VEGF-C在胃癌中的表達(dá)與微血管密度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及臨床意義

周鳳鳴　彭慶弟

635000 四川省達(dá)州市中心醫(yī)院

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VEGF-C在胃癌中的表達(dá)與微血管密度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及臨床意義

周鳳鳴彭慶弟

635000 四川省達(dá)州市中心醫(yī)院

【摘要】目的探討VEGF-C在胃癌中的表達(dá)與微血管密度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胃癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。方法納入行胃癌手術(shù)切除患者的病例樣本共計(jì)96例，對這96例胃癌樣本采用qPCR檢測血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)的相對表達(dá)量及檢測微血管密度(MVD)參數(shù)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等預(yù)后情況進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果VEGF-C相對表達(dá)量與患者的一般資料如年齡、性別、以及腫瘤的特征如大小、發(fā)病的部位、侵襲深度，腫瘤的分期及分化程度、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等并不存在相關(guān)性(P>0.05)。而淋巴受累方面，淋巴受累組的VEGF-C相對表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)，而無淋巴受累組的相對表達(dá)量與正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，VEGF-C相對表達(dá)量明顯上調(diào)與淋巴結(jié)受累轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。VEGF-C表達(dá)水平與MVD差異表達(dá)具有相關(guān)性。結(jié)論VEGF-C相對表達(dá)量水平與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有一定的相關(guān)性，但還需進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

【關(guān)鍵詞】胃癌；預(yù)后；VEGF-C；微血管密度；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；相關(guān)性

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:533～536)

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，我國的胃癌發(fā)病率一直居高不下，在世界范圍內(nèi)我國胃癌發(fā)病率約占47%，且多數(shù)患者患病后初次就診已經(jīng)伴有廣泛的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者遠(yuǎn)端的轉(zhuǎn)移，失去了根治手術(shù)的機(jī)會(huì)，耽誤了治療的最佳時(shí)機(jī)。早期診斷對疾病的及時(shí)發(fā)現(xiàn)及治療具有重要的臨床意義[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、肝癌、膽管癌、胃癌等多種腫瘤中VEGF-C在調(diào)控腫瘤血管的生成中具有重要的作用，在胃癌的發(fā)病中存在VEGF-C的上調(diào)，其作為促癌基因發(fā)揮腫瘤生長調(diào)控作用[3]。本研究收集胃癌患者VEGF-C的表達(dá)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及MVD參數(shù)資料，通過分析VEGF與微血管新生及模式的演變規(guī)律，進(jìn)一步探討胃癌的抗血管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1病例的收集

納入我院普外科2012年1月至2015年1月行胃癌手術(shù)切除的96例患者病例樣本，通過病理診斷均確診為原發(fā)性胃癌，納入研究的所有患者均為初診的患者，且在術(shù)前未進(jìn)行任何放療、化療及分子靶向治療等。96例中男性74例，女性22例，年齡42～78歲，平均年齡為(61.34±1.13)歲。在術(shù)中取材之后，腫瘤的位置以病理組織報(bào)告為標(biāo)準(zhǔn)，將樣本立即放置入液氮罐中保存，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱長期保存，在實(shí)驗(yàn)前取出，提取胃癌組織的RNA，同時(shí)進(jìn)行病理學(xué)的監(jiān)測，對胃癌組織的病理學(xué)進(jìn)行分型，腫瘤的浸潤程度按照國際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)分類[4]，淋巴分化以及轉(zhuǎn)移采用的國際WHO的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行分析判斷，對所有手術(shù)治療的患者從出院到死亡進(jìn)行隨訪觀察，隨訪的時(shí)間以每月1次。同時(shí)納入健康人群23例作為對照組，所有受試者簽訂知情同意書，收集標(biāo)本前該臨床試驗(yàn)研究通過了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

試劑：Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(美國Invitroge公司)，TaqMix(東盛生物公司)，PCR試劑盒、TaqMan RNA試劑盒(美國Santa Cruz公司)，RNA提取試劑盒采用(美國Sigma)，DEPC(上海碧云天生物)，乙醇、異丙醇、氯仿(上海碩盟生物)。

儀器：高速冷凍離心機(jī)(德國BiofugeStratos)，-80 ℃~4 ℃冰箱(日本松下)，PCR儀(澳大利亞Rotor-gene)，紫外分光光度儀(Beckman Coulter 公司)。

1.3RNA提取及qPCR檢測

對96例胃癌組織采用RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取，采用TaqMan RNA試劑盒檢測VEGF-C的相對表達(dá)量。采用RNU6作為內(nèi)參進(jìn)行校正。對VEGF-C的表達(dá)水平采用二步法進(jìn)行檢測，第一步是通過莖環(huán)引物來合成互補(bǔ)DNA，再通過RNA的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對10 ng RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)了反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，在PCR管加入10 μl的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，總的RNA濃度調(diào)整到2 ng/μl，最后加入5 μl的逆轉(zhuǎn)錄引物，在冰上混勻之后反應(yīng)5 min，行梯度變形反應(yīng)，反應(yīng)條件為94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min，一次遞減；第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反應(yīng)體系，該體體系具體形式：Taqman RNA的特異性引物與2×的 PCR Taqman Universal混合液相互混合之后通過逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)，再加入5μlcDNA到RNA的去酶的水當(dāng)中，將體積擴(kuò)增至20 μl，通過循環(huán)反應(yīng)94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min遞減的擴(kuò)張40個(gè)循環(huán)之后，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，采用熒光實(shí)時(shí)定量反應(yīng)，按照PCR操作說明，Ct的檢測值應(yīng)當(dāng)在20～32之外的需要進(jìn)行第2次檢測。應(yīng)用△Ct=CtVEGF-C-CtRNU6的計(jì)算公式計(jì)算VEGF-C的相對表達(dá)量。

MVD的檢測：資深病理專家對切片復(fù)核確認(rèn)，利用相應(yīng)的存檔組織蠟塊進(jìn)行VEGF-C免疫組化染色，標(biāo)記微血管密度，記錄觀察微血管的生長模式。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測

所有納入分析研究的數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0的統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫，將VEGF-C表達(dá)水平分為2組，小于平均值為低表達(dá)組，大于平均值作為高表達(dá)組。通過分析VEGF-C的表達(dá)水平高低與發(fā)病相關(guān)因素分析以逐步回歸法篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量，對臨床病理因素之間的風(fēng)險(xiǎn)情況采用Logistic回歸分析，組間比較用方差分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，組間率的比較用卡方檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。應(yīng)用Kruskal-wallis H檢驗(yàn)進(jìn)行多組間數(shù)據(jù)的比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的以P<0.05表示。

2結(jié)果

2.1VEGF-C的相對表達(dá)量與臨床病理特征之間的相關(guān)性

96例胃癌組織的VEGF-C的相對表達(dá)量為1.436，95%CI為0.323～0.534，表達(dá)量低于平均值的有42例，高于平均值的有54例。VEGF-C相對表達(dá)量與患者的一般資料如年齡、性別、以及腫瘤的特征如大小、發(fā)病的部位、侵襲深度，腫瘤的分期及分化程度、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等并不存在相關(guān)性(P>0.05)。而淋巴受累方面，淋巴受累組的VEGF-C相對表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)，而無淋巴受累組的相對表達(dá)量與正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，VEGF-C相對表達(dá)量明顯上調(diào)與淋巴結(jié)受累轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，見表1。

2.2VEGF-C相對表達(dá)量的高低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系

采用logistic回歸分析VEGF-C相對表達(dá)量的高低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性，VEGF-C相對表達(dá)量的上升會(huì)增加胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)性，OR(95%CI)=3.15(2.13～9.27)，通過調(diào)整風(fēng)險(xiǎn)其OR=5.16，95%CI為1.27～20.83，P=0.03。

2.3胃癌組織中VEGF-C的表達(dá)水平與MVD的相關(guān)性

VEGF的蛋白表達(dá)水平與MVD差異表達(dá)具有相關(guān)性(高表達(dá)：γ=0.86，P=0.01，低表達(dá)：γ=0.75，P=0.02)，見表2。

表1　VEGF-C的相對表達(dá)量與臨床病理特征之間的相關(guān)性

表2　胃癌組織中VEGF-C的表達(dá)與MVD的關(guān)系

3討論

臨床實(shí)踐研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)早期胃癌在發(fā)病的初期并無明顯的臨床癥狀，在首次就診時(shí)大部分胃癌患者已經(jīng)進(jìn)入中晚期，因此胃癌患者預(yù)后極差，生存率較低[4]。通過大量的臨床研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子-C是腫瘤調(diào)控中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要分子，參與著各類腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡、生長、發(fā)育以及侵襲轉(zhuǎn)移，涉及到各類腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)也是目前研究腫瘤分子機(jī)制的熱點(diǎn)內(nèi)容[5-6]。腫瘤微血管新生是其浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前提條件[7-8]，目前評價(jià)腫瘤血管生成的標(biāo)準(zhǔn)是測定腫瘤微血管密度(MVD)。而腫瘤微血管存在多種不同的模式，勢必對腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后產(chǎn)生影響，但是有關(guān)微血管模式與腫瘤進(jìn)展以及脈管內(nèi)癌栓、局部腫瘤浸潤等高危因素的以及預(yù)后的關(guān)系鮮見報(bào)道[9-10]。研究提示了VEGF-C可以用于對腫瘤預(yù)后的評估，其表達(dá)量與腫瘤的預(yù)后有著一定的相關(guān)性[11-12]。

近年來胃癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，雖然治療水平不斷提高，但是患者的生存率并未得到明顯提高，其轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)仍是其死亡的主要原因。國內(nèi)外目前對胃癌的診斷研究主要集中在病因?qū)W、遺傳基因、早期診斷手段的研究，治療方面研究主要集中在放射、化學(xué)以及手術(shù)方法改進(jìn)等方面，雖然取得了一定進(jìn)展，但該病的發(fā)病率及死亡率并未得到明顯降低，說明研究的深度尚不足，研究還處于基礎(chǔ)階段尚未應(yīng)用于臨床[11]。由于胃癌作為惡性腫瘤，對人類生命具有重大的威脅。因此，進(jìn)一步尋找有關(guān)胃癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移生物標(biāo)記物及敏感特異是該病有效治療、提高生存率的關(guān)鍵點(diǎn)。其次做好胃癌發(fā)病的預(yù)防及早期發(fā)現(xiàn)，減少其發(fā)病率和轉(zhuǎn)移率，是今后研究的重要方向[13]。VEGF-C具有增強(qiáng)微血管通透性，其特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，為腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移提供條件，刺激內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)腫瘤血管生成。研究表明腫瘤細(xì)胞中VEGF-C的水平上調(diào)，具有促進(jìn)腫瘤的生長的作用[14]。本研究通過分析VEGF-C在胃癌中的表達(dá)與微血管密度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胃癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系，為胃癌的抗血管生成治療研究提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示，VEGF-C相對表達(dá)量與患者的一般資料如年齡、性別、以及腫瘤的特征如大小、發(fā)病的部位、侵襲深度，腫瘤的分期及分化程度、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等并不存在相關(guān)性；而淋巴受累方面，淋巴受累組的VEGF-C相對表達(dá)量明顯上調(diào)，VEGF-C相對表達(dá)量明顯上調(diào)與淋巴結(jié)受累轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)VEGF-C表達(dá)水平與MVD差異表達(dá)具有相關(guān)性，對早期胃癌的診斷具有一定的作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)VEGF-C在胃癌表達(dá)上調(diào)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著密切的相關(guān)性，提示VEGF-C可能與胃癌的轉(zhuǎn)移侵襲等影響預(yù)后的因素有關(guān)，該分子差異性表達(dá)推測可能是胃癌早期的潛在靶點(diǎn)，但是本研究不足的是病例數(shù)還相對較少，VEGF-C在胃癌中的作用機(jī)制和靶基因生物學(xué)預(yù)測和闡明有待于進(jìn)一步研究。

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(編輯：甘艷)

Relationship between VEGF-C Expression and Microvascular Density and Lymph Node Metastasis in Gastric Cancer and Its Clinical Significance

ZHOUFengming，PENGQingdi.SichuanDazhouCentralHospital，Dazhou，635000

【Abstract】ObjectiveTo study the relationship between VEGF-C expression and microvascular density，lymph node metastasis and development and prognosis of gastric cancer.Methods96 cases of patients treated with gastric cancer resection were collected， qPCR was used to detect relative expression of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) and microvessel density (MVD) parameters，and lymph node metastasis received correlation analysis.ResultsVEGF-C relative expression had no correlation with patient's general information such as age，sex，and tumor characteristics such as size，site of disease，depth of invasion，tumor stage and degree of differentiation，metastasis(P>0.05)；in lymphatic involvement，relative expression of VEGF-C of lymphatic involvement group significantly increased(P<0.05)，relative expression of VEGF-C of without lymph node involvement and the normal group had no statistically significant difference(P>0.05)，increase of VEGF-C expression was related to risk of lymph node involvement and metastasis；VEGF-C expression and differential expression of MVD were correlated.ConclusionVEGF-C relative expression level and lymph node metastasis and prognosis of gastric cancer have some relevance，but need to be further studied.

【Key words】Gastric cancer；Prognosis；VEGF-C；Microvessel density；Lymph node metastasis；Correlation

(收稿日期2015-11-19修回日期 2016-02-14)

中圖分類號：R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)04-0533-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.004