ADD3可變剪接在結(jié)腸癌與正常組織間的差異表達(dá)*

陶　敏，　黃良祥，　蔡鵬威，　晉　龍，　吳文冰，　曾長青，　黃　毅，　伍嚴(yán)安

(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建省立醫(yī)院, 福建 福州 350001)

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ADD3可變剪接在結(jié)腸癌與正常組織間的差異表達(dá)*

陶敏，黃良祥，蔡鵬威，晉龍，吳文冰，曾長青，黃毅，伍嚴(yán)安△

(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建省立醫(yī)院, 福建 福州 350001)

[摘要]目的： 探討內(nèi)收蛋白3(ADD3)及其剪接體與結(jié)直腸癌(CRC)的關(guān)系。方法: Real-time PCR方法檢測50對CRC組織、20對結(jié)直腸息肉組織、經(jīng)5-氟尿嘧啶(5-FU)或奧沙利鉑干預(yù)前后的SW480(低轉(zhuǎn)移性)和SW620(高轉(zhuǎn)移性)結(jié)腸癌細(xì)胞中ADD3-、ADD3-Ia和ADD3-Ib 的表達(dá)量。用MTT檢測細(xì)胞的活力，用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲性。結(jié)果: CRC組織中ADD3與ADD3-Ib的表達(dá)量低于正常組織(P<0.01)，ADD3-Ia/Ib 比值高于正常組織(P<0.01)；病理分組發(fā)現(xiàn)ADD3-Ia在T3-4組的表達(dá)量較T1-2組高(P<0.05)。結(jié)直腸息肉組織中ADD3、ADD3-Ia和ADD3-Ib的表達(dá)量低于正常組織(P<0.01)。SW620細(xì)胞中ADD3-Ia和ADD3-Ib的表達(dá)量低于SW480細(xì)胞(P<0.05), ADD3-Ia/Ib比值高于SW480(P<0.01)；在經(jīng)奧沙利鉑和5-FU分別處理后，在SW620和SW480細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力減弱，而ADD3、ADD3-Ia和ADD3-Ib的表達(dá)量均有不同程度增高。結(jié)論: CRC中ADD3-Ib和ADD3減少，并伴隨ADD3-Ia/Ib比值升高。ADD3及其剪接體的改變可能跟CRC的侵襲能力有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]ADD3； 結(jié)直腸癌； 可變剪接； 細(xì)胞侵襲

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化道最常見的惡性腫瘤之一，死亡率在世界上排名第3位，在我國排名第5位，每年約有608萬人死于CRC[1]。CRC發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為基因突變是癌變過程中最早涉及的初級遺傳事件，而在CRC發(fā)展過程中將會引發(fā)次級分子事件，即基因表達(dá)改變，如差異性表達(dá)、可變剪接與融合基因。近幾年，一些基因表達(dá)的可變剪接體與腫瘤的關(guān)系受到重視，內(nèi)收蛋白3(adducin 3，ADD3)可變剪接體就是其中的一個。已有報(bào)道ADD3可變剪接的表達(dá)差異跟非小細(xì)胞肺癌[2]及小鼠乳腺癌細(xì)胞[3]有關(guān)，本研究組在前期工作中發(fā)現(xiàn)一例CRC患者的ADD3可變剪接在CRC與正常組織的表達(dá)存在差異[4]，這些均引起我們進(jìn)一步探討ADD3可變剪接體與CRC關(guān)系的興趣。

ADD3的基因定位于染色體10q24.2-24.3，含15個外顯子。ADD3是1986年Gardner等在紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞膜骨架蛋白，其有參與細(xì)胞膜骨架網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)建和維持、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)等多項(xiàng)生理功能[5]。由于啟動子選擇和剪接方式不同，ADD3基因產(chǎn)生3種mRNA差異剪接體，即變體1(variant 1)、變體2(variant 2)，和變體3(variant 3)，表達(dá)2種蛋白：ADD3亞型a(isoform a,Ia)，由變體1翻譯，表達(dá)第14號外顯子；ADD3亞型b(isoform b,Ib)，由變體2和變體3翻譯，第14號外顯子表達(dá)缺失。本研究探討CRC中總ADD3的mRNA、ADD3亞型a(ADD3-Ia)和ADD3亞型b(ADD3-Ib)mRNA的變化及其意義。

材料和方法

1組織和細(xì)胞

1.1CRC和息肉組織在知情同意的情況下收集2012年9月～2013年6月于本院胃腸外科及腫瘤外科手術(shù)的50例CRC患者的癌組織及距離癌灶邊緣>5 cm的上游正常黏膜組成配對樣本，其中結(jié)腸癌25例，直腸癌25例。20例息肉患者在腸鏡下取出的息肉組織及距離息肉邊緣>5 cm的上游正常黏膜組成配對樣本。結(jié)腸息肉18例，直腸息肉2例。結(jié)直腸息肉多數(shù)為1～2個，少數(shù)為3～4個散在多發(fā)息肉，直徑0.3 cm～1 cm，未見家族性腺瘤性息肉病表現(xiàn)，均無家族性腺瘤性息肉病家族史。所有樣本均在20 min內(nèi)切下即放入RNA保存液，-80 ℃保存至檢測。所有病例術(shù)前均未接受化療，放療及生物治療、所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)。

1.2結(jié)直腸癌細(xì)胞株采用國內(nèi)外通用，來自同一親本，遺傳背景一致的人大腸癌高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株 SW620 和低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株 SW480[6]。SW480購自中科院上海細(xì)胞研究所，SW620由福建省腫瘤醫(yī)院研究室贈予。

2主要試劑

RNA保存液、TRIzon總RNA提取試劑和GoldStar TaqMan Mixture(with ROX)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；RevertAidTM第一鏈cDNA 合成試劑盒購自Thermo；不完全L-15培養(yǎng)基購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清購自天津?yàn)笊镏破酚邢薰?；胰酶購自Gibco；MTT購自Amresco。Transwell 24孔板和Matrigel基質(zhì)膠購自Corning。所用引物和探針由上海英濰捷基公司合成，序列見表1。

表1　引物和探針序列

3主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞置于含10%胎牛血清不完全L-15培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液 1 次，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞。

3.2MTT比色法檢測細(xì)胞活力將SW620和SW480細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，每孔接種細(xì)胞數(shù)為2×103，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h；吸棄孔中培養(yǎng)基，加入100 μL 含有濃度為0 mg/L、0.05 mg/L、0.5 mg/L和5 mg/L的奧沙利鉑培養(yǎng)液或濃度為0 mg/L、0.01 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L和100 mg/L的5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU) 的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，加入5 g/L的MTT 10 μL，37 ℃孵育4 h后小心吸去上清，加入150 μL二甲基亞砜，振蕩溶解結(jié)晶后用490 nm波長比色，評價細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力取對數(shù)生長期的細(xì)胞按每孔5×105加入12孔板，90%融合后，用10 μL無菌槍頭均勻劃痕，PBS洗3次，更換為含2%胎牛血清的培養(yǎng)基，分組加入不同藥物。37℃、 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后觀察劃痕愈合情況并拍照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.4Transwell實(shí)驗(yàn)用無血清培養(yǎng)基1∶9稀釋基質(zhì)膠，吸50 μL均勻鋪于Transwell上室。分組加入不同藥物，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×108/L；取100 μL細(xì)胞懸液加入上室，下室加600 μL 10%胎牛血清培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。取出小室，4%多聚甲醛固定后加0.1%結(jié)晶紫染色，PBS洗2次，用棉簽小心擦去上室細(xì)胞，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野計(jì)數(shù)細(xì)胞并拍照(×200)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.5藥物干預(yù)將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，細(xì)胞密度為5×108/L，每組設(shè)3個復(fù)孔，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液，加入不含血清的培養(yǎng)液2 mL，饑餓培養(yǎng)24 h后分別換用含有濃度為0 mg/L、0.05 mg/L、0.5 mg/L和5 mg/L的奧沙利鉑培養(yǎng)液及濃度為0 mg/L、0.01 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L和100 mg/L的5-FU的培養(yǎng)液2 mL，24 h后用TRIzon試劑收集各孔細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.6Real-time PCR將收集的細(xì)胞和組織按照TRIzon總RNA提取試劑的操作說明書進(jìn)行總RNA的提取，紫外分光光度計(jì)比色后選用A260/A280在1.8～2.0的標(biāo)本1 μg逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取50 ng cDNA進(jìn)行real-time PCR：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃60 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用國際通用的real-time PCR相對定量2-ΔΔCt方法[7]表示ADD3、ADD3-Ia、ADD3-Ib和ADD3-Ia/Ib的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間均值的比較采用t檢驗(yàn)，病理分析運(yùn)用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，各用藥細(xì)胞組內(nèi)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，LSD-t法行各組間均數(shù)的兩兩比較。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均在SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包上進(jìn)行。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1CRC組織的ADD3表達(dá)量比較

CRC中ADD3的表達(dá)量低于正常組織(P<0.01)，50例中表達(dá)量低者有37例(74%)；ADD3-Ia表達(dá)量較正常黏膜組織無顯著改變；ADD3-Ib表達(dá)量低于正常組織(P<0.01)，50例中表達(dá)量低者有42例(84%)；ADD3-Ia/Ib的比值高于正常組織(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of ADD3 in the CRC. Mean±SD.n=50.**P<0.01vsnormal.

圖1CRC組織ADD3及各亞型的mRNA表達(dá)量

2CRC組織的病理分析

將50對CRC組織(病理圖片見圖2)根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會和國際抗癌聯(lián)盟結(jié)直腸癌TNM分期(第7版)劃分深度(T1組1例，T2組12例，T3組3例，T4組34例)，比較后發(fā)現(xiàn)ADD3-Ia的表達(dá)量在T3-4組中為2.119±1.246，顯著高于T1-2組的1.081±0.405(P<0.05),見圖3。

Figure 2.The pathological images of the CRC and colorectal polyp tissues (HE staining).

圖2CRC病理組織和息肉組織的形態(tài)學(xué)觀察

Figure 3.The mRNA expression of ADD3-Ia in T1-2 and T3-4 groups. Mean±SD.n=10～37.*P<0.05vsT1-2 group.

圖3ADD3-Ia mRNA在病理分組T1-2和T3-4中的表達(dá)量

2結(jié)直腸息肉組織ADD3表達(dá)量的比較

ADD3、ADD3-Ia和ADD3-Ib表達(dá)量在結(jié)直腸息肉組織(病理圖片見圖2)中分別為1.050±0.806、1.105±0.486和1.130±0.615，均低于正常組織(P<0.01)；ADD3-Ia/Ib各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。

Figure 4.The mRNA expression of ADD3 in the colorectal polyps. Mean±SD.n=20.**P<0.01vsnormal.

圖4結(jié)直腸息肉 ADD3的mRNA表達(dá)量比較

3SW620細(xì)胞和SW480細(xì)胞中ADD3的表達(dá)差異

SW620細(xì)胞中ADD3的表達(dá)量與SW480細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；SW620細(xì)胞中ADD3-Ia和ADD3-Ib的表達(dá)量低于SW480(P<0.05)，ADD3-Ia/Ib比值高于SW480細(xì)胞(P<0.01)，見圖5。

4MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)不同劑量奧沙利鉑和5-FU分別處理24 h后SW620細(xì)胞和SW480細(xì)胞的生存率均受到不同程度抑制，見圖6。

Figure 5.The mRNA expression of ADD3 in SW480 cells and SW620 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsSW480.

圖5ADD3 mRNA在 SW480細(xì)胞和SW620細(xì)胞中的表達(dá)量比較

Figure 6.The effect of oxaliplatin or 5-FU on the survival of SW620 and SW480 cells detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L.

圖6經(jīng)奧沙利鉑或5-FU處理后SW620細(xì)胞和SW480細(xì)胞存活率的比較

5劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)奧沙利鉑和5-FU分別處理后，細(xì)胞愈合速度明顯慢于各自對照組細(xì)胞，表明加藥后SW480細(xì)胞和SW620細(xì)胞的遷移速度減慢，見圖7。

6Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)奧沙利鉑和5-FU分別處理后，細(xì)胞穿膜數(shù)明顯少于各自對照組細(xì)胞，表明5-FU和奧沙利鉑作用后SW480細(xì)胞和SW620細(xì)胞的侵襲能力降低，見圖8。

7藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)

SW480細(xì)胞和SW620細(xì)胞經(jīng)不同濃度奧沙利鉑和5-FU分別處理后，ADD3、ADD3-Ia和ADD3-Ib的mRNA表達(dá)量均有不同程度升高。但是在5-FU達(dá)到10 mg/L、100 mg/L的較大濃度時，ADD3 各指標(biāo)表達(dá)量下降，見圖9、10。

Figure 7.The wound-healing assay of SW480 cells and SW620 cells (×100). It showed that the cell migration was inhibited by oxaliplatin or 5-FU.

圖7SW480細(xì)胞和SW620細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)

討論

真核生物中，成熟的mRNA是由初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物前mRNA(pre-mRNA)經(jīng)過剪接過程產(chǎn)生。一種pre-mRNA具有多種剪接程序，從而形成不同的mRNA。異常剪接、剪接過程改變，甚至某一特定可變剪接的轉(zhuǎn)換，都可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的某一階段起到重要作用。有研究表明可變剪接產(chǎn)生蛋白質(zhì)亞型的比例的改變可引發(fā)疾病[8]。

Kwong等[2]對非小細(xì)胞肺癌組織的研究發(fā)現(xiàn)：相對于正常組織，ADD3剪接體中缺失第14號外顯子的剪接體(在本研究中即ADD3-Ib)在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)減低。Bisognin等[9]對46例CRC組織，23例正常結(jié)直腸黏膜組織和27例肝轉(zhuǎn)移的可變剪接研究中，發(fā)現(xiàn)某些腫瘤特異性的可變剪接常見于結(jié)直腸癌早期，可變剪接在正常組織和癌癥的早期含量豐富，到了肝轉(zhuǎn)移時大幅下跌。Rani等[10]的研究發(fā)現(xiàn)微小RNA-145(miR-145)通過調(diào)節(jié)蛋白Sox9和細(xì)胞黏附分子ADD3的活性來行使其腫瘤抑制作用從而減少人類膠質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖、黏附和侵襲能力。

Figure 8.The images of the cell invasion assay (×200). It showed that the invasion abilities of SW480 cells and SW620 cells were inhibited by oxaliplatin or 5-FU.

圖8細(xì)胞侵襲性實(shí)驗(yàn)

Figure 9.The effect of oxaliplatin on the mRNA expression of ADD3 in SW480 cells and SW620 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L.

圖9經(jīng)奧沙利鉑處理后SW480細(xì)胞和SW620細(xì)胞ADD3的mRNA 表達(dá)量

Figure 10.The effect of 5-FU on the mRNA expression of ADD3 in SW480 cells and SW620 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L.

圖10經(jīng)5-FU鉑處理后SW480細(xì)胞和SW620細(xì)胞ADD3的mRNA 表達(dá)量

結(jié)合本研究結(jié)果提示了ADD3的表達(dá)減低可能跟細(xì)胞的侵襲和遷移功能有關(guān)。

本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADD3-Ib在1例CRC患者癌組織中表達(dá)量增加。本次研究中我們發(fā)現(xiàn)ADD3-Ia和ADD3-Ib兩種剪接體在正常組織和腫瘤組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量有顯著差異。ADD3的表達(dá)量包括ADD3-Ia和ADD3-Ib，ADD3-Ia的表達(dá)量較正常組織無顯著差異，而ADD3-Ib和ADD3在CRC組織中表達(dá)量顯著低于正常組織，說明ADD3在CRC組織中的表達(dá)量低于正常組織可能主要是與ADD3-Ib的顯著減少有關(guān)，伴隨著ADD3-Ia/Ib的比值顯著升高。

結(jié)直腸息肉組織中也存在ADD3和ADD3-Ib表達(dá)量較正常組織低的現(xiàn)象，這可能表示ADD3及其剪接體的表達(dá)量在良性組織中也發(fā)生了變化，與CRC不同的是ADD3-Ia在息肉組織中表達(dá)量明顯低于正常組織，ADD3-Ia/Ib比值較正常組織無顯著差異?？梢夾DD3及其剪接體的表達(dá)差異在結(jié)腸癌與息肉組織中存在差異。相比較于息肉，CRC中ADD3-Ia表達(dá)量上調(diào)，導(dǎo)致ADD3-Ia/Ib的比值顯著升高。經(jīng)病理分組分析后發(fā)現(xiàn)臨床分期更晚的T3～4組中ADD3-Ia的表達(dá)量高于臨床分期早的T1～2組。

在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分，從ATCC細(xì)胞庫中選擇高轉(zhuǎn)移性SW620和低轉(zhuǎn)移性SW480作為受試細(xì)胞株。檢測發(fā)現(xiàn)2株細(xì)胞的表達(dá)量存在明顯差異，這個結(jié)果提示了ADD3及其剪接體的改變可能與CRC的轉(zhuǎn)移性有關(guān)。用不同濃度奧沙利鉑和5-FU干預(yù)細(xì)胞，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遷移能力和侵襲能力均受到抑制，同時ADD3、ADD3-Ia和ADD3-Ib的表達(dá)量均有不同程度升高，從另一個角度驗(yàn)證了ADD3及其剪接體表達(dá)量的升高與結(jié)直腸癌細(xì)胞株遷移和侵襲能力下降相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，在CRC中ADD3可變剪接體的表達(dá)發(fā)生了改變，ADD3-Ia/Ib比值的升高可能是 ADD3可變剪接在CRC中的特征性表現(xiàn)，并可能與CRC的侵襲能力有關(guān)。下一步值得進(jìn)行的工作是探討其是否可能成為一種CRC標(biāo)志物,以及反映CRC侵襲性的標(biāo)志物。這一比值在CRC中的變化與腫瘤的因果關(guān)系尚不明確，亦需要進(jìn)一步的研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Differential expression of ADD3 splicing isoforms between colorectal cancer and normal mucosa tissues

TAO Min, HUANG Liang-xiang, CAI Peng-wei, JIN Long, WU Wen-bing, ZENG Chang-qing, HUANG Yi, WU Yan-an

(FujianProvincialHospital,ProvincialClinicalCollege,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China.E-mail:wyaslyy@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the relationship between the expression of adducin 3 (ADD3) and its splicing isoforms and colorectal cancer (CRC). METHODS: The expression of ADD3, ADD3-Ia and ADD3-Ib in 50 pair of CRC tissues, 20 pairs of colorectal polyp tissues, and 2 CRC cell lines SW480 and SW620 before and after oxaliplatin or fluorouracil intervention were detected by real-time PCR. The cell activity was determined by MTT assay, the cell migration ability was evaluated by wound-healing assay, and the cell invasion ability was measured by Transwell assay. RESULTS: The expression levels of ADD3 and ADD3-Ib were decreased in the CRC tissues as compared with the normal mucous (P<0.01), and ADD3-Ia/Ib ratio was increased in the CRC tissues (P<0.01). The expression level of ADD3-Ia was higher in T3-4 group than that in T1-2 group (P<0.05). Reduced expression of ADD3, ADD3-Ia and ADD3-Ib in colorectal polyps was observed compared with the normal tissues (P<0.01). Compared with the SW480 cells, the expression levels of ADD3-Ia and ADD3-Ib were lower (P<0.05) and the ADD3-Ia/Ib ratio was higher (P <0.01) in the SW620 cells. After treated with oxaliplatin or fluorouracil, the cell activity, migration and invasion in the SW620 and SW480 cells were weakened accompanied by the increases in the expression levels of ADD3, ADD3-Ia and ADD3-Ib to various certain extents. CONCLUSION: In CRC there is a tendency that ADD3-Ib reduction leads to ADD3 decrease, accompanied by an increased ADD3-Ia/Ib ratio. The expression changes of ADD3 and its splicing isoforms in the CRC may be relevant to its invasion ability.

[KEY WORDS]ADD3; Colorectal cancer; Alternative splicing; Cell invasion

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.011

[中圖分類號]R730.23; R735.3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 0591-88217897; E-mail: wyaslyy@126.com

*[基金項(xiàng)目]福建省衛(wèi)生計(jì)生委創(chuàng)新課題(No. 2012-CXB-6)

[收稿日期]2015- 07- 15[修回日期] 2015- 12- 28

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0451- 07

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