手性藥物與生物大分子相互作用中對(duì)映選擇性的表征方法研究進(jìn)展

盧藍(lán)藍(lán)， 陳佳虹， 劉英菊， 肖治理， 張熾堅(jiān)， Sergei A Eremin， 孫遠(yuǎn)明， 雷紅濤*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，生物材料研究所，廣東廣州 510642；3.A.N.Bach Institute of Biochemistry,Russian Academy of Sciences,Moscow,Russia 119071)

1 引言

藥物小分子與生物大分子相互作用的研究是化學(xué)生物學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容。生物大分子的分子量較大，結(jié)構(gòu)也比較復(fù)雜，它們往往與一些特異性小分子(配體)結(jié)合，將引起蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域的構(gòu)象變化，從而影響其他區(qū)域的構(gòu)象[1，2]。在藥物領(lǐng)域中，不同的對(duì)映體藥物在人體內(nèi)的藥理、代謝過程、毒性和療效存在著顯著差異。在一對(duì)異構(gòu)體中，通常是一種具有良好的生理活性，而另一種的活性很弱或沒有活性，甚至還有毒副作用[3]。對(duì)此，1992年美國(guó)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)規(guī)定，要求對(duì)手性藥物的對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行定量和立體化學(xué)特殊的鑒定測(cè)試，同時(shí)檢測(cè)單個(gè)對(duì)映體的藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)特征[4]。因此，建立精密、高效的手性藥物分析技術(shù)，對(duì)手性藥物的檢測(cè)和純化，進(jìn)而深層次地研究手性藥物與生物大分子的作用機(jī)制等均具有極其重要的意義。

一般，研究手性藥物與生物大分子的作用機(jī)制主要是通過研究蛋白質(zhì)在與手性藥物結(jié)合后其結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化情況。而研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的方法有很多，傳統(tǒng)上可以分為兩大類：一類是測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，如核磁共振法(NMR)[5]、平衡透析法[6]、傅里葉紅外(FT-IR)光譜法[7]等；另一類是測(cè)定晶體蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，如X射線衍射法和小角中子衍射法。利用這些方法可以獲得關(guān)于生物大分子與手性配體作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、作用力類型以及在手性藥物小分子作用下生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的變化等信息。本文重點(diǎn)闡述了分子光譜分析法、等溫滴定量熱法、手性傳感器、原子力顯微鏡和分子對(duì)接模擬法作為手性藥物與生物大分子相互作用中在對(duì)映選擇性上的表征方法應(yīng)用與進(jìn)展。

2 分子光譜分析法

分子光譜分析是研究藥物對(duì)映體和蛋白質(zhì)相互作用的一種簡(jiǎn)單有效的方法。根據(jù)檢測(cè)原理和儀器的差異可將光譜分析分為紫外-可見吸收光譜法[8]、熒光光譜法和拉曼光譜法[9]等。

2.1 熒光光譜法

熒光光譜法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為分子光譜分析法中應(yīng)用最廣泛的一種方法[10]。該方法能夠提供很多熒光參數(shù)，如激發(fā)光譜、熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命等，這些參數(shù)從各個(gè)角度反映了分子間的成鍵和結(jié)構(gòu)情況以及發(fā)光特性。通過對(duì)這些參數(shù)的測(cè)定，不僅可以做一般的定量分析，還可以推斷蛋白質(zhì)分子在各種環(huán)境中的構(gòu)象變化[11]，從而進(jìn)一步闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系[12]。

Ranieri等[13]通過熒光光譜法測(cè)定了抗體與芳香族氨基酸對(duì)映體結(jié)合前后色氨酸的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)抗體與D -苯丙氨酸結(jié)合后其色氨酸的熒光強(qiáng)度增大了，而與L-苯丙氨酸反應(yīng)時(shí)則無明顯變化，從而驗(yàn)證了色氨酸殘基確實(shí)位于手性抗體結(jié)合位點(diǎn)。Grubor等[14]利用熒光線狹窄光譜(Fluorescence Line-Narrowing Spectroscopy，F(xiàn)LNS)研究了抗體與(+)-,(-)-Benzo[a]Pyrene Tetrol(BPT)對(duì)映體結(jié)合的識(shí)別機(jī)制，發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗體與(+)-BPT結(jié)合時(shí)，其復(fù)合物的FLNS光譜會(huì)出現(xiàn)明顯的紅移，而與(-)-BPT結(jié)合時(shí)則沒有。通過分析表明(+)-BPT-Ab復(fù)合物出現(xiàn)紅移是由于半抗原的芘基與抗體的結(jié)合位點(diǎn)形成了π-π共軛，而(-)-BPT與抗體結(jié)合時(shí)，其芘基遠(yuǎn)離了抗體的口袋結(jié)構(gòu)，而更偏向于溶液部分，故其復(fù)合物的FLNS光譜沒有變化。Liu等[15]采用熒光光譜分析、質(zhì)子核磁共振分析對(duì)兩種生物堿對(duì)映體Quinine(QN)和Quinidine(QD)分別與BSA的特異性結(jié)合進(jìn)行了研究，結(jié)果表明兩者通過靜電力作用與牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合，主要是芳香基團(tuán)起作用，并導(dǎo)致BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

2.2 圓二色譜法

圓二色譜(Circular Dichroism,CD)是立體化學(xué)和分子間相互作用的重要研究手段之一，主要是通過測(cè)定蛋白質(zhì)在與手性藥物結(jié)合后其空間結(jié)構(gòu)(構(gòu)象)的變化，通過數(shù)據(jù)擬合得出蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變，從而認(rèn)識(shí)到不同的藥物對(duì)映體與蛋白質(zhì)結(jié)合的作用機(jī)制是否是不同的[16]。目前，由于圓二色譜分析法具有快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在研究手性藥物小分子對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化具有重要的實(shí)際意義，引起了研究者的廣泛關(guān)注[17]。

Hwangbo等[18]采用CD技術(shù)研究了R和S構(gòu)型的氧氟沙星分別與合成的多聚核苷酸plo(A-T)、plo(G-C)、plo(C-I)的作用。最終所得的CD圖譜表明，R-氧氟沙星僅與plo(G-C)作用明顯，而S-氧氟沙星與三者作用皆很強(qiáng)，這說明核苷酸對(duì)S-氧氟沙星的立體選擇性強(qiáng)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有力地證明了S-氧氟沙星的藥效強(qiáng)于R-氧氟沙星這一已存在的結(jié)論。Zhang等[19]利用CD技術(shù)，結(jié)合穩(wěn)態(tài)熒光、三維熒光、分子模擬等手段研究了禾草靈(Diclofop-methyl,DM)對(duì)映體和人血清白蛋白的相互作用，所得的計(jì)算結(jié)果表明自由的人血清白蛋白具有較高含量的α-螺旋，且S-DM比R-DM對(duì)人血清白蛋白的α-螺旋含量引起更大的改變。Monti等[20]采用CD和分子動(dòng)力學(xué)分析了酮洛芬對(duì)映體(Ketoprofen,KP)和BSA的相互作用，通過計(jì)算得出S-(+)-KP更靠近子區(qū)域IIIA的酪氨酸-409，而R-(-)-KP更接近于子區(qū)域IIA的色氨酸-212和組氨酸-240，這一結(jié)果印證了等溫滴定量熱法得出的S-(+)-KP對(duì)蛋白質(zhì)的親和力比R-(-)-KP的弱。Tedesco等[21]利用CD法和時(shí)間密度泛函理論對(duì)非諾特羅對(duì)映體的立體結(jié)構(gòu)和構(gòu)象進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)非諾特羅的CD圖主要是由位于α位置的間苯二酚發(fā)色團(tuán)手性中心的絕對(duì)構(gòu)型占主導(dǎo)，從而導(dǎo)致其對(duì)β2-腎上腺素受體增效劑有特異性選擇作用。

3 等溫滴定量熱法

等溫滴定量熱法(Isothermal Titration Calorimetry，ITC)是測(cè)量生物結(jié)合時(shí)相互作用的一種理想方法。ITC根據(jù)檢測(cè)到的熱效應(yīng)中熱力學(xué)分析來提供結(jié)合反應(yīng)過程中能量變化的定量信息，可以直接計(jì)算溶液中兩個(gè)或多個(gè)分子之間反應(yīng)焓變(△H)、熵變(△S)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)、結(jié)合常數(shù)(Ka)和動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，從而得出反應(yīng)吉布斯自由能(△G)，進(jìn)一步判斷蛋白質(zhì)-小分子的反應(yīng)類型[22]。ITC具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)高靈敏度和精確度，響應(yīng)時(shí)間低于10 s，結(jié)合常數(shù)檢測(cè)范圍可達(dá)109L/mol；(2)消耗樣品量少，樣品池只需200 μL樣品；(3)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和記錄一個(gè)變化過程的量熱曲線；(4)無需標(biāo)記樣品、無分子量和緩沖液體系限制，操作簡(jiǎn)便。目前，ITC已成為表征手性藥物與生物大分子結(jié)合產(chǎn)生的反應(yīng)熱力學(xué)的方法中發(fā)展較快、應(yīng)用較多的方法之一，廣泛地運(yùn)用到檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用、抗體質(zhì)量控制、藥物設(shè)計(jì)和酶動(dòng)力學(xué)分析等方面[23 - 25]。

Dong等[26]以人工甜味劑富勒醇作為受體模型，用ITC研究了其對(duì)映體的結(jié)合親和力差別。結(jié)果表明富勒醇與氨基酸的結(jié)合是一個(gè)熵增焓降的過程，同時(shí)D -果糖和L-半乳糖與富勒醇受體作用時(shí)結(jié)合常數(shù)比較大，這就解釋了這兩個(gè)單糖為什么比其對(duì)應(yīng)的對(duì)映體更甜，這一結(jié)果填補(bǔ)了甜味評(píng)價(jià)的熱動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)的空缺，揭示了氨基酸和單糖對(duì)映體甜度差別的原因。為了了解手性[5]螺稀-精胺共軛物對(duì)映體是否能識(shí)別B-或Z-DNA的手性，Tsuji等[27]成功合成了[5]螺稀-精胺共軛物(P)-3和(M)-3，同時(shí)(P)-3傾向于識(shí)別B-DNA，而(M)-3傾向于識(shí)別Z-DNA，結(jié)合熱力學(xué)參數(shù)表明(P)-3、(M)-3對(duì)B-和Z-DNA的手性識(shí)別是由于精胺部分的陽離子在小溝的磷酸骨架處產(chǎn)生了靜電作用，而螺稀以端部堆垛方式形成了復(fù)合物。Liu等[28]用等溫滴定量熱法和室溫磷光法等技術(shù)比較了奎寧(QN)和奎尼丁(QD)這一對(duì)對(duì)映體與BSA的結(jié)合類型。結(jié)果表明QN和QD與BSA結(jié)合都是焓驅(qū)動(dòng)的放熱反應(yīng)，而且QN比QD與BSA結(jié)合有更高的親和力，這很好地解釋了它們?cè)谒幮系牟町?，正是因?yàn)樗鼈儗?duì)生物大分子的不對(duì)等結(jié)合方式。

4 手性傳感器

基于手性抗體的立體選擇性，建立不同類型的手性傳感器是分析和檢測(cè)對(duì)映異構(gòu)體的另一種方法。手性傳感器具有三大優(yōu)點(diǎn)：(1)高通量流動(dòng)注射式檢測(cè)，測(cè)量過程自動(dòng)化；(2)無需對(duì)抗體或抗原進(jìn)行任何標(biāo)記；(3)可實(shí)時(shí)、在線進(jìn)行對(duì)映異構(gòu)體的檢測(cè)[29,30]?；诒砻娴入x子體共振光譜(Surface Plasmon Resonance,SPR)的手性光學(xué)傳感器則是其中一種能實(shí)時(shí)監(jiān)控手性抗體與對(duì)映體結(jié)合情況，并能定量檢測(cè)對(duì)映異構(gòu)體的手性傳感器。SPR是一種折射率傳感器，可根據(jù)共振角的變化反應(yīng)基質(zhì)對(duì)底物的吸附情況。Hofstetter等[31]先在鍍金傳感芯片上連接鏈霉親和素的羧甲基葡聚糖，再絡(luò)合上D -氨基酸。隨著注入樣品中D -氨基酸含量的增加，由于D -氨基酸與抗D -氨基酸抗體的競(jìng)爭(zhēng)吸附作用，使得手性抗體與芯片的結(jié)合減少，導(dǎo)致傳感信號(hào)逐漸減弱。另外，通過SPR測(cè)定氨基酸對(duì)映體時(shí)，當(dāng)L構(gòu)型為D構(gòu)型的2 500倍時(shí)仍可準(zhǔn)確測(cè)量，故該傳感器也可用于測(cè)定痕量的對(duì)映體雜質(zhì)。值得注意的是，SPR的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)功能還可提供手性抗體與手性半抗原的結(jié)合常數(shù)ka和解離常數(shù)kd，這對(duì)研究手性抗體與對(duì)映體之間的親和力及識(shí)別性能差異等都有重要意義。

為了使SPR手性傳感器在對(duì)映異構(gòu)體的實(shí)際檢測(cè)運(yùn)用中更受青瞇，更多其他類型的手性傳感器應(yīng)運(yùn)而生。電容式手性傳感器則是其中一種穩(wěn)定、靈敏且價(jià)格便宜的能實(shí)現(xiàn)對(duì)映體痕量檢測(cè)的手性傳感器[32]。Zhang等[33]通過電容式手性傳感器檢測(cè)D,L-苯丙氨酸(D,L-Phe)對(duì)映體雜質(zhì)的反應(yīng)過程。當(dāng)抗D -氨基酸抗體與金電極表面的手性半抗原結(jié)合時(shí)，根據(jù)電位階躍法可計(jì)算出電容的變化△C，抗體結(jié)合越多，△C越大。隨著注入樣品中D -苯丙氨酸的濃度增加，抗體與金電極結(jié)合減少，導(dǎo)致△C逐漸變小。通過該方法能檢測(cè)出在對(duì)映體雜質(zhì)中含量只有0.001%的D -苯丙氨酸，靈敏度相當(dāng)高，而且電容式手性傳感器可以在溫度變化較大或惡劣環(huán)境中工作，比SPR更適合于對(duì)映體雜質(zhì)的實(shí)際、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

以上所介紹的手性傳感器其檢測(cè)過程均為直接競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)，基于微懸梁臂結(jié)構(gòu)的手性傳感器還能實(shí)現(xiàn)直接非競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)對(duì)映異構(gòu)體。微懸梁臂是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于進(jìn)行微加工傳感器結(jié)構(gòu)。其以低成本、小體積和高性能著稱[34]。Dutta等[35]將抗氨基酸抗體直接鍵合于微懸梁臂上，用以檢測(cè)氨基酸對(duì)映體。當(dāng)樣品注入流經(jīng)微懸梁臂時(shí)，氨基酸對(duì)映體與手性抗體結(jié)合，導(dǎo)致微懸梁臂發(fā)生暫時(shí)性的彎曲，通過激光束的反射探測(cè)微懸梁臂的偏轉(zhuǎn)情況、偏轉(zhuǎn)程度與樣品中目標(biāo)對(duì)映體的濃度成正比。

5 原子力顯微鏡

原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope,AFM)則能夠表征樣品表面形貌、樣品表面物化屬性和樣品表面電勢(shì)等，了解樣品表面分子的種類，從而得出與手性藥物作用后蛋白質(zhì)的表面形貌變化。AFM原理是用探針的一端固定在探針架上而另一端是裝有納米級(jí)針尖的微懸臂來檢測(cè)樣品表面形貌[36]。相比其它顯微工具，原子力顯微鏡以其無需標(biāo)記物、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、高分辨、樣品制備簡(jiǎn)單、成像環(huán)境多樣、能獲得樣品的多種信息、能獲得免疫分子識(shí)別情況、操作易行等特點(diǎn)而備受關(guān)注，已在生命科學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮了重大作用[37,38]。

目前，在免疫分析過程中出現(xiàn)的假陽性、假陰性、共同表達(dá)等問題需要通過抗原及抗體高分辨率的成像來進(jìn)一步解釋，侯永微等[39]利用AFM對(duì)常用7種單克隆抗體進(jìn)行掃描觀察其形態(tài)，結(jié)果表明7種單克隆抗體的形態(tài)均不相同，這在形態(tài)上直觀地印證了不同抗體的多態(tài)性及每種抗體具有相對(duì)特異性。這也表明利用AFM觀察通過手性對(duì)映體得到的手性抗體形態(tài)，可以得到手性抗體形態(tài)的區(qū)別，從而去解釋不同手性對(duì)映體在人體環(huán)境中的藥理、代謝過程、毒性和療效存在的差異。為了研究了DNA-多壁碳納米管(DNA-MWNTs)復(fù)合物如何特異性區(qū)分青霉胺對(duì)映體(PA)，Wang等[40]采用AFM對(duì)固定有PA/DNA-MWNTs復(fù)合物的芯片表面進(jìn)行觀察，結(jié)果表明L-PA/DNA-MWNTs的表面比較緊湊，而D -PA/DNA-MWNTs的表面相對(duì)稀疏，這說明青霉胺對(duì)映體與芯片的不同組裝方式是由于芯片上羧基和氨基與青霉胺對(duì)映體的手性碳原子在空間上的不同結(jié)合方式導(dǎo)致的，因此，可以利用AFM根據(jù)不同手性對(duì)映體與芯片的結(jié)合情況來區(qū)分不同的手性對(duì)映體。Wang等[41]采用基于自組裝和AFM的單分子力譜技術(shù)和泊松分布統(tǒng)計(jì)法計(jì)算了BSA和anti-BSA在不同環(huán)境下的單分子對(duì)間的特異性相互作用力和非特異性相互作用力，該實(shí)驗(yàn)表明不同藥物分子的存在對(duì)BSA和anti-BSA間相互作用的影響機(jī)制可能不同，這也說明可以利用AFM來研究不同藥物分子對(duì)不同的手性分子和其對(duì)應(yīng)的抗體間相互作用的影響機(jī)制，從而得到手性分子和其對(duì)應(yīng)的抗體的作用力類型。

6 分子模擬

由于計(jì)算機(jī)技術(shù)及各種軟件的開發(fā)，應(yīng)用于研究小分子-蛋白的相互作用的分子模擬技術(shù)(分子對(duì)接)也越來越受到研究者們的廣泛關(guān)注。由于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)研究的發(fā)展，已經(jīng)探明了許多蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。而當(dāng)受體的三維結(jié)構(gòu)已知時(shí)，可以根據(jù)形狀互補(bǔ)、空間互補(bǔ)、性質(zhì)互補(bǔ)的原則將配體放置在受體的活性部位，使之形成有利于相互作用的配體-受體復(fù)合物，即為所謂的分子模擬[42]。分子模擬可預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA等生物大分子相互作用復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，小分子-生物大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及相互作用的親和性[43,44]。因而，該方法在設(shè)計(jì)半抗原、解釋交叉反應(yīng)與抗體識(shí)別機(jī)制等方面運(yùn)用越來越廣泛。

Rasmussen等[45]篩選了一些能夠識(shí)別有疏水性的手性聯(lián)二萘酚衍生物(BINOL)的抗體片段，用ELISA法來檢測(cè)這些抗體片段的結(jié)合親和力，并用分子對(duì)接技術(shù)去解釋這些半抗原的結(jié)合方式。結(jié)果表明，由于半抗原本身的疏水性，有幾個(gè)挑選的抗體具有立體選擇性，只能識(shí)別(R)-BINOL衍生物且(R)-BINOL衍生物1的親和力最好，但不能識(shí)別(S)-BINOL衍生物半抗原；而且根據(jù)半抗原與抗體識(shí)別的位點(diǎn)能夠得出不同的結(jié)合位點(diǎn)是通過不同的結(jié)合方式完成的，這說明了能夠利用抗體來區(qū)分具有強(qiáng)疏水性的配體對(duì)映體。Ranieri等[46]使用SWISS-MODEL軟件研究了抗L-氨基酸單克隆抗體(anti-L-AA)的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)接結(jié)果表明anti-L-AA通過氫鍵和疏水作用與D -苯丙氨酸結(jié)合，但由于空間位阻而不能與L-苯丙氨酸結(jié)合，這說明手性抗體對(duì)D -苯丙氨酸的選擇特異性是化學(xué)鍵和空間結(jié)構(gòu)共同作用的結(jié)果。為了研究吡唑硫磷對(duì)映體不同的特異性毒理性質(zhì)，Zhuang等[47]通過分子模擬在原子水平上研究了吡唑硫磷對(duì)映體與免疫細(xì)胞白介素1β(IL-1β)的結(jié)合情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)R-吡唑硫磷比S-吡唑硫磷更傾向于IL-1β蛋白結(jié)合，這解釋了R-吡唑硫磷比S-吡唑硫磷有更強(qiáng)的毒性效應(yīng)。

7 結(jié)語

隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)、儀器設(shè)備的不斷發(fā)展，整體實(shí)驗(yàn)水平不斷提高，生物大分子-手性藥物相互作用在對(duì)映選擇性上的研究會(huì)越來越透徹，但由于研究中的蛋白質(zhì)樣液與蛋白質(zhì)實(shí)際所處生理環(huán)境存在一定的差別，任何單一方法對(duì)生物大分子-手性藥物小分子相互作用的研究結(jié)果都具有一定局限性。若把熱力學(xué)方法、光譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、分子模擬技術(shù)等綜合運(yùn)用，從多方面多角度對(duì)同一反應(yīng)體系進(jìn)行研究，不僅能從宏觀上，還可以從微觀角度全面地對(duì)生物大分子-手性藥物相互作用中的對(duì)映選擇性進(jìn)行分析，且不同的方法間也可相互佐證，所得到的結(jié)果就更加精準(zhǔn)、更具說服力。