KPNA2基因沉默對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC7721和Bel7404增殖和侵襲能力的影響

王濤　馬思聰　戚星星　湯曉寅　崔丹　王智　池嘉昌　李萍　翟博

200127　上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腫瘤介入科

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·論著·

KPNA2基因沉默對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC7721和Bel7404增殖和侵襲能力的影響

王濤馬思聰戚星星湯曉寅崔丹王智池嘉昌李萍翟博

200127上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腫瘤介入科

【摘要】目的觀察核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因α2(Karyopherin α-2，KPNA2)基因沉默對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC7721和Bel7404增殖以及侵襲能力的影響。方法將KPNA2 siRNA干擾質(zhì)粒用LipofectaminTM 2000方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株SMMC7721和Bel7404，轉(zhuǎn)染后48 h應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中KPNA2蛋白表達(dá)。采用MTT法檢測(cè)基因沉默細(xì)胞增殖能力，采用Transwell法檢測(cè)基因沉默細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果SMMC7721細(xì)胞株對(duì)照組mRNA為1.02±0.13，高于siRNA轉(zhuǎn)染組的0.37±0.07(t=10.78，P<0.01)；肝癌Bel7404細(xì)胞株對(duì)照組mRNA為1.05±0.17，高于siRNA轉(zhuǎn)染組的0.36±0.06 (t=9.38，P<0.01)。肝癌SMMC7721細(xì)胞株對(duì)照組蛋白定量值為0.96±0.10，高于轉(zhuǎn)染組的0.42±0.05(t=11.83，P<0.01)；肝癌Bel7404細(xì)胞株對(duì)照組蛋白定量值為0.93±0.09，高于轉(zhuǎn)染組的0.48±0.06(t=10.19，P<0.01)。SMMC7721和Bel7404細(xì)胞株在24、48和72 h時(shí)對(duì)照組增殖能力高于轉(zhuǎn)染組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SMMC7721細(xì)胞株對(duì)照組侵襲能力值為126.20±21.61，高于siRNA轉(zhuǎn)染組的51.13±10.2 (t=7.68，P<0.01)；肝癌Bel7404細(xì)胞株對(duì)照組侵襲能力值為125.124±8.04，高于siRNA轉(zhuǎn)染組的55.20 ±18.54 (t=8.48，P<0.01)。結(jié)論KPNA2基因沉默可以調(diào)節(jié)人肝癌細(xì)胞株SMMC7721和Bel7404的增殖能力和侵襲能力。

【關(guān)鍵詞】KPNA2；肝癌細(xì)胞株；SMMC7721；Bel7404；增殖能力；侵襲能力

核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因α 2(Karyopherin α 2，KPNA2)是核定位信號(hào)區(qū)域的一種結(jié)合蛋白，其作為核孔靶向復(fù)合物的組成部分，通過與核定位信號(hào)相結(jié)合的方式將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)入核內(nèi)發(fā)揮作用，從而達(dá)到調(diào)節(jié)相應(yīng)基因表達(dá)的目的[1]。目前相關(guān)研究表明，KPNA2與細(xì)胞癌變密切相關(guān)，KPNA2基因沉默及過表達(dá)對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株5637的增殖能力有調(diào)節(jié)作用[2]。然而，目前有關(guān)KPNA2基因與肝癌的相關(guān)性的研究較少，其確切分子機(jī)制尚不清楚。本研究通過采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC7721和Bel7404進(jìn)行KPNA2基因沉默，探討KPNA2基因干擾對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC7721和Bel7404增殖以及轉(zhuǎn)移能力的影響，以期為深入研究KPNA2基因在肝腫瘤中異常表達(dá)的分子機(jī)制提供新思路。

資料和方法

一、材料與試劑

人肝癌細(xì)胞株SMMC7721和Bel7404購自于美國菌種保藏中心。DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。脂質(zhì)體LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司。質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒購自美國TIANGEN公司。兔抗人多克隆抗體KPNA2和TNFRSF12A購自美國Abcam公司，兔抗人多克隆抗體GAPDH購自美國R&D Systems公司。PCR試劑盒購自美國Bio-Rad公司。細(xì)胞增殖活性測(cè)試MTT試劑盒購自美國Sigma公司。BCA蛋白定量(WB)檢測(cè)試劑盒購自美國TIANGEN公司。iRNA提取試劑盒購自美國TIANGEN公司。

二、試驗(yàn)方法

(一)靶向KPNA2干擾質(zhì)粒的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)GenBank中KPNA2基因序列(序列號(hào)：NM_002266)，使用小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA)設(shè)計(jì)軟件，并用BLAST工具確保其序列為特異性序列。設(shè)計(jì)合成的siRNA序列為：正義鏈5′-CCGUUGAUGAACCUCUUAATT-3′；反義鏈5′-UUAAGAGGUUCAUCAACGGTT-3′；同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)陰性對(duì)照序列：正義鏈5′-UCCUCCGAACGU-GUCACGUTT-3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUUC-GGAGAATT-3′。siRNA合成由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司化學(xué)合成。

(二)細(xì)胞培養(yǎng)將冷凍保存于液氮中的肝癌細(xì)胞株SMMC7721和Bel7404復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基中，并加入100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素，然后置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2～3 d進(jìn)行1次培養(yǎng)基更換，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶壁約80%后，用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，接種于新的培養(yǎng)瓶中。

(三)分組和轉(zhuǎn)染本試驗(yàn)設(shè)轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組采用KPNA2 siRNA干擾質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對(duì)照組采用無關(guān)序列RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每組細(xì)胞設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔，每孔約1×106個(gè)細(xì)胞。放入CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長融合鋪滿孔壁約至80%時(shí)，采用脂質(zhì)體LipofectaminTM2000方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)用無血清的DMEM 培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h后換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，其余轉(zhuǎn)染過程按照說明書進(jìn)行。

(四)RT-PCT的基因檢測(cè)KPNA2引物上游5′- CTGCCCGTCTTCACAGATTCA -3′，引物下游5′- GCGGAGAAGTAGCATCATCAGG -3′；內(nèi)參GAPDH引物上游5′- GAGCGAGATCCCTCCAA-AAT -3′， 內(nèi)參引物下游5′- GGCTGTTGTCATAC-TTCTCATGG -3′。PCR擴(kuò)增條件為[3]：94 ℃預(yù)變性5 min，然后再94 ℃變性40 s、63 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，總共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。而后將PCR產(chǎn)物在3%的瓊脂糖凝膠中電泳30 min后觀察結(jié)果。

(五)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)KPNA2蛋白表達(dá)將各組已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞加入蛋白裂解緩沖液中提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。將總蛋白用8% SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至NC膜上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，而后置于含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中室溫反應(yīng)1 h，然后TBST洗2次，每次10 min。分別加入KPNA2一抗(1∶1000稀釋)、內(nèi)參GAPDH一抗(1∶1000稀釋)維持4℃溫育過夜。次日TBST洗膜3次，將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中作用1 h。暗室中ECL試劑盒顯影觀察結(jié)果。

(六)細(xì)胞增殖活性檢測(cè)將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞濃度為1×105/mL，采用逆向轉(zhuǎn)染的方法同步轉(zhuǎn)染KPNA2及對(duì)照，然后分別于24、48和72 h每孔加入10 μL MTT(0.5 mg/mL)，37 ℃溫育3 h后去除上清液，每孔加入150 μL DMSO，并于37 ℃孵育10 min，中間取出搖晃1次，使結(jié)晶充分溶解。測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算6孔的平均值。

(七)細(xì)胞侵襲力檢測(cè)將轉(zhuǎn)染前后的5×104個(gè)肝癌細(xì)胞株SMMC7721和Bel7404接種于上室，將20%的100 μL DMEM培養(yǎng)基置于Transwell小室的底室，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，此時(shí)細(xì)胞已遷移到膜的底面。對(duì)膜過濾的細(xì)胞用4%多聚甲醛溶液室溫固定10 min，結(jié)晶紫染色5 min，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野(×200)內(nèi)遷移細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行定量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間的比較采用t檢驗(yàn)；重復(fù)測(cè)量的資料采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)KPNA2 mRNA水平的影響

結(jié)果顯示，肝癌SMMC7721細(xì)胞中對(duì)照組和siRNA轉(zhuǎn)染組mRNA分別為1.02±0.13和0.37±0.07；肝癌Bel7404細(xì)胞中對(duì)照組和siRNA轉(zhuǎn)染組灰度比值分別為1.05±0.17和0.36±0.06。與陰性對(duì)照組比較，KPNA2 siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC7721和Bel7404細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染組KPNA2 mRNA水平顯著下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.78，P<0.01；t=9.38，P<0.01)。

二、轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)KPNA2蛋白表達(dá)水平的影響

結(jié)果顯示，肝癌SMMC7721細(xì)胞中對(duì)照組和siRNA轉(zhuǎn)染組灰度比值分別為0.96±0.10和0.42±0.05；肝癌Bel7404細(xì)胞中對(duì)照組和siRNA轉(zhuǎn)染組灰度比值分別為0.93±0.09和0.48±0.06。與陰性對(duì)照組比較，KPNA2 siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC7721和Bel7404細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染組KPNA2蛋白表達(dá)水平顯著下降(圖1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.83，P<0.01；t=10.19，P<0.01)。

A. SMMC7721細(xì)胞株 B. Bel7404細(xì)胞株

三、轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒對(duì)增殖能力的影響

SMMC7721和Bel7404細(xì)胞株增殖能力結(jié)果顯示，兩細(xì)胞株的組別與時(shí)間存在交互作用(F=27.9，P<0.01；F=13.6，P<0.01)。SMMC7721和Bel7404細(xì)胞株增殖能力的兩兩比較結(jié)果顯示，在24、48和72 h時(shí)對(duì)照組的吸光度值高于轉(zhuǎn)染組的值，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與0 h的吸光度值相比，24、48和72 h兩組均增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果表明SMMC7721和Bel7404細(xì)胞株轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制，見表1，圖2。

±s)

注：△表示與對(duì)照組比較P<0.05；▲表示與0 h比較P<0.05；*表示重復(fù)測(cè)量F檢驗(yàn)P<0.05

圖2　SMMC7721和Bel7404細(xì)胞株個(gè)時(shí)間點(diǎn)的增殖能力

四、轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒對(duì)侵襲能力的影響

SMMC7721和Bel7404細(xì)胞株侵襲能力結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染組的侵襲能力值均低于對(duì)照組的值，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.68，P<0.01；t=8.48，P<0.01)。該結(jié)果表明SMMC7721和Bel7404細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后，其侵襲能力明顯受到抑制，見表2。

±s)

討論

KPNA2基因位于染色體17q23-q24，長度為1981 bp，編碼產(chǎn)物是含529個(gè)氨基酸的核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[4]。KPNA2是Karyopherin輸入蛋白家族的成員，其主要作用是通過運(yùn)載細(xì)胞質(zhì)中的效應(yīng)蛋白分子(如轉(zhuǎn)錄因子)穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞核，從而達(dá)到在核內(nèi)調(diào)節(jié)效應(yīng)基因或其他信號(hào)分子的表達(dá)[4]。KPNA2作為新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)候選癌基因，與其相關(guān)的研究主要集中在乳腺癌、食管癌、卵巢癌病理特征或預(yù)后關(guān)系[5-7]，而關(guān)于KPNA2基因在腫瘤中表達(dá)調(diào)控的機(jī)制研究較少。

研究發(fā)現(xiàn)，KPNA2基因沉默和過表達(dá)可以調(diào)節(jié)人膀胱癌細(xì)胞株5673的增殖能力[2]、遷移能力和侵襲能力[8]。KPNA2在肝癌組織中存在高表達(dá)，但在癌旁正常肝組織中低表達(dá)，且KPNA2的高表達(dá)與肝癌的分期、病理分級(jí)呈正相關(guān)[4, 9]；然而有關(guān)KPNA2基因沉默對(duì)肝癌細(xì)胞基因表達(dá)，增殖能力和侵襲能力的調(diào)節(jié)作用仍然不清楚。RNA干擾是目前一種常用的基因沉默技術(shù)，通過與外源或內(nèi)源雙鏈RNA相結(jié)合從而達(dá)到在生物體內(nèi)誘導(dǎo)特異性基因沉默的目的[2]。本研究選用適度表達(dá)KPNA2的人肝癌SMMC7721和Bel7404細(xì)胞株作為細(xì)胞模型進(jìn)行相關(guān)研究，并設(shè)計(jì)合成靶向siKPNA2干擾質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染SMMC7721和Bel7404細(xì)胞。

本研究結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，siRNA轉(zhuǎn)染的肝癌SMMC7721、Bel7404細(xì)胞株KPNA2的mRNA測(cè)量值和KPNA2蛋白表達(dá)水平顯著下降，表明siRNA轉(zhuǎn)染能達(dá)到有效抑制KPNA2和KPNA2蛋白表達(dá)水平。與陰性對(duì)照組比較， siRNA轉(zhuǎn)染的肝癌SMMC7721、Bel7404細(xì)胞株增殖能力和侵襲能力均得到了有效抑制。大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路是通過細(xì)胞質(zhì)中的一些效應(yīng)分子進(jìn)入細(xì)胞核，并調(diào)節(jié)效應(yīng)基因或其他信號(hào)分子的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。較小的效應(yīng)分子例如離子和相對(duì)分子質(zhì)量<20～40×103的蛋白，能通過擴(kuò)散作用直接穿過核孔復(fù)合物；而相對(duì)分子質(zhì)量>40×103的蛋白要想穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞核，必須通過核孔復(fù)合物的轉(zhuǎn)運(yùn)才能通過核孔[2]。KPNA2就是其中一種運(yùn)載蛋白，因此對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC7721和Bel7404進(jìn)行KPNA2基因沉默，能夠抑制其運(yùn)載效應(yīng)分子進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行調(diào)節(jié)效應(yīng)基因和其他信號(hào)分子表達(dá)，從而達(dá)到抑制肝癌SMMC7721、Bel7404細(xì)胞株增殖和侵襲的能力的目的。

綜合上述，通過RNAi技術(shù)沉默KPNA2可以調(diào)節(jié)人肝癌細(xì)胞株SMMC7721和Bel7404的增殖能力和侵襲能力。可以將KPNA2作為抑制肝癌生長和轉(zhuǎn)移的期望靶點(diǎn)，通過抑制其基因表達(dá)，達(dá)到阻止腫瘤增殖和生長的目的。

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(本文編輯：錢燕)

The impacts of KPNA2 gene silencing on the proliferation and invasion of human hepatocarcinoma cell lines SMMC7721 and Bel7404WANGTao,MASi-cong,QIXing-xing,TANGXiao-yin,CUIDan,WANGZhi,CHIJia-chang,LIPing,ZHAIBo.DepartmentofInterventionalOncology,RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai, 200127,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the impacts of Karyopherin α-2 (KPNA2) gene silencing on proliferation and invasion of human hepatocarcinoma cell lines SMMC7721 and Bel7404. MethodsHuman hepatocarcinoma cell lines SMMC7721 and Bel7404 were transiently transfected with KPNA2 siRNA through adoption of LipofectaminTM 2000. Protein immunoblotting was performed to detect KPNA2 protein expression in transfected cells at 48 hours after transfection. MTT assay was carried out to assess proliferative capability of gene silencing cells, and Transwell assay was used to evaluate their invasion ability. ResultsRelative mRNA level of KPNA2 in control group of SMMC7721 and Bel7404 was higher than that in siRNA-transfected group (1.02±0.13 vs. 0.37±0.07, t=10.78, P<0.01; 1.05±0.1 vs. 70.36±0.06, t=9.38, P<0.01, respectively). Relative protein level in control group was higher than that in transfected group (0.96±0.10 vs. 0.42±0.05, t=11.83, P<0.01; 0.93±0.09 vs. 0.48±0.06, t=10.19, P<0.01, respectively). Proliferative capacity of control groups was stronger than that in transfected groups at 24h, 48h and 72h respectively, which revealed statistically significant differences (P<0.05). Invasive capacity in control group was more powerful than that in siRNA-transected group (126.20±21.61 vs. 51.13±10.2, t=7.68, P<0.01; 125.124±8.04 vs. 55.20 ±18.54, t=8.48, P<0.01, respectively ). ConclusionKPNA2 gene silencing could adjust the proliferative capacity and invasive ability of human hepatocarcinoma cell lines SMMC7721 and Bel7404.

【Key words】KPNA2; Hepatocarcinoma cell lines; SMMC7721; Bel7404; Proliferative capacity ; Invasion ability

(收稿日期：2015-09-15)

Corresponding author:ZHAI Bo, Email: zhaiboshi@sina.com

通信作者：翟博，Email：zhaiboshi@sina.com

基金項(xiàng)目：本項(xiàng)課題受國家自然科學(xué)基金(青年項(xiàng)目)資助(81201678)