不同劑量培哚普利對缺血性心功能障礙家兔心功能及ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)軸的影響

郝　瀟，　李樹仁，　孟田田，　高　青，　黨　懿，　荀麗穎，　苑可心，　張倩輝，　郝清卿，　齊曉勇

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省人民醫(yī)院心臟一科，河北 石家莊 050051)

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不同劑量培哚普利對缺血性心功能障礙家兔心功能及ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)軸的影響

郝瀟，李樹仁△，孟田田，高青，黨懿，荀麗穎，苑可心，張倩輝，郝清卿，齊曉勇

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省人民醫(yī)院心臟一科，河北 石家莊 050051)

[摘要]目的： 探討不同劑量培哚普利對缺血性心功能障礙家兔心功能的影響。方法：采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的方法制作缺血性心功能障礙家兔模型。利用隨機(jī)數(shù)字表法將30只家兔隨機(jī)分為培哚普利大、小劑量組和心功能障礙組。大、小劑量組分別給予培哚普利生理鹽水溶液(濃度分別為1 g/L、0.33 g/L)2 mL·kg-1·d-1灌胃；心功能障礙組給予等量生理鹽水灌胃。4周后心臟超聲測定心功能；real-time PCR檢測血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)和血管緊張素2型受體(angiotensin type 2 receptor，AT2R) mRNA表達(dá)；ELISA檢測家兔血清血管緊張素(angiotensin,Ang)-(1-9)和Ang-(1-7)水平。結(jié)果：與心功能障礙組相比，不同劑量培哚普利均可改善心功能(P<0.01)，大劑量培哚普利比小劑量培哚普利改善心功能的效果顯著(P<0.05)；心功能障礙家兔應(yīng)用培哚普利后，血清Ang-(1-9)和Ang-(1-7)水平均增高(P<0.01)，ACE2和AT2R mRNA表達(dá)均增加(P<0.01)；與小劑量組相比，大劑量組心肌ACE2和AT2R mRNA表達(dá)均增高(P<0.01)，血清Ang-(1-9)水平增高(P<0.05)，血清Ang-(1-7)水平無明顯增加。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，左室射血分?jǐn)?shù)與血清Ang-(1-9)、ACE2及AT2R水平呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與血清Ang-(1-7)水平無相關(guān)關(guān)系。結(jié)論：大劑量培哚普利較小劑量培哚普利可以更有效改善缺血性心功能障礙家兔心功能，其心功能的改善可能與Ang-(1-9)水平增多，引起AT2R活化相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]培哚普利；心功能障礙； 血管緊張素-(1-9)； 血管緊張素-(1-7)

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)在心力衰竭的治療中起基石作用，為心力衰竭管理指南推薦用藥[1-3]。不同指南推薦ACEI應(yīng)用劑量不一致，國內(nèi)培哚普利應(yīng)用量偏小。ACE2由Tipnis等[4]發(fā)現(xiàn)，其催化產(chǎn)物為血管緊張素(angiotensin,Ang)-(1-9)和Ang-(1-7)。不同劑量的ACEI能否通過ACE2/Ang-(1-9)/ Ang-(1-7)軸發(fā)揮心臟保護(hù)性作用尚不完全明確。本研究給予心肌梗死后心功能障礙家兔不同劑量ACEI培哚普利，觀察家兔心肌血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)及血管緊張素2型受體(angiotensin type 2 receptor,AT2R)表達(dá)、血清Ang-(1-9)及Ang-(1-7)水平和心功能的變化，觀察不同劑量培哚普利治療心功能障礙的差別，并探討可能機(jī)制。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選用健康3月齡新西蘭雄性家兔共30只，體重約(2.73±0.13)kg，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

培哚普利片(雅施達(dá)制藥有限公司)；注射用青霉素鈉(華北制藥)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、隨機(jī)引物(Promega)；熒光定量PCR試劑盒(BBI)；PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；Ang-(1-9)及Ang-(1-7)試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)。心臟超聲儀(TOSHIBA)；7300熒光定量PCR儀(ABI)；紫外可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

3方法

3.1動(dòng)物分組及處理30只家兔隨機(jī)分為大劑量培哚普利(high-dose perindopril, HD)組、小劑量培哚普利(low-dose perindopril，LD)組及心功能障礙(cardial dysfunction, CD)組。心肌梗死2周后左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)低于50%為模型制作成功。模型制作成功后3組均以2 mL·kg-1·d-1灌胃4周(藥物濃度分別為1 g/L、0.33 g/L、0 g/L)。

3.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備采用結(jié)扎前降支的方法制作心功能障礙模型。記錄術(shù)前心電圖后開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)為心尖部及左室前壁由紅色變?yōu)榘底仙?，局部心肌運(yùn)動(dòng)異常，心電圖示胸前導(dǎo)聯(lián)ST段持續(xù)弓背向上抬高[5]。術(shù)后3 d每天青霉素80萬單位肌注。

3.3超聲心動(dòng)圖檢測心功能術(shù)前、術(shù)后2周及給藥后4周由同一?？漆t(yī)生行超聲心動(dòng)圖檢查，測量各組LVEF和左室舒張末期內(nèi)徑(end diastolic diameter，EDD)。所有測量值均取3次測量的平均值。

3.4Real-time PCR法檢測心肌組織ACE2及AT2R mRNA的表達(dá)給藥4周后，取50 mg心肌梗死區(qū)域心肌組織進(jìn)行研磨，提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。GAPDH的上游引物為5′-CGCCTGGAGAAAGCTGCTAA-3′，下游引物為5′-CGACCTGGTCCTCGGTGTAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為103 bp[5]；ACE2的上游引物為5′-CAACACTTGAACCCCCTTATGA-3′，下游引物為5′-TGCTTTTGCTTCCTTCGGTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為133 bp；AT2R的上游引物為5′-GAAATCTACAGAGCAGCAACAGGA-3′，下游引物為5′-CATTGGAGCAGGTACAAGTGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為129 bp。將獲得的cDNA按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒操作說明書方法擴(kuò)增目的基因，PCR熱循環(huán)參數(shù)為96 ℃ 4 min，然后3步反應(yīng)：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，將目的基因表達(dá)的相對定量值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Real-time PCR采用2-ΔΔCt(ΔCt=目的基因Ct值-GAPDH Ct值，ΔΔCt=目的基因ΔCt值-內(nèi)參照基因ΔCt值)法計(jì)算結(jié)果[6]。將所得的AT2R mRNA表達(dá)量與LVEF進(jìn)行相關(guān)性分析。

3.5ELISA法檢測血清中Ang-(1-9)和Ang-(1-7)的含量用藥4周后，家兔麻醉后腹主動(dòng)脈取血，離心15min后取上清，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作；依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其A值計(jì)算相應(yīng)公式；依據(jù)公式和樣品A值計(jì)算樣品Ang-(1-9)和Ang-(1-7)的濃度。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析(one-way ANOVA)，多個(gè)樣本間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；相關(guān)變量間采用直線相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1心肌梗死后心功能障礙模型結(jié)果

30只新西蘭雄性家兔接受模型手術(shù)，術(shù)后共有25只存活，其中大劑量組9只，小劑量組8只，心功能障礙組8只。

2心臟超聲檢查結(jié)果

心肌梗死后2周心臟超聲顯示3組的LVEF及EDD無明顯區(qū)別；給藥4周后，大劑量組的LVEF較小劑量組及心功能障礙組顯著升高，小劑量組較心功能障礙組顯著升高；大劑量組的EDD較小劑量組及心功能障礙組顯著減小，小劑量組較心功能障礙組無明顯差異。見圖1、表1。

Figure 1.Comparison of cardiac function in different groups after 4 weeks treatment.

圖1各組間給藥4周后超聲心動(dòng)圖

表1各組間給藥4周后LVEF和EDD的比較

Table 1.Comparison of LVEF and EDD in different groups after 4 weeks treatment (Mean±SD.n=8～9)

GroupLVEFEDDHD50.61±3.21#12.67±0.35#LD46.44±1.66*13.33±0.27CD41.56±4.2713.69±0.49

*P<0.05vsCD group；#P<0.05vsLD group.

3心肌梗死區(qū)域組織ACE2和AT2R mRNA表達(dá)

與心功能障礙組相比，小劑量組ACE2及AT2R的mRNA表達(dá)均明顯增高；與小劑量組相比，大劑量組ACE2及AT2R的mRNA表達(dá)明顯增高。相關(guān)性分析顯示，心功能障礙家兔心功能與ACE2及AT2R的mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.720和0.613，見表2。

表2梗死區(qū)域ACE2及AT2R mRNA表達(dá)水平的比較

Table 2.The levels of ACE2 and AT2R mRNA expression in infracted zone(Mean±SD.n=8～9)

GroupACE2mRNAAT2RmRNA HD0.984±0.138#0.985±0.137# LD0.410±0.143*0.488±0.140* CD0.246±0.0800.291±0.086

*P<0.05vsCD group；#P<0.05vsLD group.

4血清Ang-(1-9)與Ang-(1-7)水平

與心功能障礙組相比，小劑量組血清Ang-(1-9)及Ang-(1-7)水平均明顯增高；與小劑量組相比，大劑量組血清Ang-(1-9)水平明顯增高，但血清Ang-(1-7)水平未見明顯增高；相關(guān)性分析顯示，心功能障礙家兔心功能與血清Ang-(1-9)水平呈正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.683；心功能與血清Ang-(1-7)水平未見相關(guān)性，見表3。

表3血清Ang-(1-9)及Ang-(1-7) 的比較

Table 3.The levels of serum Ang-(1-9) and Ang-(1-7)(μg/L.Mean±SD.n=8～9)

GroupAng-(1-9)Ang-(1-7)HD4.706±0.310#4.462±0.525LD3.857±0.493*4.033±0.640*CD3.033±0.2852.727±0.192

*P<0.05vsCD group;#P<0.05vsLD group.

討論

在心功能障礙的發(fā)生和進(jìn)展過程中，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活起著重要的作用。腎素-血管張素-醛固酮系統(tǒng)激活，AngII及醛固酮蓄積，分別作用于相應(yīng)受體，產(chǎn)生血管收縮、水鈉潴留及成纖維細(xì)胞增殖等作用。ACEI作為心力衰竭治療的基石，各大指南均有推薦而不同指南對ACEI劑量的應(yīng)用推薦并不一致。除增強(qiáng)對腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)及交感神經(jīng)系統(tǒng)等的作用外，各劑量ACEI在ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)軸的作用差異尚不明確。

ACE2可以催化AngII形成Ang-(1-7)，也可以催化AngI形成Ang-(1-9)，而Ang-(1-9)則可以通過ACE催化形成Ang-(1-7)。本研究在心肌梗死后心功能障礙動(dòng)物模型應(yīng)用不同劑量的ACEI代表藥物培哚普利，觀察大、小劑量培哚普利改善心功能的作用及其對ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)軸的作用。

作為ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)軸的下游因子，Ang-(1-7)激活Mas受體發(fā)揮心臟血管保護(hù)作用，這已得到廣泛的證實(shí)[7-10]。作為Ang-(1-7)的前體，Ang-(1-9)受到的關(guān)注程度遠(yuǎn)不如Ang-(1-7)。近年研究發(fā)現(xiàn)，Ang-(1-9)作為一種血管緊張肽，也有心血管保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在心功能障礙家兔，應(yīng)用培哚普利可明顯改善心功能，且大劑量組較小劑量組心功能改善更顯著；與心功能障礙組相比，應(yīng)用培哚普利明顯增加ACE2表達(dá)，大劑量組ACE2作用更明顯；與心功能障礙組相比，培哚普利可明顯增加血清Ang-(1-9)水平，大劑量組血清Ang-(1-9)水平更高。說明培哚普利可以通過ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)軸發(fā)揮心臟保護(hù)作用，同時(shí)也說明大劑量培哚普利可以通過調(diào)節(jié)ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)軸發(fā)揮更強(qiáng)的心臟保護(hù)作用。但大劑量培哚普利并不能明顯升高血清Ang-(1-7)水平，說明大劑量培哚普利與小劑量相比主要通過Ang-(1-9)增多發(fā)揮作用。

有研究顯示在血管緊張素受體家族中還存在AT2R，具有拮抗AT1R的作用，但AT2R在成年個(gè)體中表達(dá)水平較低[11-12]。Ang-(1-9)可以對抗Ang II引起的心肌細(xì)胞肥大，并受到AT2R阻滯劑PD123319的阻斷[13]。Ang-(1-9)在心衰動(dòng)物模型可以發(fā)揮劑量依賴的血管舒張作用，同樣該作用被AT2R受體阻滯劑阻斷[14]。最近有研究顯示Ang-(1-9)可以增加心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)的分泌，并可被AT2R阻滯劑所阻斷[15]。上述研究中加入Mas受體阻滯劑并不能阻斷Ang-(1-9)的上述作用，說明Ang-(1-9)可以通過激活A(yù)T2R發(fā)揮其對心血管系統(tǒng)的直接保護(hù)作用。

本研究顯示缺血性心功能障礙家兔應(yīng)用培哚普利后心肌AT2R mRNA表達(dá)顯著升高，大劑量組升高更明顯；且3組血清Ang-(1-9)水平依次遞減，提示培哚普利可能通過Ang-(1-9)增加AT2R表達(dá)。AT2R與心功能呈正相關(guān)關(guān)系，說明ACEI可以通過增加血清Ang-(1-9)水平，進(jìn)而激活A(yù)T2R來發(fā)揮延緩心臟重構(gòu)、改善心功能等心血管保護(hù)性作用。大劑量組血清Ang-(1-7)水平較小劑量組沒有顯著升高，提示大劑量組較小劑量組改善心功能除了已知的更能有效抑制腎素-血管緊張素-醛固酮、抑制交感神經(jīng)等，還可以通過新型腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)發(fā)揮其心臟保護(hù)功能，并且大劑量ACEI主要通過增加Ang-(1-9)而不是Ang-(1-7)來發(fā)揮其作用。有研究者推測Ang-(1-9)可能是一種內(nèi)生的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑。注射了Ang-(1-9)的心肌梗死大鼠，與對照組相比，血清和左室心肌ACE活性及血清AngII水平顯著降低[16]。說明Ang-(1-9)可能可以作為一種靜脈用藥物用于心功能障礙和心肌梗死的治療。但這需要更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究來驗(yàn)證。

本研究通過給予心肌梗死后心功能障礙家兔不同劑量培哚普利藥物治療，改善心功能障礙家兔的心功能，驗(yàn)證了大劑量培哚普利在心功能障礙治療中的肯定作用；探討了大劑量培哚普利較小劑量培哚普利改善心功能障礙家兔心功能的可能機(jī)制；證實(shí)了大劑量培哚普利可以通過調(diào)節(jié)ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)軸發(fā)揮心血管保護(hù)性作用。但由于目前AT2R的作用機(jī)制尚不完全明確，并且缺乏特異性AT2R阻滯劑，尚需要更多的研究證實(shí)Ang-(1-9)對AT2R的作用。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effects of perindopril at different doses on cardiac function and ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7) axis of ischemic cardiac dysfunction rabbits

HAO Xiao, LI Shu-ren, MENG Tian-tian, GAO Qing, DANG Yi, XUN Li-ying，YUAN Ke-xin, ZHANG Qian-hui, HAO Qing-qing, QI Xiao-yong

(DepartmentofCardiology,HebeiGeneralHospital,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China.E-mail:lsr64@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the different dose of perindopril on cardiac function in the rabbits with ischemic cardiac dysfunction. METHODS: Male rabbits weighing 2.5～3.0 kg (n=30) were randomly divided into 3 groups (n=10): high dose perindopril group (HD group), low dose perindopril group (LD group) and cardiac dysfunction group (CD group). The Left anterior descending coronary artery of the rabbits was ligatured for model preparation. In HD group, the rabbits were treated with perindopril split normal saline solution (1 g/L)2 mL·kg-1·d-1. In LD group, the rabbits were treated with perindopril split normal saline solution (0.33 g/L)2 mL·kg-1·d-1. In CD group, the rabbits were treated with normal saline solution 2 mL·kg-1·d-1. Four weeks after treatment, the cardiac function was measured via echocardiography, the mRNA expression of angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2)and angiotensin type 2 receptor (AT2R) was analyzed by real-time PCR, serum angiotensin (Ang)-(1-9) and Ang-(1-7) levels were detected by ELISA. RESULTS: Compared with CD group, the cardiac function of the 2 groups treated with perindopril was significantly improved (P<0. 01), and more improvement in HD group was observed than LD group (P<0.05). The serum angiotensin (Ang)-(1-9) and Ang-(1-7) level and the mRNA expression of ACE2 and AT2R in the 2 groups treated with perindopril were significantly improved (P<0.01). Compared with LD group, the mRNA expression of ACE2 and AT2R and the serum levels of Ang-(1-9) in HD group were significant improved (P<0.05), while no difference of serum Ang-(1-7) level was observed. Correlation analysis revealed that the improvement of the cardiac function was associated with serum Ang-(1-9) level, mRNA expression of ACE2 and AT2R (P<0.01), but has no significant correlation with serum Ang-(1-7) level. CONCLUSION: High dose of perindopril may improve more cardiac function in ischemic cardiac dysfunction model in rabbits. The mechanism may relate to increasing serum Ang-(1-7) level to activate AT2R.

[KEY WORDS]Perindopril; Cardiac dysfunction; Angiotensin-(1-9); Angiotensin-(1-7)

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.028

[中圖分類號]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 0311-85988732; E-mail: lsr64@126.com

[收稿日期]2015- 11- 04[修回日期] 2015- 12- 24

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0554- 05

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