沉默Epha2對前列腺癌PC3細胞生物學(xué)性狀與血管生成擬態(tài)的影響

曹　陽　李　清

421001 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院

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沉默Epha2對前列腺癌PC3細胞生物學(xué)性狀與血管生成擬態(tài)的影響

曹陽李清

421001 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院

【摘要】目的探究沉默Epha2基因?qū)η傲邢侔㏄C3細胞生物學(xué)性狀的改變及對血管生成擬態(tài)的影響。方法培養(yǎng)人前列腺癌細胞株P(guān)C3(高表達EGFR，對EGFR-TK1吉非替尼敏感)，篩選對Epha2基因具有有效下調(diào)作用的siRNA序列，并利用篩選得到的有效siRNA轉(zhuǎn)染PC3細胞，分別在RNA水平與蛋白水平觀察Epha2的下調(diào)效果；轉(zhuǎn)染細胞后，加入吉非替尼共培養(yǎng)48 h后，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡；同時，觀察轉(zhuǎn)染后對三維培養(yǎng)的模型條件下PC3血管生成擬態(tài)的影響。結(jié)果從設(shè)計的四條siRNA中篩選得到一條最有效下調(diào)Epha2基因表達的序列，利用該siRNA轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞PC3后，與對照組相比明顯增強了吉非替尼誘導(dǎo)PC3細胞的凋亡，同時減少了PC3在三維培養(yǎng)條件下的血管生成擬態(tài)。結(jié)論抑制Epha2基因的表達可促進前列腺癌細胞PC3的凋亡，減少PC3的血管生成擬態(tài)，Epha2基因可作為臨床治療前列腺癌的靶點。

【關(guān)鍵詞】前列腺癌；Epha2；血管生成擬態(tài)

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:545～547)

前列腺癌是老年男性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，且發(fā)病年齡有降低的趨勢[1-2]。血管生成擬態(tài)(VM)存在某些高度惡性腫瘤組織中，通過腫瘤細胞的自身變形和基質(zhì)重塑形成類似血管樣的通道，不僅緩解了腫瘤內(nèi)缺血缺氧微環(huán)境，也與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，使傳統(tǒng)的抗腫瘤血管治療效果不佳[3]。

EphA2作為EPh受體酪氨酸激酶(RTKs)家族成員之一，參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、生存、遷移和侵襲，還涉及腫瘤血管形成和血管生成擬態(tài)的形成，促使網(wǎng)絡(luò)狀管道結(jié)構(gòu)的形成，在許多腫瘤中高表達[4]。有研究表明通過轉(zhuǎn)染增強EphA2的表達可提高前列腺癌LNCaP 細胞的增殖和侵襲能力[5]。然而在RNA干擾條件下觀察Epha2沉默后對前列腺癌PC3細胞系生物學(xué)性狀的改變及在三維培養(yǎng)的模型下觀察其對血管生成擬態(tài)的影響，并在此基礎(chǔ)上探討其參與前列腺癌VM形成的機制卻鮮有報道。

因此，本研究采用前列腺癌細胞株P(guān)C3篩選對Epha2基因具有有效下調(diào)作用的siRNA序列，并采用有效的siRNA對吉非替尼誘導(dǎo)細胞凋亡以及對PC3血管生成擬態(tài)的影響。

1材料與方法

1.1一般材料

人前列腺癌細胞株P(guān)C3購自中科院上海細胞庫。Epha2-siRNA購自上海吉瑪公司，轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine-2000、RNA提取試劑TRIzoL購自美國Invitrogen公司，天然膜蛋白抽提試劑盒ProteoExtractTM(M-PEK)，Annexin-V/FITC凋亡試劑盒購自美國Biovision公司?？贵w：Rabbit EPHA2 antibody、Goat Anti Rabbit IgG/HRP、Mouse GAPDH antibody和Goat Anti Mouse IgG/HRP購自美國SANTA cruz公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)前列腺癌細胞PC3用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2恒溫保濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染按照說明書，在EP管中配制Epha2-siRNA及對照(scramble)與脂質(zhì)體Lipofectamine2000的復(fù)合物，將配制好的混合液加入到無血清培養(yǎng)液洗滌的PC3細胞中，并分為三組[Epha2-siRNAs組、對照(scramble)組以及非轉(zhuǎn)染組]，于37 ℃、5% CO2恒溫保濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6～8 h棄去培養(yǎng)液，換用含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，實驗重復(fù)3次。

1.2.3RNA抽提與Q-PCR檢測按照說明書，利用TRIzoL進行細胞的總RNA抽提并測定濃度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，Q-PCR檢測Epha2的表達情況，用GAPDH作為內(nèi)參引物序列如下，Epha2正向引物：TGGCTCACACACCCGTATG；Epha2反向引物：GTCGCCAGACATCACGTTG；GPADH正向引物：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT；GAPDH反向引物：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。

1.2.4細胞總蛋白提取與蛋白印記雜交檢測利用RIPA裂解液對轉(zhuǎn)染后48h的PC3進行裂解并提蛋白，BCA法測蛋白濃度后將各樣本蛋白濃度調(diào)整至一致后進行點樣，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉，一抗孵育2 h，二抗1 h后顯影。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡將上述三組對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板上24 h后加入0.01 μmol/L的吉非替尼，孵育48 h后棄去上清，每孔加入1 ml PBS洗后收集到離心管中，加入胰酶充分消化后加1 mL PBS洗滌并收集，離心并收集細胞，加入500 μL緩沖液重懸細胞使其密度為1×105個/mL，加入5 μL AnnexinV-FITC，室溫下避光孵育5 min后每管加入5 μL的PI，室溫避光孵育5 min，上機檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，配對資料比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1下調(diào)Epha2的siRNA序列篩選

設(shè)計并合成siRNA-444、733、1553、2191以及scramble序列并轉(zhuǎn)染PC3細胞，48 h后分別利用Q-PCR技術(shù)與Western Blot技術(shù)檢測Epha2的下調(diào)效果。如圖1A所示，與siRNA-444，siRNA-733，siRNA-2191相比，siRNA-1553在RNA水平對Epha2下調(diào)效果最顯著；如圖1B所示，Western Blot顯示siRNA-1533在蛋白水平對Epha2 的下調(diào)效果最顯著。

圖1　不同siRNA對PC3細胞中Epha2下調(diào)效果的比較

2.2Epha2-siRNA-1553增強了吉非替尼誘導(dǎo)PC3細胞的凋亡

siRNA轉(zhuǎn)染PC3后，對吉非替尼誘導(dǎo)PC3的凋亡具有不同影響。如圖2所示，正常PC3細胞經(jīng)過吉非替尼孵育48h后凋亡率為3.86%；轉(zhuǎn)染siRNA-scramble序列后的凋亡率為4.47%；而當(dāng)轉(zhuǎn)染siRNA-1553序列后，PC3在吉非替尼誘導(dǎo)下的凋亡率增高到16.33%。

圖2　Epha2-siRNA-1553增加了吉非替尼誘導(dǎo)的PC3細胞的凋亡

2.3Epha2-siRNA-1553減少PC3在三維培養(yǎng)條件下的血管生成擬態(tài)

PC3細胞在三維培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染siRNA-1553、scramble序列48 h后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與scramble對照組相比較，轉(zhuǎn)染siRNA-1553組的血管生成擬態(tài)數(shù)目明顯減少。

3討論

前列腺癌是指發(fā)生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，是老年男性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，2004年WHO《泌尿系統(tǒng)及男性生殖器官腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)》中前列腺癌病理類型上包括腺癌(腺泡腺癌)、導(dǎo)管腺癌、尿路上皮癌、鱗狀細胞癌、腺鱗癌。其中前列腺腺癌占95%以上，因此，通常所說的前列腺癌就是指前列腺腺癌。中國近年來的前列腺癌發(fā)病率和死亡率都呈現(xiàn)上升趨勢，2012年我國腫瘤登記地區(qū)前列腺癌發(fā)病率為9.92/10萬，列男性惡性腫瘤發(fā)病率的第6位。發(fā)病年齡在55歲前處于較低水平，55歲后逐漸升高，發(fā)病率隨著年齡的增長而增長，高峰年齡是70～80歲。隨著對前列腺癌生物學(xué)行為認識的不斷深入，以及治療理念的轉(zhuǎn)變與更新，前列腺癌的治療進入了綜合治療時代，形成了前列腺癌局部治療與全身治療并重的治療模式。醫(yī)生根據(jù)腫瘤的分期和患者的身體狀況，采用手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、生物靶向治療及中醫(yī)藥輔助治療等多種手段[6]，但是目前前列腺癌的治療尚未獲得突破性進展[7]。

EphA2作為EPh受體酪氨酸激酶(RTKs)家族成員之一，研究顯示EphA2在人腫瘤中過表達，并且這種過表達與腫瘤的惡性程度存在正向的線性關(guān)系[8]。大量的實驗證據(jù)證明，EphA2過表達與激活促進了腫瘤形成，說明EphA2可能是一個潛在的原癌基因[9-12]。EphA2在乳房上皮細胞過表達誘導(dǎo)了其形態(tài)轉(zhuǎn)化[5]，在前列腺癌細胞系中升高的EphA2引起前列腺癌細胞的遷移與侵襲[10]。

我們的研究在首次在RNA干擾條件下觀察沉默Epha2后對前列腺癌PC3細胞系生物學(xué)性狀的改變及在三維培養(yǎng)的模型下觀察其對血管生成擬態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染EphA2-siRNA后前列腺癌細胞PC3在吉非替尼誘導(dǎo)條件下細胞凋亡顯著增加，同時在三維培養(yǎng)條件下EphA2-siRNA轉(zhuǎn)染可有效減少PC3血管生成擬態(tài)的形成。目前的研究認為，EphA2在前列腺癌細胞PC3中下調(diào)之后對化療藥物吉非替尼誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡有促進作用同時減少血管生成擬態(tài)，但是EphA2通過什么途徑起到以上作用的具體分子機制仍需要我們進行下一步的研究。

綜上所述，EphA2下調(diào)具有抵抗前列腺癌細胞對前列腺癌化療藥物吉非替尼的耐藥性以及減弱PC3的血管生成擬態(tài)的作用。因此，EphA2是臨床治療前列腺癌的一個潛在的有效靶點。

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(編輯：吳小紅)

Effect of Epha2 Gene Silencing on the Properties and Vasculogenic Mimicry of Prostatic Cancer Cell Line PC3

CAOYang,LIQing.TheFirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang,421001

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Epha2 gene silencing on the properties and vasculogenic mimicry of prostatic cancer cell line PC3.MethodsPC3 cells (EGFR high expression and sensitive to EGFR-TK1,such as gefitinib) were cultured and siRNA were transfected into PC3 cells,the most effective siRNA was picked through test of Q-PCR and Western blot.Epha2-siRNA were transfected and gifitinib were added into PC3 cells for 48h,then the apoptosis was measured by FACS.Meanwhile,the effect on vasculogenic mimicry of PC3 cultured in 3D condition was investigated.ResultsThe most effective siRNA-1553 was screened and PC3 cells apoptosis induced by gifitinib was increased and the vasculogenic mimicry of PC3 cultured in 3D condition was decreased apparently when transfected into PC3 cells.ConclusionThe inhibition of Epha2 gene expression by siRNA can promote the apoptosis induced by gifitinib and restrain the vasculogenic mimicry of prostatic cancer cell PC3,Epha2 gene might be a potential therapeutic target of prostatic cancer in clinic treatment.

【Key words】Prostatic cancer;Epha2;Vasculogenic mimicry

(收稿日期2015-12-14修回日期 2016-02-04)

中圖分類號：R737.25

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)04-0545-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.007

通訊作者：李清