)注與傳統(tǒng)的FRET過程不同，TBET不要求能量供體和受體之間的光譜重疊，而是通過共軛的方式將作為供體的熒光團(tuán)(Donor)和受體(Accepter)連接在一起，并保證供體與受體的空間扭轉(zhuǎn)，使其形成一個能量傳遞系統(tǒng)，而不是大共軛的平面分子（圖7），基于該機(jī)理構(gòu)建的探針通常擁有很好的比率熒光性能[29]。

圖3 常用的小分子雙光子骨架（1-苯并咪唑[10]，2-香豆素[11]，3-部花菁[12]，4-芴[13]，5-羅丹明[14]，6-喹啉[15]，7-吡唑硼[16]，8-苯并吡喃酮[17]，9-芘[18]，10-萘酰亞胺[19]，11-萘[20]，12-苯乙烯吡嗪[21]，13-哌洛寧[22]）Fig.3 Commonly used small molecule two-photon skeleton(1-benzene and imidazole[10],2-coumarin[11],3-hemicyenine[12],4-fluorene[13],5-rhodamine[14],6-quinoline[15],7-pyrazole boron[16],8-benzo pyran ketone[17],9-pyrene[18],10-naphthalene imide[19],11-naphthalene[20],12-styrene pyrazine[21],13-pp doronin[22])

圖4 PET機(jī)理[24]Fig.4 The principle of PET[24]

圖5 ICT機(jī)理Fig.5 The principle of ICT

圖6 FRET機(jī)理[27]Fig.6 The principle of FRET[27]

圖7 TBET機(jī)理Fig.7 The principle of TBET

2.5 聚集誘導(dǎo)熒光發(fā)射（AIE）

聚集誘導(dǎo)熒光發(fā)射是2001年由唐本忠課題組發(fā)現(xiàn)的光物理現(xiàn)象。通常情況下，聚集態(tài)的ππ堆積會引起熒光分子(Pyrene)的熒光淬滅，該現(xiàn)象被稱為聚集誘導(dǎo)熒光淬滅 (aggregation-caused quenching，ACQ)，而具有AIE性質(zhì)的分子(HPS)與傳統(tǒng)的熒光分子不同，在非聚集態(tài)下由于分子內(nèi)苯環(huán)的快速旋轉(zhuǎn)，其激發(fā)態(tài)的能量通過非輻射的形式弛豫無熒光，而當(dāng)外界環(huán)境的改變使苯環(huán)的自由旋轉(zhuǎn)被禁阻時，分子會發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光（圖8）[30]，這一特殊的性質(zhì)使AIE得到了廣泛的應(yīng)用[31]。

2.6 激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）

圖8 AIE機(jī)理[30]Fig.8 The principle of AIE[30]

圖9 ESIPT機(jī)理[25]Fig.9 The principle of ESIPT[25]

圖10 C=N異構(gòu)化機(jī)理[34]Fig.10 The principle of C=N isomerization[34]

激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移于1973年由Sengupta和Kasha首次提出[32]，是指處于激發(fā)態(tài)的分子內(nèi)部鄰近質(zhì)子供體與質(zhì)子受體之間的質(zhì)子轉(zhuǎn)移過程（圖9），該過程主要發(fā)生于羥基上的氫到羧基上的氧或氨基上的氫到亞氨基上的氮之間，通過分子內(nèi)氫鍵形成五/六元環(huán)來實(shí)現(xiàn)，激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移完成后，回到基態(tài)的分子再由酮(keto-form)異構(gòu)化回到醇(enol-form)的結(jié)構(gòu)。ESIPT過程的實(shí)現(xiàn)，一般要求質(zhì)子供體和受體之間的距離小于2?，經(jīng)歷了這一過程的分子，通常紫外吸收性質(zhì)不變，而熒光性質(zhì)發(fā)生巨大變化。因質(zhì)子轉(zhuǎn)移有速度快（1-10皮秒）[33]，斯托克斯位移(Stokes shift)大的特點(diǎn)，和顯著的基態(tài)激發(fā)態(tài)分子互變異構(gòu)的雙熒光特性，ESIPT被廣泛的應(yīng)用于熒光探針的設(shè)計中[25]。

2.7 碳氮雙鍵異構(gòu)化（C=N異構(gòu)化）

C=N異構(gòu)化作為一種新型探針設(shè)計機(jī)理，2007年，汪鵬飛等首次報道[34]，通過對化合物構(gòu)象受限的光物理過程研究，發(fā)現(xiàn)C=N異構(gòu)化是一個非常重要的激發(fā)態(tài)弛豫過程，由于C=N快速的異構(gòu)化，通常會導(dǎo)致含有此官能團(tuán)的熒光骨架無熒光，而當(dāng)C=N的異構(gòu)化被抑制，分子則會恢復(fù)原有的熒光發(fā)射(圖10)。近年來已有大量的基于該機(jī)理的探針被設(shè)計[35]。

2.8 共價聚集

2010年Anslyn等首次報道了新型的熒光探針NO550用以檢測生物體內(nèi)的一氧化氮(NO)，該探針基于共價聚集的機(jī)理設(shè)計，通過一氧化氮與氨基形成重氮鍵誘導(dǎo)的熒光信號的改變來完成NO的識別(圖11)[36]。2014年Lv X等以氟硼吡咯為熒光骨架基于這一機(jī)理構(gòu)建了NO探針，并將其成功的應(yīng)用于NO的細(xì)胞成像[37]。楊有軍等在2015年分別報道了可以應(yīng)用于細(xì)胞成像的aBCLs系列熒光染料和檢測亞硝酸鈉的探針NT550，進(jìn)一步拓展了共價聚集機(jī)理的平臺[38]。

3 雙光子熒光探針的應(yīng)用

近年來熒光探針得到了蓬勃的發(fā)展，該文課題組在這方面也展開了一些研究[39-48]。對于在生命體系成像研究中的具有巨大優(yōu)勢的雙光子熒光探針也進(jìn)行了一些探索，該文結(jié)合前期的工作以及相關(guān)研究就近兩年發(fā)表的雙光子熒光探針進(jìn)行簡要的介紹[49]。

3.1 雙光子pH探針

圖11 共價聚集的機(jī)理[36]Fig.11 The principle of covalent assemble[36]

細(xì)胞內(nèi)的pH水平是反映細(xì)胞新陳代謝過程的重要參數(shù)，正常的生理條件下細(xì)胞內(nèi)液的pH約為7.2，線粒體內(nèi)pH約為8.0，溶酶體為4.0～5.5。pH的變化與細(xì)胞間的信號傳遞，細(xì)胞增殖與凋亡，酶的活性，腫瘤生長都有著密切的關(guān)系。pH水平的異常會引起細(xì)胞功能的障礙，甚至誘發(fā)各種疾病[50]。建立有效的監(jiān)控細(xì)胞和組織內(nèi)pH變化的雙光子熒光探針可以更好的了解pH值在生命體內(nèi)扮演的角色。

2015年Kim小組基于ICT機(jī)理，以2-萘酚的衍生物為熒光骨架，建立了探針1(圖12)，探針1通過酚羥基的去質(zhì)子化作用實(shí)現(xiàn)對pH變化的響應(yīng)，在pH6～pH9的變化范圍內(nèi)，探針展示了從黃色到紅色的發(fā)射光譜變化，可以有效的定量的監(jiān)控線粒體內(nèi)的pH變化[51]。

3.2 雙光子離子探針

離子在生命體的生理和病理過程中起著重要作用，對于其含量和分布的研究一直是科研工作者關(guān)注的領(lǐng)域[52]。

鋅作為人體的必需微量元素，在人體的生長發(fā)育、免疫、內(nèi)分泌等生理過程中起著極其重要的作用，其含量異常會引起細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致糖尿病，前列腺癌，帕金森病，阿茨海默癥等諸多疾病[53]。2016年，Ahn等報道了基于PET機(jī)理設(shè)計的雙光子鋅離子探針2(圖13)，該探針以萘酰亞胺作為熒光骨架，N,N-二(2-吡啶甲基)乙二胺為識別基團(tuán)（配體），實(shí)現(xiàn)了溶酶體內(nèi)鋅離子的檢測，并成功的應(yīng)用于鼠腦組織中鋅離子的雙光子成像[54]。

圖13 鋅離子探針2及其識別機(jī)理圖[54]Fig.13 The molecular structure and recognition mechanism of probe 2[54]

鈀作為第五周期Ⅷ族鉑系元素的成員，是航天、核工業(yè)以及汽車制造業(yè)不可缺少的關(guān)鍵材料。鈀的攝入可以對人體的皮膚和眼睛造成刺激，同時由于鈀與DNA、蛋白質(zhì)以及其他的生物大分子間強(qiáng)烈的親和作用，會造成細(xì)胞功能的紊亂[55]。近期，譚蔚泓課題組報道了一種新型的雙光子比率熒光探針3用于生物體內(nèi)的鈀離子成像研究(圖14)[24]，該探針以TBET為設(shè)計機(jī)理，將熒光團(tuán)萘和羅丹明染料相連接，形成一個Np-Rh-Pd的能量傳遞體系，當(dāng)時鈀離子存在時，羅丹明開環(huán)與鈀離子形成氫鍵，同時與萘進(jìn)行快速的能量傳遞，完成比率熒光檢測過程，探針3被成功的應(yīng)用于細(xì)胞和組織(90~270 μm)的鈀離子成像研究。

圖14 鈀離子探針3及其識別機(jī)理圖[24]Fig.14 The molecular structure and recognition mechanism of probe 3[24]

氟離子與生命體的諸多生理和病理過程息息相關(guān)[56]。2015年，該文課題組報道了以萘酰亞胺為熒光骨架的探針4(圖15)[39]，基于氟與硅的親和作用對氟離子進(jìn)行特異性的識別。當(dāng)探針與氟離子作用時，探針的硅氧鍵被切斷，脫掉叔丁基苯基硅基，實(shí)現(xiàn)對氟離子的檢測。該探針被成功應(yīng)用于細(xì)胞和組織內(nèi)的氟離子的成像。

圖15 氟離子探針4及其識別機(jī)理圖[39]Fig.15 The molecular structure and recognition mechanism of probe 4[39]

3.3 雙光子巰基小分子、硫化氫探針

小分子巰基化合物在生命過程中扮演著重要的角色[57]。2016年該文課題組報道了反應(yīng)型的雙光子off-on探針5(圖16)[40]，探針基于光PET機(jī)理構(gòu)建，以哌嗪基團(tuán)連接熒光團(tuán)萘酰亞胺(NAP)和對巰基具有優(yōu)越的識別性能的2,4-二硝基苯磺酰基(NBDS)。由于2,4-二硝基苯磺?；膹?qiáng)吸電子性能破壞了萘酰亞胺熒光團(tuán)的電子分布，探針分子的熒光被淬滅。而當(dāng)探針與含有巰基的被分析物作用后，2,4-二硝基苯磺酰基與哌嗪相連的S-N鍵被切斷，生成具有強(qiáng)烈的熒光發(fā)射的N-butyl-naphthalimide(NAP-P)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明探針Z1可以被應(yīng)用于生物的細(xì)胞和組織中的巰基成像研究。

圖16 巰基探針5及其識別機(jī)理圖[40]Fig.16 The molecular structure and recognition mechanism of probe 5[40]

同年，基于PET機(jī)理，該文課題組以萘酰亞胺作為電子供體和熒光團(tuán)，順丁烯二酰亞胺作為電子受體和識別基團(tuán)設(shè)計并合成了巰基探針6 (o-Z3,m-Z3和p-Z3)7(圖17)[41]。通過巰基與順丁烯二酰亞胺的雙鍵之間的邁克加成作用，來調(diào)節(jié)電子轉(zhuǎn)移的發(fā)生，從而調(diào)控萘酰亞胺熒光團(tuán)的熒光性質(zhì)。探針可以應(yīng)用于血漿中的巰基含量的測定及細(xì)胞成像研究，此外，該文課題組結(jié)合密度泛函理論對于探針的設(shè)計給出了計算化學(xué)領(lǐng)域的理論支撐。

圖17 巰基探針6及其識別機(jī)理圖[41]Fig.17 The molecular structure and recognition mechanism of probe 6[41]

H2S作為一種重要的氣體信標(biāo)物質(zhì)參與了大量的生理和病理過程，研究表明其在血管生成，神經(jīng)調(diào)節(jié)，細(xì)胞凋亡的過程起著重要的作用[58]。2015年Ahn等以萘作為熒光骨架，改進(jìn)了邁克加成機(jī)理，設(shè)計了對H2S具有高靈敏度和特異性的比率型雙光子熒光探針7(圖18)，并將其成功的應(yīng)用于細(xì)胞和組織中H2S的成像[59]。

2016年趙寶祥課題組以香豆素和部花箐兩個熒光骨架構(gòu)建了新的FRET平臺(圖19)，并將其用于H2S的檢測，探針8表現(xiàn)出了優(yōu)越的FRET性能，并且可以成功的比率熒光成像線粒體中的H2S[60]。

3.4 雙光子活性氧探針（ROS）和活性氮探針（RNS）

圖18 H2S探針7及其識別機(jī)理圖[59]Fig.18 The molecular structure and recognition mechanism of probe 7[59]

圖19 H2S探針8及其識別機(jī)理圖[60]Fig.19 The molecular structure and recognition mechanism of probe 8[60]

生物體內(nèi)的活性氧類物質(zhì)會引起細(xì)胞損傷，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，引發(fā)各種疾病，導(dǎo)致機(jī)體的衰老[61]。2015年唐波課題組設(shè)計雙光子過氧陰離子探針9(圖20)[21]，探針以苯乙烯吡嗪為熒光骨架，在其末端共軛連接兩個識別基團(tuán)二羥基桂皮酸，當(dāng)探針與過氧陰離子作用后，羥基被氧化成酮羰基，探針的雙光子吸收截面明顯增大，熒光增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對過氧陰離子的檢測。探針可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和組織(900 μm)中的過氧陰離子成像，并被成功的應(yīng)用于線蟲和小鼠體內(nèi)的過氧陰離子含量與其壽命關(guān)系的研究。

過氧亞硝酸根離子作為生物體內(nèi)的一種強(qiáng)氧化劑，參與了生命體的氧化還原信號傳遞，免疫應(yīng)答等諸多的生理和病理過程，其含量的升高通常與代謝紊亂，血管疾病，甚至癌癥有關(guān)[62]。 2016年Kim和Hong等報道了基于PET機(jī)理設(shè)計的雙光子過氧亞硝酸根離子探針10 (圖21)，探針以萘為熒光骨架，N-甲基苯酚為識別基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)探針與過氧亞硝酸根離子作用后，苯酚結(jié)構(gòu)被剪切，探針分子的熒光恢復(fù)[63]。

圖21 過氧亞硝酸根離子探針10及其識別機(jī)理圖[63]Fig.21 The molecular structure and recognition mechanism of probe 10[63]

3.5 雙光子生物大分子探針

研究表明組織缺氧在中風(fēng)，心臟病等疾病的發(fā)生過程中扮演著重要的角色，同時惡性腫瘤的增生通常也會引起組織的缺氧，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的硝基還原酶(NTR)的過表達(dá)[64]，因此可以通過檢測硝基還原酶的含量變化間接地實(shí)現(xiàn)對組織含氧量的測定。2016年譚蔚泓課題組基于PET機(jī)理，以萘為熒光骨架，硝基為響應(yīng)位點(diǎn)，設(shè)計了探針11 (圖22)，在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)存在的情況下，探針的硝基被NTR還原成氨基，隨后通過1,6-重排消除釋放熒光團(tuán)，熒光恢復(fù)，以實(shí)現(xiàn)對硝基還原酶的識別，間接反映生命體組織含氧量[65]。該探針首次成功的實(shí)現(xiàn)了對生物細(xì)胞和組織(70～160 μm)中的含氧量的雙光子成像研究。

圖22 硝基還原酶探針11及其識別機(jī)理圖[65]Fig.22 The molecular structure and recognition mechanism of probe 11[65]

4 展望

雙光子熒光成像在生物體的細(xì)胞，組織及活體成像的研究中有著其他成像方法無可比擬的優(yōu)勢。隨著雙光子技術(shù)的進(jìn)一步完善，雙光子熒光成像已經(jīng)成為了不可或缺的探究生命奧秘的手段，雖然迄今已經(jīng)有大量的雙光子探針被設(shè)計和研究，但是相對應(yīng)單光子成像探針的深入性研究，雙光子探針的研究仍然具有廣闊的空間和巨大的潛力。建立雙光子吸收性能好，靈敏度高，選擇性好，光物理性質(zhì)穩(wěn)定的探針依然被迫切的需要。同時現(xiàn)存的探針大多存在成像功能單一的缺點(diǎn)，單一的成像已經(jīng)不能滿足現(xiàn)今的科研需求，進(jìn)一步的建立具有多功能的雙光子探針勢在必行。該文課題組認(rèn)為下一步的研究可以從以下幾個方面入手：1、構(gòu)建集成化的探針，實(shí)現(xiàn)單一探針的多分子識別成像，通過不同的成像信號，完成多分子的識別研究。2、探針與藥物結(jié)合實(shí)現(xiàn)檢測治療一體化，通過探針信號的變化實(shí)現(xiàn)藥物治療效果的可視化甚至是可控化的研究。3、小分子的探針仍然需要外界光源激發(fā)才能觀察到的問題，這對于生命活動的可視化檢測仍然存在一定的掣肘，因此可以考慮將小分子探針與長輝光材料相結(jié)合，構(gòu)建可以一次激發(fā)長時間監(jiān)測的探針材料，進(jìn)一步對生命體系進(jìn)行探究。

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Synthesis and application of two-photon fluorescent probes based on naphthalimide

Zhu Xin-yue,Zhang Hai-xia*
(State Key Laboratory of Applied Organic Chemistry,Key Laboratory of Nonferrous Metals Chemistry and Resources Utilization of Gansu Province,College of Chemistry and Chemical Engineering,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)

Biological imaging technology as the best noninvasive way to study living systems in a natural setting has obtained widespread attention in recent years.Two-photon fluorescence microscope has become the indispensable tool in the field of biological imaging due to the advantages of high signal-to-noise ratio,localized excitation,deeper tissue penetration,less photodamage,prolonged observation time,and better three-dimensional imaging.TP fluorescent probes as the render of fluorescent signals play key roles in two-photon imaging.So far,there are many of the two-photon imaging material have been reported,among which two-photon fluorescent probes based on organic small molecular have been development vigorous owning the good cell permeability,fast imaging,high specificity and easy modification.We summarized the studies of imaging by two-photon fluorescence probe in nearly two years, and the prospect of the development of two-photon fluorescence probes was given.

two-photon;probes;imaging

國家自然科學(xué)面上基金項目（21575055,21375052）

*通信聯(lián)系人,E-mail:zhanghx@lzu.edu.cn，Tel.:Fax:0931-8912058