羅非魚酶解肽抑制冷藏魚糜中油脂和蛋白質氧化能力

郭利平，榮 婧，楊 寧，郭善廣（.廣東輕工職業(yè)技術學院輕化工程系，廣東 廣州 5000；.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 5064；.廣東省對外科技交流中心，廣東 廣州 500）

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羅非魚酶解肽抑制冷藏魚糜中油脂和蛋白質氧化能力

郭利平1，榮 婧2，楊 寧3，郭善廣2
（1.廣東輕工職業(yè)技術學院輕化工程系，廣東 廣州 510300；2.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；3.廣東省對外科技交流中心，廣東 廣州 510033）

摘 要：將羅非魚的酶解產(chǎn)物及其超濾組分（＜5 kD酶解肽）加入羅非魚魚糜制品中，研究其在冷藏（0～4 ℃）期間對油脂和蛋白質的抗氧化效果。結果表明：酶解產(chǎn)物及超濾組分均可以改善魚糜的色澤（P＜0.05），尤其是超濾組分的效果接近于一定劑量的VC；酶解產(chǎn)物對魚糜中的油脂、蛋白質均表現(xiàn)出較強的抗氧化能力（P＜0.05），其中超濾組分優(yōu)于酶解液；酶解肽可以有效地保持魚糜在冷藏期間的品質，超濾分離富集的＜5 kD的小分子肽顯示出更好的抗氧化效果。

關鍵詞：魚糜；酶解肽；蛋白質氧化；超濾；抗氧化活性

引文格式：

郭利平,榮婧,楊寧,等.羅非魚酶解肽抑制冷藏魚糜中油脂和蛋白質氧化能力[J].食品科學,2016,37(5):89-93.

GUO Liping,RONG Jing,YANG Ning,et al.Peptides derived from enzymatic hydrolysis of tilapia viscera inhibit lipid and protein oxidation in refrigerated surimi[J].Food Science,2016,37(5):89-93.(in Chinese with English abstract)

羅非魚（tilapia）肉質豐富細嫩、無小刺、容易分割加工，是公認的優(yōu)質蛋白質來源。有研究表明[1]，羅非魚魚肉蛋白具有較好的凝膠化能力和耐劣化特性，優(yōu)于鰱魚、鳙魚和團頭魴魚的凝膠特性，具有良好的魚糜加工特性，是加工魚糜的一種重要的原料。

魚糜制品脂肪及油脂含量較多，且包含較多的不飽和脂肪酸；在加工貯藏過程中，魚糜脂肪和油脂容易氧化變質，脂肪氧化會進一步引起蛋白質的氧化和損傷，甚至產(chǎn)生一些有毒有害復合物[2]。為防止脂肪和蛋白質氧化，延長保質期，一般需要加入適量的抗氧化劑如特丁基對苯二酚、丁基羥基茴香醚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、沒食子酸丙酯等。隨著消費者安全健康飲食意識的提升，人們對于食物品質的要求有所提高，并開始關注添加劑的使用。人工合成的抗氧化劑由于其安全性問題使其應用受到限制，而一些具有抗氧化性的天然物質或其提取物如香辛料[3]、酚類物質[4-6]及蛋白水解物[7-8]逐漸引起了人們更多的關注和研究。

魚類產(chǎn)品作為主要優(yōu)質蛋白質來源，其酶解產(chǎn)物富含氨基酸、肽與核酸等營養(yǎng)物質，而且具有較強的抗氧化活性，近年來成為深度開發(fā)的研究熱點之一[9]。本實驗將羅非魚的酶解產(chǎn)物及其超濾組分加入羅非魚糜中，定期采樣測定魚糜的色度、pH值、硫代巴比妥酸反應（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、羰基價并通過感官評定來研究水解肽類對魚糜油脂和蛋白質氧化的抑制效果。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮羅非魚、食用鹽均購自廣州市天河區(qū)長湴農(nóng)貿(mào)市場。羅非魚內(nèi)臟酶解肽制備及超濾分級分離依照本課題組的前期工作[10]。

二硝基苯肼 天津化學試劑廠；硫代巴比妥酸天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；鹽酸胍 上海實驗試劑有限公司；抗壞血酸 國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

5804R冷凍高速離心機 德國艾本德儀器公司；UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司；pHS-3C 型精密pH計 上海虹益儀器儀表有限公司；Labscale小型切向流超濾系統(tǒng) 密理博中國有限公司；SP62色差儀 美國X-rite公司；DS-1電動組織搗碎機上海精科實業(yè)有限公司。

1.3方法

1.3.1魚糜的制作及貯藏處理

新鮮羅非魚宰殺后去骨取肉，放入高速組織搗碎機中搗碎，添加質量分數(shù)1.0%的食鹽即為魚糜樣品。取4 組等量的魚糜，第1組加入等體積蒸餾水作為空白對照組；第2組加羅非魚內(nèi)臟蛋白酶解液，其中肽含量為0.5%（以蛋白質質量計）；第3組加超濾后分子質量＜5 kD的羅非魚內(nèi)臟蛋白酶解液，含量為0.5%（以蛋白質質量計）；第4組加入抗壞血酸（VC）溶液，添加量為0.5 mg/g。酶解液與VC的添加量以本課題組前期水解肽的抗氧化能力研究[10]為參考依據(jù)?；旌暇鶆蚝髮⒚拷M分成6 份，塑料袋密封后4 ℃條件下保存，分別在第0、2、4、6、8、10天測定樣品的色澤、pH值、TBARS值、羰基含量，并進行感官評定。

1.3.2理化指標測定

1.3.2.1色差的測定

樣品打開包裝30 min后用色差儀測定肉樣的L*、 a*、b*值。儀器經(jīng)自檢及調(diào)零、黑板、白板校正后，取一定量的肉餡，將其放入比色皿中，并將測試探頭放在比色皿上進行測定。每個試樣隨機取5 點測定，取平均值。L*表示明度，a*和b*表示色度，a*正值表示偏紅，負值表示偏綠；b*正值表示偏黃，負值表示片藍。白度（W）值計算公式如下[11]。

1.3.2.2pH值的測定

按照GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品 pH測定》方法進行測定。

1.3.2.3TBARS值的測定

參照Sinnhuber等[12]的方法。取0.3 g待測樣品加入3 mL 質量分數(shù)1% TBARS溶液，再加入17 mL質量分數(shù)7.5%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，混勻后，在沸水浴中反應30 min，自然冷卻后，取5 mL上述樣品溶液加入等體積的氯仿，3 000×g離心10 min，于532 nm波長處測定吸光度。TBARS值以每千克脂質氧化樣品溶液含有丙二醛的毫克數(shù)表示。計算公式如下：

式中：A為吸光度；V為樣品體積/mL；M為丙二醛的摩爾質量72.063 g/mol；ε為摩爾吸光系數(shù)，此處為156 000 L/（mol·cm）；l為光程/cm；m為肉樣質量/g。

1.3.2.4 羰基含量的測定

參照Fagan[13]和Oliver[14]等的方法。取3.0 g魚糜樣品與15 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）混合后冰浴均質，過濾，取0.5 mL樣品溶液，加入1 mL質量分數(shù)10% TCA在4 ℃、5 000×g離心10 min，沉淀部分即為提取的蛋白質。樣品組加入1 mL 10 mmol/L二硝基苯肼（用2 mol/L HCl溶液溶解），室溫下暗處靜止1 h（每15 min渦旋振蕩一次），添加1 mL質量分數(shù)20% TCA，4 ℃、10 000×g離心5 min，棄上清，用1 mL乙酸乙酯-乙醇（1∶1，V/V，現(xiàn)配現(xiàn)用）洗滌沉淀3 次，再重新溶解沉淀在3 mL的6 mol/L鹽酸胍溶液中（用20 mmol/L磷酸鉀溶解），在37 ℃條件下充分溶解15 min，5 000×g離心3 min，除去不溶解物質，清液在370 nm波長處測定吸光度?？瞻讓φ战M用1 mL 2 mol/L HCl代替二硝基苯肼，操作同上。羰基含量計算公式如下。

式中：As為測定管吸光度；A0為空白管吸光度；l為比色管光徑/cm；ρ為樣品蛋白質質量濃度/（mg/L）。

1.3.3感官評定

參照文獻[15]方法，并略微改動。選定8 位實驗人員，對魚糜進行色澤、氣味、酸敗味和總體可接受度四方面的感官評價，感官評價標準見表1。

表1　魚糜感官評定標準Table 1 Standards for the sensory evaluation of surimi

2　結果與分析

2.1酶解產(chǎn)物對羅非魚魚糜色澤的影響

在鮮肉貯藏期間，表面的肌紅蛋白以3 種形態(tài)存在（肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白、氧化肌紅蛋白）且可以相互轉化，導致肉色的變化[16]。在肉品生產(chǎn)中可以通過添加抗氧化劑、發(fā)色劑和包裝的方法來保持肉品的色澤。這些方法一般都是通過阻止色素氧化或促進某一種色素的形成來體現(xiàn)的。也有研究報道，在牛肉中脂肪氧化和色素氧化是相伴而生的[17]，而且脂肪氧化是色素氧化的促進因子。凍藏、蛋白質變性則會影響魚糜凝膠的色澤[18]，魚糜中變性蛋白質、氧化油脂和氧化肌紅蛋白的累積導致褐變發(fā)生。由圖1可知，在貯藏期內(nèi)，添加VC和酶解產(chǎn)物樣品的白度值均高于空白對照組樣品。其中，添加了VC和＜5 kD酶解肽的魚糜樣品白度值無顯著差異（P＞0.05），色澤保持較好，均顯著優(yōu)于添加酶解原液魚糜的色澤（P＜0.05）；酶解液魚糜白度值與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05）。這一結果與骨蛋白[19]、鯉魚蛋白[20]酶解物的相關研究結果一致，很可能是因為酶解肽的抗氧化能力抑制了魚糜色澤的劣變。前期的研究結果[10]也表明羅非魚內(nèi)臟的酶解液具有較強的抗氧化能力，尤其是超濾后＜5 kD的小分子肽的抗氧化能力更接近VC。

圖1　不同處理組羅非魚魚糜在貯藏期間的白度值變化Fig.1 Whiteness change of tilapia surimi with different treatments during storage

2.2酶解產(chǎn)物對羅非魚魚糜pH值的影響

活體魚肌肉的pH值一般在6.8～7.2范圍內(nèi)，宰殺后體內(nèi)糖原分解和無氧酵解使乳酸累積導致pH值降低[21]。底棲性白肉魚類（如羅非魚）由于糖原含量較低（0.2%～0.4%），死后魚肉的最低pH值可以達到6.0～6.4。由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，不同處理組樣品魚糜的pH值逐漸增大。貯藏過程中，VC和酶解液處理組的pH值接近，空白對照組的pH值較其他處理組高，但各組魚糜pH值的差異均不顯著（P＞0.05）。實驗結果表明，酶解肽和VC對魚糜的pH值均無顯著影響（P＞0.05），羅非魚魚糜的pH值相對比較穩(wěn)定，在冷藏期間基本處于6.5～7.0之間，這是一個非常適合形成魚糜凝膠的pH值范圍。

圖2　不同處理組羅非魚魚糜在貯藏期間的pH值變化Fig.2 pH Change of tilapia surimi with different treatments during storage

2.3酶解產(chǎn)物對羅非魚魚糜TBARS值的影響

圖3　不同處理組羅非魚糜在貯藏期間TBARS值的變化Fig.3 TBARS value change of tilapia surimi with different treatments during storage

魚肉脂肪中含有較高比例的不飽和脂肪酸，因此抑制脂肪氧化是魚糜加工和貯藏過程中一個極為重要的問題。圖3是不同處理魚糜樣品在貯藏過程中TBARS值的變化情況。在貯藏初期，各處理樣品之間差異不大（P＞0.05）；隨著貯藏時間延長，樣品的TBARS值均呈上升態(tài)勢，但各處理組魚糜的TBARS值均低于空白對照組（P＜0.05），且各組之間差異均顯著（P＜0.05）。酶解液和＜5 kD酶解肽處理組的TBARS值的變化趨勢與VC處理組基本一致，呈現(xiàn)出較強的抗氧化能力，但＜5 kD酶解液的抗氧化能力更強，接近于VC的抗氧化效果。說明羅非魚內(nèi)臟酶解產(chǎn)物可以作為自由基清除劑，抑制油脂的鏈式氧化反應，有效控制油脂的氧化。

魚糜這一復雜的食品體系中存在的金屬離子可誘導脂蛋白、磷脂和脂肪酸發(fā)生脂質氧化反應及過氧化反應，生成丙二醛。丙二醛會影響線粒體呼吸鏈復合物及線粒體內(nèi)關鍵酶的活性[22-23]。純丙二醛在中性條件下穩(wěn)定，但在酸性條件下不穩(wěn)定，在食品體系中可以繼續(xù)反應生成更為復雜的終產(chǎn)物；因此圖3中丙二醛含量變化呈起伏波動狀態(tài)，說明在一個階段丙二醛的生成量大于其進一步反應的消耗量，而在另一個階段丙二醛的生成量小于其進一步反應的消耗量。

2.4酶解產(chǎn)物對羅非魚魚糜羰基含量的影響

蛋白質羰基化是指蛋白質中的氨基酸殘基如賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸殘基側鏈中的氨基和/或亞氨基因受H2O2中氧自由基攻擊在金屬（Fe）離子催化氧化系統(tǒng)中轉變?yōu)槿┗?、并釋放NH4＋的反應過程。蛋白質羰基是一些氨基酸在蛋白質氧化過程中的一個早期標志，也是蛋白質受到自由基攻擊的標志，羰基含量直接反映了蛋白質損傷的程度。人類的衰老以及某些疾病如心血管病、糖尿病風濕性關節(jié)炎會產(chǎn)生蛋白質羰基并在人體內(nèi)相關組織中蓄積[24-25]。

圖4　不同處理組羅非魚魚糜在貯藏期間的羰基含量的變化Fig.4 Carbonyl value change of tilapia surimi with different treatments during storage

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，各處理組樣品的羰基含量明顯升高，其中空白對照組和酶解液組樣品的羰基含量更高，二者無顯著差異（P＞0.05），說明這兩組的蛋白質氧化比較嚴重；而＜5 kD酶解肽處理組和VC組的羰基含量明顯低于前兩組（P＜0.05），＜5 kD酶解肽處理組的羰基含量變化勢與VC處理組一致，而VC處理組的羰基含量則明顯低于＜5 kD酶解肽處理組，說明VC抑制蛋白氧化效果最為顯著（P＜0.05）。酶解液在抗蛋白氧化能力上與VC有差距，但＜5 kD的酶解肽抗蛋白質氧化效果優(yōu)于酶解液（P＜0.05）。本課題組的前期實驗結果[10]表明，酶解液具有較強的還原力和清除超氧陰離子自由基的能力，這可以在一定程度上抑制羰基化過程中金屬離子和H2O2對蛋白質中氨基酸殘基的催化、氧化作用，從而降低羰基的形成。此外，酶解液可以有效地清除羥自由基，而羥自由基可直接作用于肽鍵，使其斷裂，在斷裂處即產(chǎn)生羰基。

2.5酶解產(chǎn)物對羅非魚魚糜感官品質的影響

由表2可知，隨著貯藏時間的增加，各處理組魚糜的各項感官評分逐漸降低。貯藏初期各處理組樣品的色澤亮白，氣味具有魚糜特有的氣味，沒有脂肪氧化味、異味，總體接受度較高；貯藏后期各組處理樣品的色澤出現(xiàn)變化，出現(xiàn)異味，尤其是空白對照組樣品在感官上已難以被人接受，但VC和＜5 kD酶解肽處理組在氣味和酸敗味方面極顯著優(yōu)于其他組別（P＜0.01）。在整個貯藏過程中，各組樣品的總體可接受度均呈下降趨勢，空白對照組在貯藏末期與其他處理組之間呈顯極著差異（P＜0.01），無法被消費者接受。實驗表明酶解液小分子肽具有抗氧化活性，能較好地控制魚糜品質的氧化劣變，其中＜5 kD的蛋白酶解肽液對于魚糜的品質保藏效果更好，與VC接近。

表2　不同處理組羅非魚糜在貯藏期間的感官評定結果Table 2 Sensory evaluation scores of tilapia surimi with different treatments during storage

3　結 論

添加酶解產(chǎn)物的魚糜樣品白度值在貯藏期內(nèi)高于空白對照組樣品，＜5 kD酶解肽樣品白度值與添加VC的樣品沒有顯著性差異（P＞0.05），色澤保持地較好。酶解肽對魚糜的pH值無顯著性影響（P＞0.05），冷藏期間羅非魚魚糜的pH值穩(wěn)定在6.5～7.0之間，不會影響魚糜凝膠的形成。酶解液和＜5 kD酶解肽處理組的TBARS值的變化趨勢顯示肽具有較強的抗氧化能力，但＜5 kD酶解肽處理組的抗氧化能力更接近于VC的抗氧化效果。酶解液具有抗蛋白氧化能力，尤其是＜5 kD酶解肽抗蛋白質氧化效果優(yōu)于酶解液（P＜0.05）。實驗表明，酶解液小分子肽具有抗氧化活性，能較好地控制魚糜蛋白質品質的氧化劣變，其中＜5 kD的蛋白酶解肽液對于魚糜的品質保藏效果更好，與VC接近。酶解肽作為魚糜中油脂和蛋白質抗氧化劑具有令人期待的應用前景。

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Peptides Derived from Enzymatic Hydrolysis of Tilapia Viscera Inhibit Lipid and Protein Oxidation in Refrigerated Surimi

GUO Liping1,RONG Jing2,YANG Ning3,GUO Shanguang2
(1.Department of Light Chemical Engineering,Guangdong Industry Polytechnic,Guangzhou 510300,China; 2.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China; 3.Guangdong Science and Technology Exchange Centre,Guangzhou 510033,China)

Abstract:The enzymatic hydrolysate of tilapia viscera and its ultrafi ltration fraction(peptide < 5 kD)were separately added to tilapia surimi to explore their inhibitory effects on lipid and protein oxidation during refrigeration(0–4 ℃).The results showed that both the hydrolysate and its fraction improved the color of tilapia surimi(P < 0.05),especially the latter,which was nearly as effective as VC at a certain dose.The hydrolysate demonstrated strong antioxidant capacity against both lipid and protein oxidation in surimi during storage(P < 0.05),which,however,was inferior to that of its ultrafi ltration fraction.To sum up,the hydrolysate can effectively maintain the quality of surimi during refrigerated storage,and the peptides < 5 kD separated from it by ultrafi ltration possess better antioxidant activity.

Key words:surimi; peptides derived from enzymatic hydrolysis; protein oxidation; ultrafi ltration; antioxidant activity

中圖分類號：TS254.4

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0089-05

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605017 10.7506/spkx1002-6630-201605017.http://www.spkx.net.cn 10.7506/spkx1002-6630-201605017.http://www.spkx.net.cn

作者簡介：郭利平（1963—），女，副教授，碩士，主要從事食品生物技術研究。E-mail：glp336@126.com

基金項目：廣東省科技計劃項目（2009B020313003）

收稿日期：2015-03-25