云南松根葉及林內(nèi)土壤的碳酸酐酶活性分析

王曉麗 曹子林 和潤(rùn)喜 陳 詩(shī)

（1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明650224；2.西南林業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明650224）

云南松根葉及林內(nèi)土壤的碳酸酐酶活性分析

王曉麗1曹子林2和潤(rùn)喜1陳 詩(shī)1

（1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明650224；2.西南林業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明650224）

從9株云南松林木上分單株取樣，通過(guò)測(cè)定云南松針葉（鮮葉、枯葉）、根以及林內(nèi)土壤（根際土壤、非根際土壤）的碳酸酐酶活性，分析了云南松不同器官及林內(nèi)土壤碳酸酐酶活性的變化情況、差異性及其相關(guān)性。結(jié)果表明：云南松不同器官及林內(nèi)土壤碳酸酐酶活性變化規(guī)律為鮮葉＞枯葉＞根＞林內(nèi)土壤，林內(nèi)根際土壤和非根際土壤的碳酸酐酶活性變化規(guī)律存在一定差異；不同單株云南松鮮葉的碳酸酐酶活性保持相對(duì)穩(wěn)定，且枯葉、根、根際土壤、非根際土壤的碳酸酐酶活性皆存在與鮮葉相似的變化規(guī)律；云南松不同器官與林內(nèi)土壤間碳酸酐酶活性皆存在極顯著差異；云南松鮮葉、枯葉、根、根際土壤、非根際土壤的碳酸酐酶活性?xún)蓛芍g皆存在極顯著的相關(guān)性，因此云南松有利于林內(nèi)土壤中碳酸酐酶的積累。

云南松；碳酸酐酶；針葉；根；林內(nèi)土壤

碳酸酐酶是一種含Zn的金屬酶，能有效地催化CO2的可逆水合反應(yīng)［1-2］。巖溶地質(zhì)學(xué)提出H＋作為碳酸鹽巖溶解的侵蝕劑促使CO2向H＋和HCO3-轉(zhuǎn)換是碳酸鹽巖風(fēng)化的第一步，此反應(yīng)可能是碳酸鹽巖溶解速率的決定因素，而碳酸酐酶正是該反應(yīng)專(zhuān)一的生物催化劑［3］。

關(guān)于植物碳酸酐酶的研究，目前主要集中在低等植物微囊藻（Microcystis aeruginosa；Microcystis viridis；Microcystiswesenbergii）［4］、東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）、微小卡羅藻（Karlodinium micrum）［5］，農(nóng)作物玉米（Zea mays）［6］、水稻（Oryza sativa）［7］，蔬菜諸葛菜（Orychophragmus violaceus）、油菜（Brassica campestris）［8］等方面，林木碳酸酐酶的研究較少，且關(guān)于植物碳酸酐酶的研究主要集中在碳酸酐酶與植物光合固碳能力相關(guān)性等方面。施倩倩等［9］以構(gòu)樹(shù)（Broussonetia papyrifera）和桑樹(shù)（Morus alba）上部葉片為材料，測(cè)定其碳酸酐酶及碳酸酐酶胞外酶活力，結(jié)果表明，構(gòu)樹(shù)的碳酸酐酶及碳酸酐酶胞外酶活力明顯高于桑樹(shù)；范怡雯等［10］采用不同濃度的Zn、Cu、Ca溶液對(duì)華山松（Pinus armandii）、滇楊（Populus yunnanensis var.microphylla）、白櫟（Quercus fabri）等1年生幼苗進(jìn)行處理，測(cè)定不同處理下各植物的碳酸酐酶活性、葉綠素含量及熒光參數(shù)的變化，并分析其光合固碳能力，結(jié)果顯示適量施用Zn、Cu、Ca能夠提高植物的碳酸酐酶活性和光合固碳能力；曾憲東等［11］以西南巖溶地區(qū)黃荊（Vitex negundo）為材料，研究其碳酸酐酶的穩(wěn)定性，結(jié)果表明其碳酸酐酶具有較好的熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。

云南松（Pinus yunnanensis）天然林分布較廣，東至貴州畢節(jié)、水城及廣西西部百色地區(qū)，北達(dá)四川西南的大渡河、瀘定及天全以南，西至西藏東南部的察隅，云南大多數(shù)地區(qū)均有分布，尤以金沙江中游、南盤(pán)江下游最為密集［12-13］。云南是中國(guó)巖溶分布最廣的省區(qū)之一，巖溶主要分布在滇東南、滇東和滇中高原［14］。云南巖溶分布的主要區(qū)域同時(shí)也是云南松天然林的主要分布區(qū)之一。由此可見(jiàn)，云南松對(duì)巖溶區(qū)的生態(tài)環(huán)境具有適生性。

云南松體內(nèi)碳酸酐酶的活性和分布情況及其與周?chē)寥乐刑妓狒富钚缘南嚓P(guān)性是研究云南松對(duì)巖溶區(qū)生態(tài)環(huán)境適生性的基礎(chǔ)。目前，針葉用材樹(shù)種碳酸酐酶活性與周?chē)寥乐刑妓狒富钚韵嚓P(guān)性的研究較少，本試驗(yàn)以云南松為試材，研究其針葉（鮮葉和枯葉）、根、林內(nèi)土壤之間碳酸酐酶活性的相關(guān)性，為認(rèn)識(shí)云南松對(duì)土壤中碳酸酐酶的貢獻(xiàn)情況及為評(píng)價(jià)云南松碳酸酐酶在生物巖溶中的作用和地位提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

試驗(yàn)材料全部取自西南林業(yè)大學(xué)樹(shù)木園22年生云南松林中，分單株分別采集9株云南松的鮮葉、枯葉、根、根際土壤和非根際土壤，帶回實(shí)驗(yàn)室，備用。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集 在云南松林中，設(shè)3個(gè)10m×10 m的典型樣地，每個(gè)樣地按S形路線確定3株樣樹(shù)，分別采集每株樣樹(shù)的鮮葉、枯葉、根系、根際土壤和非根際土壤。每株樣樹(shù)從4個(gè)方向取新鮮針葉混合作為該株的樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。每株樣樹(shù)以樹(shù)干基部為圓心，以1m為半徑，收集該范圍內(nèi)的枯落葉，并將其混合作為該株的樣品池，帶回實(shí)驗(yàn)室，備用。

每株樣樹(shù)下按不同方向設(shè)4個(gè)取樣點(diǎn)，先用鐵鏟除去枯枝落葉層，然后用鐵鎬和鐵锨小心沿樹(shù)干基部開(kāi)始挖去上層覆土，逐段逐層地沿側(cè)根生長(zhǎng)方向追蹤，找到須根部分，剪下分枝，小心將須根部分帶土取出，用小刀將距根2 mm以上的土壤輕輕剝離作為非根際土收集，抖落其余土壤作為根際土并用小毛刷將無(wú)法抖落沾附在根上的土輕輕刷下一并裝入土袋，每株樣樹(shù)將4個(gè)取樣點(diǎn)的土壤混合作為1個(gè)樣品，將混合樣帶回實(shí)驗(yàn)室處理［15］。同時(shí)將每株樣樹(shù)4個(gè)取樣點(diǎn)剪下并收集完土壤樣品的須根混合作為該株的根系樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室，備用。

1.2.2 碳酸酐酶提取 每株樣樹(shù)取鮮葉、枯葉、須根、根際土壤和非根際土壤各4 g，分別剪碎（土壤樣品無(wú)需剪碎）放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮，再加入12mL巴比妥提取緩沖液（10 mmol/L，含巰基乙醇50mmol/L，pH 8.3）進(jìn)行研磨，將研磨液倒入10 mL離心管中，置于冰浴中20 min后，在5 000 r/min下離心10min，取上清液，冷藏待測(cè)［8，11］。

1.2.3 碳酸酐酶活性測(cè)定 云南松樣品和土壤樣品碳酸酐酶活性的測(cè)定皆采用pH計(jì)法。保持反應(yīng)系統(tǒng)在0～2℃，取待測(cè)粗提液0.5 mL，加入到含15 mL的巴比妥緩沖液（20 mmol/L，pH 8.3）的反應(yīng)容器中，然后迅速加入10 mL預(yù)冷的（0～2℃）飽和CO2蒸餾水，用pH電極監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系pH值的變化，記下pH下降1個(gè)單位（8.3至7.3）所需時(shí)間，記為te，同時(shí)記錄同一樣品在酶失活條件下pH下降1個(gè)單位所需的時(shí)間，記為t0，酶的活性用WA-unit表示［15-16］。WA=（te/t0-1）。酶相對(duì)活性：（活性/對(duì)照活性）×100%。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析和多重比較以及相關(guān)性分析［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同器官及土壤碳酸酐酶活性變化分析

分別對(duì)9株云南松不同器官及林內(nèi)土壤碳酸酐酶活性進(jìn)行測(cè)定和分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示：9株云南松不同器官及林內(nèi)土壤碳酸酐酶活性變化規(guī)律皆為鮮葉＞枯葉＞根＞林內(nèi)土壤，林內(nèi)土壤中根際土壤和非根際土壤的碳酸酐酶活性變化規(guī)律存在一定的差異，其中2株根際土壤＞非根際土壤，5株根際土壤＜非根際土壤，2株根際土壤=非根際土壤，這可能與不同單株樹(shù)下枯落葉的數(shù)量有關(guān)，樹(shù)下枯落葉多的單株，枯落葉釋放到土壤的碳酸酐酶的數(shù)量較多，導(dǎo)致根際土壤的碳酸酐酶活性等于或小于非根際土壤。

不同單株的云南松鮮葉的碳酸酐酶活性存在一定差異，但是差別不大，可見(jiàn)不同單株之間鮮葉的碳酸酐酶活性保持相對(duì)穩(wěn)定。9株云南松鮮葉的碳酸酐酶活性最大為1.55 U/mL，最小為1.02 U/ mL，最大與最小值之間相差0.53 U/mL。不同單株的云南松枯葉、根、根際土壤、非根際土壤的碳酸酐酶活性皆存在與鮮葉相同的差異變化規(guī)律。

2.2 不同器官及土壤碳酸酐酶活性方差分析

云南松鮮葉、枯葉、根、根際土壤、非根際土壤的碳酸酐酶活性間存在極顯著的差異（P=0＜0.01）。對(duì)云南松鮮葉、枯葉、根、根際土壤和非根際土壤碳酸酐酶活性進(jìn)行多重比較見(jiàn)表1。

表1 云南松不同器官及林內(nèi)土壤碳酸酐酶活性多重比較Tab.1 Multiple comparisons of carbonic anhydrase in different organs and forest soil of P.yunnanensis

表1結(jié)果表明：鮮葉與枯葉、根、根際土壤、非根際土壤間皆存在極顯著差異，枯葉與根、根際土壤、非根際土壤間皆存在極顯著差異，根與根際土壤、非根際土壤間皆存在極顯著差異，根際土壤與非根際土壤間無(wú)顯著差異，云南松不同器官與林內(nèi)土壤間碳酸酐酶活性皆存在極顯著差異。

2.3 不同器官及土壤碳酸酐酶活性相關(guān)分析

云南松鮮葉、枯葉、根、根際土壤、非根際土壤的碳酸酐酶活性?xún)蓛芍g皆存在極顯著的相關(guān)性（表2）。結(jié)果表明：云南松鮮葉、枯葉、根中皆含有一定量的碳酸酐酶，鮮葉脫落和枯葉腐爛分解以及根的生長(zhǎng)和延伸過(guò)程，可將碳酸酐酶釋放到林內(nèi)土壤中，有利于林內(nèi)土壤中碳酸酐酶的積累。

表2 云南松不同器官及林內(nèi)土壤碳酸酐酶活性相關(guān)性分析Tab.2 The correlation analysis of carbonic anhydrase activity in differentorgans and forest soil of P.yunnanensis

3 結(jié)論與討論

植物中碳酸酐酶的研究大多數(shù)還停留在碳酸酐酶與光合固碳關(guān)系以及碳酸酐酶活性的影響因素等方面，隨著學(xué)科的交叉融合和研究的不斷深入，尤其是在發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶在催化碳酸鹽巖地區(qū)的二氧化碳的可逆水合反應(yīng)之后，一些學(xué)者開(kāi)始致力于植物對(duì)碳酸鹽巖生境的適生性機(jī)制以及植物的生物巖溶作用等方面的研究。本試驗(yàn)對(duì)22年生的9株云南松林木針葉（鮮葉和枯葉）、根、林內(nèi)土壤中碳酸酐酶活性進(jìn)行測(cè)定并作相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：9株云南松不同器官及林內(nèi)土壤碳酸酐酶活性變化規(guī)律皆為鮮葉＞枯葉＞根＞林內(nèi)土壤，林內(nèi)土壤中根際土壤和非根際土壤的碳酸酐酶活性變化規(guī)律存在一定的差異。不同單株的云南松鮮葉的碳酸酐酶活性保持相對(duì)穩(wěn)定，且不同單株的云南松枯葉、根、根際土壤、非根際土壤的碳酸酐酶活性皆存在與鮮葉相似的變化規(guī)律。方差分析顯示云南松不同器官與林內(nèi)土壤間碳酸酐酶活性皆存在極顯著差異。相關(guān)性分析顯示云南松鮮葉、枯葉、根、根際土壤、非根際土壤的碳酸酐酶活性?xún)蓛芍g皆存在極顯著的相關(guān)性，云南松有利于林內(nèi)土壤中碳酸酐酶的積累。

本研究為進(jìn)一步探索云南松對(duì)土壤中碳酸酐酶的貢獻(xiàn)情況奠定了一定基礎(chǔ)，今后可開(kāi)展云南松林內(nèi)土壤微生物碳酸酐酶活性方面的研究以及田間可控條件下云南松與土壤中碳酸酐酶活性相關(guān)性的研究，將林內(nèi)研究與田間可控條件下的研究相結(jié)合，分析云南松對(duì)巖溶生態(tài)的適生對(duì)策，從而指導(dǎo)云南松天然林的經(jīng)營(yíng)管理，并為更好地恢復(fù)石漠化區(qū)云南松人工植被提供定向培育的理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)，同時(shí)豐富我國(guó)巖溶生態(tài)系統(tǒng)良性生態(tài)恢復(fù)的研究。

［1］ Tripp B C，Sm ith K，F(xiàn)erry J G.Carbonic anhydrase：new insights for an ancient enzyme［J］.J Biol Chem，2001，276：48615-48618.

［2］ Cronk J D，Endrizzi J A，Cronk M R，et al.Crystal structure of E.coli alpha-carbonic anhydrase，an enzyme with an unusual pH-dependent activity［J］.Protein Sci，2001，10：911-922.

［3］ 曾憲東.植物碳酸酐酶對(duì)石灰?guī)r巖溶的驅(qū)動(dòng)作用研究［D］.武漢：華中科技大學(xué)，2004.

［4］ 王山杉，劉永定，鄒永東，等.微囊藻碳酸酐酶活性在不同環(huán)境因素下的調(diào)節(jié)與適應(yīng)［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26（8）：2443-2448.

［5］ 戴芳芳，周成旭，嚴(yán)小軍，等.pH及光照對(duì)兩種赤潮甲藻種群生長(zhǎng)和胞外碳酸酐酶活性的影響［J］.海洋環(huán)境科學(xué)，2011，30（5）：694-698.

［6］ 胥獻(xiàn)宇.不同光照條件下玉米碳酸酐酶活性差異比較與分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（33）：18684-18688.

［7］ 陳雄文.不同環(huán)境條件下水稻葉片中葉綠體內(nèi)碳酸酐酶活性的變化［J］.湖北師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2000，20（4）：40-42.

［8］ 吳沿友，李西騰，郝建朝，等.不同植物的碳酸酐酶活力差異研究［J］.廣西植物，2006，26（4）：366-369.

［9］ 施倩倩，吳沿友，朱詠莉，等.構(gòu)樹(shù)與桑樹(shù)葉片的碳酸酐酶胞外酶活力比較［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（16）：8376-8377.

［10］ 范怡雯，喻理飛，蔡國(guó)俊，等.鋅、銅、鈣對(duì)植物碳酸酐酶及熒光特性的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（9）：32-35，64.

［11］ 曾憲東，余龍江，李為，等.西南巖溶地區(qū)黃荊葉片碳酸酐酶的穩(wěn)定性［J］.植物學(xué)通報(bào)，2005，22（2）：169-174.

［12］ 蔡年輝，李根前.云南松天然林區(qū)植物群落結(jié)構(gòu)的空間動(dòng)態(tài)研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2006，26（10）：2119-2124.

［13］ 金振洲，彭鑒.云南松［M］.昆明：云南科技出版社，2004：432-439.

［14］ 谷勇，陳芳，李昆，等.云南巖溶地區(qū)石漠化生態(tài)治理與植被恢復(fù)［J］.科技導(dǎo)報(bào)，2009，27（5）：75-80.

［15］ 沈有信，周文君，劉文耀，等.云南松根際與非根際磷酸酶活性與磷的有效性［J］.生態(tài)環(huán)境，2005，14（1）：91-94.

［16］ 徐仲安，王天保，李常英，等.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法簡(jiǎn)介［J］.科技情報(bào)開(kāi)發(fā)與經(jīng)濟(jì)，2002，12（5）：148-150.

（責(zé)任編輯 張 坤）

The Correlation Analysis of Carbonic Anhydrase Activity in Needles，Roots and Forest Soil of Pinus yunnanensis

Wang Xiaoli1，Cao Zilin2，He Runxi1，Chen Shi1
（1.College of Forestry，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China；2.College of Environmental Science and Engineering，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China）

To analyze the change，difference and correlation of carbonic anhydrase activity in different organs and forest soil，different needles（fresh leaves，dead leaves），roots and forest soil（rhizosphere soil，non rhizosphere soil）of 9 single plants of P.yunnanensis were analyzed.The results showed that the carbonic anhydrase activity change lawswere fresh leaves＞dead leaves＞roots＞forest soil，but the carbonic anhydrase activity change laws of rhizosphere soil and non rhizosphere soil had some differences；the carbonic anhydrase activity of fresh leaves in different individual of P.yunnanensis remained relatively stable，and the carbonic anhydrase activity of dead leaves，roots，rhizosphere soil and non rhizosphere soil in different individual of P.yunnanensis remained relatively stable with being similar to the fresh leaves；the carbonic anhydrase activity of P.yunnanensis were extremely differentwith different organs and forest soil；the carbonic anhydrase activity of P.yunnanensis were extremely correlated with fresh leaves，dead leaves，roots，rhizosphere soil and non rhizosphere soil.Accordingly，P. yunnanensis was conducive to the accumulation of carbonic anhydrase in forest soil.

Pinus yunnanensis；carbonic anhydrase；needles；roots；forest soil

S714.5

A

2095-1914（2016）02-0031-04

10.11929/j.issn.2095-1914.2016.02.005

2015-09-20

云南省高校優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科（生態(tài)學(xué)）建設(shè)項(xiàng)目資助。

第1作者：王曉麗（1976—），女，副教授。研究方向：森林培育。Email：1144607944@qq.com。