經(jīng)肝固有動脈自體骨髓間充質干細胞移植治療失代償期肝硬化的療效及安全性

鄭盛　楊涓　劉瓊　樓維新

650011　云南省第三人民醫(yī)院肝病中心(鄭盛，楊涓)；解放軍第五三三醫(yī)院肝病科(劉瓊，樓維新)

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·論著·

經(jīng)肝固有動脈自體骨髓間充質干細胞移植治療失代償期肝硬化的療效及安全性

鄭盛楊涓劉瓊樓維新

650011云南省第三人民醫(yī)院肝病中心(鄭盛，楊涓)；解放軍第五三三醫(yī)院肝病科(劉瓊，樓維新)

【摘要】目的觀察經(jīng)肝固有動脈行自體骨髓間充質干細胞(BMSC)移植治療失代償期肝硬化的療效及其安全性。方法將2012年6至2013年6月解放軍第五三三醫(yī)院肝病科收治的84例失代償期患者隨機分為移植組36例和對照組48例。對照組予以基礎治療(護肝、降黃、對癥和支持治療)，移植組在基礎治療上行經(jīng)肝固有動脈注入自體BMSC治療。觀察兩組丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、白蛋白(Alb)、總膽紅素(TBil)、凝血酶原時間(PT)、終末期肝病模型評分(MELD)的變化情況，分別在4、12、24、48周進行隨訪；兩組肝功能指標比較用獨立t檢驗，治療后不同時間各肝功能指標的比較用F檢驗及LSD兩兩檢驗，兩組之間肝癌發(fā)生率和病死率比較應用四格表χ2檢驗。結果治療4周后，移植組腹水消退15例(41.7%)，腹脹減輕21例(58.3%)，下肢水腫減輕13例(36.1%)，對照組分別為15例(31.3%)、20例(41.7%)和11例(22.9%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.341、12.689、9.837，P均<0.05)。移植組治療前及治療后4、12、24、48周，ALT、Alb、TBil、PT和MELD評分，差異有統(tǒng)計學意義(F=6.172、9.795、10.961、11.198、19.652，P均=0.000)；對照組治療前及治療后4、12、24、48周，ALT、Alb、TBil差異有統(tǒng)計學意義(F=5.594、13.664、12.612，P均=0.000)，而PT和MELD評分，差異無統(tǒng)計學意義(F=1.698、2.652，P均>0.05)。移植組與對照組相比，治療后第4周ALT、Alb、TBil、PT差異有統(tǒng)計學意義(t=3.394、11.625、8.847、15.781，P均<0.05)，MELD差異無統(tǒng)計學意義(t=1.727，P>0.05)；治療后第48周，ALT、Alb、TBil、PT、MELD差異有統(tǒng)計學意義(t=5.477、8.830、6.371、11.362、9.426，P均<0.05)。隨訪至第48周，移植組與對照組病死率及肝癌發(fā)生率均差異無統(tǒng)計學意義(χ2=4.815、6.286，P均>0.05)。全部患者在移植術中，移植術后近期未發(fā)生嚴重并發(fā)癥。結論經(jīng)肝固有動脈自體BMSC移植治療失代償期肝硬化是一種安全、有效的方法，可作為肝移植治療的過渡或補充治療。

【關鍵詞】肝硬化；骨髓間充質干細胞；移植，自體；肝動脈；治療

肝硬化是我國常見疾病和主要的死亡原因之一[1]。各種原因導致的肝硬化可進一步發(fā)展至肝功能衰竭。肝移植已被證實是各種原因造成的肝功能衰竭最有效的治療方法，但由于供肝源有限、移植后的免疫排斥反應以及高額的治療費用使得肝移植的廣泛應用受到限制[2]。干細胞具有自我更新和分化能力，在特定條件下，它可分化為不同的功能細胞，形成多種組織和器官[3]。近年來，越來越多的研究證實骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)在一定的微環(huán)境中，可向肝細胞或膽管細胞分化，有助于改善肝硬化患者的肝功能，從而進一步改善肝硬化患者的臨床癥狀[4]。本研究采用經(jīng)肝固有動脈行自體BMSC移植治療失代償期肝硬化，以評價其療效和安全性。

資料和方法

一、研究對象

2012年6至2013年6月在解放軍第五三三醫(yī)院肝病科住院的失代償期肝硬化患者84例，其中男51例，女33例，年齡40～68歲，平均年齡(56.5±4.6)歲。所有入選患者肝硬化診斷標準參照《中國肝病診療管理規(guī)范》白皮書[5]，其中乙型肝炎肝硬化37例，丙型肝炎肝硬化12例，酒精性肝硬化18例，混合性肝硬化(乙型肝炎/丙型肝炎+酒精性肝硬化)14例，血吸蟲性肝硬化3例。肝功能分級Child-Pugh B 級54例，Child-Pugh C 級30例。所有患者術前存在不同程度乏力、納差、腹脹、胸水、腹水、下肢水腫、脾大等癥狀和體征，均經(jīng)過影像學檢查(包括腹部B 超、CT或MRI)及各項檢驗，明確診斷為肝硬化。排除標準為有肝臟及其他臟器腫瘤、嚴重的心肺疾病、肝腎綜合征、肝性腦病、近1年接受過干擾素或糖皮質激素治療者。所有患者入院后均給予對癥、支持治療。所有措施都在患者知情同意下進行，并簽署相關知情同意書；該研究經(jīng)過解放軍第五三三醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

二、治療方法

(一)對照組對照組患者給予還原型谷胱甘肽、多烯磷脂酰膽堿、門冬氨酸鉀鎂和維生素C等加入液體中靜脈滴注，1次/d；同時限鈉、限水和利尿，未給予輸注白蛋白治療。

(二)移植組在對照組基礎治療的同時，給予經(jīng)肝固有動脈自體BMSC移植治療。進入手術室后，患者取平臥位，選取兩側髂后上棘部位為骨髓穿刺點，常規(guī)消毒后鋪巾，在穿刺點部位以2%利多卡因進行局部浸潤麻醉，直至骨膜處，然后使用18號骨髓穿刺針垂直穿刺，進入骨髓腔后予以固定，抽出骨髓。兩側穿刺點共抽取患者骨髓血200 mL，予以7500單位的肝素鈉進行抗凝，然后在實驗室利用密度離心方法進行骨髓干細胞的體外分離及純化，使用流式細胞儀檢測表面抗原標記為CD34-、CD45-且CD29+、CD44+、CD90+的濃縮的單核細胞，在移植組中采集的間充質干細胞均達到1.0×106/kg體質量，在4℃的保存條件下送至介入室。在數(shù)字減影血管造影機下，采用Seldinger技術，局麻下穿刺右側股動脈，置入5F動脈鞘，引入5F R-H肝動脈導管，置于肝固有動脈，造影了解血管分布，進一步確定無腫瘤樣異常血管團，然后將分離好的BMSC懸液緩慢注入肝內。術后拔出動脈鞘，加壓包扎穿刺部位，平臥24 h，常規(guī)對癥處理。

(三)療效觀察術后觀察指標包括患者臨床癥狀、體征、實驗室指標及影像學檢查。術后4、12、24和48周分別復查ALT、Alb、TBil、PT等指標，并進行MELD評分，術后12周復查肝臟超聲檢查或CT。根據(jù)臨床癥狀、體征和實驗室檢查結果，分為：有效(臨床癥狀有1項以上減輕，體征有1項以上改善，實驗室檢查指標2項以上好轉)，無效(臨床癥狀和體征沒有改善，實驗室檢查指標無好轉)。

三、統(tǒng)計學處理

結果

一、基線特征比較

對兩組肝硬化患者的年齡、性別、生化學指標及MELD評分方面進行比較，結果兩組患者基線特征基本一致，見表1。

二、癥狀和體征改善情況

治療4周后，移植組腹水消退15例(41.7%)，腹脹減輕21例(58.3%)，下肢水腫減輕13例(36.1%)，對照組分別為15例(31.3%)和20例(41.7%)，11例(22.9%)，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=8.341、12.689、9.837，P均<0.05)。

三、生化學指標及MELD評分

移植組治療前及治療后4、12、24、48周，ALT、Alb、TBil、PT和MELD評分，差異有統(tǒng)計學意義(F=6.172、9.795、10.961、11.198、19.652，P均=0.000)，見表2；對照組治療前及治療后4、12、24、48周，ALT、Alb、TBil差異有統(tǒng)計學意義(F=5.594、13.664、12.612，P均=0.000)，而PT和MELD差異無統(tǒng)計學意義(F=1.698、2.652，P均>0.05)，見表3。

移植組與對照組相比，治療后第4周ALT、Alb、TBil、PT差異有統(tǒng)計學意義(t=3.394、11.625、8.847、15.781，P均<0.05)，MELD差異無統(tǒng)計學意義(t=1.727，P>0.05)，見表4；治療后第48周，ALT、Alb、TBil、PT、MELD差異有統(tǒng)計學意義(t=5.477、8.830、6.371、11.362、9.426，P均<0.05)，見表5。

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注：與移植前比較，aP<0.05

注：與移植前比較，aP<0.05

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四、隨訪情況

至48周移植組共死亡6例，2例死于上消化道出血，2例死于肝功能衰竭，1例死于肝性腦病，1例死于肝癌；對照組共死亡10例，3例死于肝功能衰竭，3例死于上消化道出血，2例死于肝性腦病，1例死于繼發(fā)感染，1例死于肝癌。兩組病死率分別為16.7%和20.8%(χ2=4.815，P>0.05)。移植組1例(2.78%)和對照組1例(2.08%)發(fā)生肝細胞癌(χ2=6.286，P>0.05)。

五、不良反應

36例自體BMSC移植的肝硬化患者中，除1例患者出現(xiàn)低熱及輕微骨痛以外，余患者未發(fā)現(xiàn)其他明顯不良反應及并發(fā)癥。

討論

干細胞是人體內最原始的細胞，是一種具有多分化潛能和自我復制功能的未分化細胞，大量研究證明干細胞不僅可分化為中胚層細胞，還分化為內胚層及外胚層細胞，表明干細胞可以跨系、跨胚層分化，具有強大的可塑性[6]。同時，干細胞具有化學趨向性[7]。根據(jù)干細胞的這些特性，臨床可用于治療各種細胞或組織損傷性疾病，如肺纖維化[8]、糖尿病足[9]、潰瘍性結腸炎[10]等。目前，臨床上用于治療肝硬化的干細胞，主要包括外周血干細胞、自體骨髓干細胞和臍血干細胞[11]。

國外學者[12]報道，自體BMSC移植可促進受損肝臟的功能恢復和再生，能改善血清膽紅素、Alb、凝血國際標準化比值、生活質量、Child-Pugh評分及MELD評分，治療后未見不良反應。Piscaglia等[13]研究結果顯示G-CSF可促進BMSC遷移到肝臟，同時增強內源性肝細胞，即卵圓細胞修復肝臟。Han等[14]報道，PBSC移植治療失代償期肝硬化20例，可以改善肝臟的合成功能。上述研究均提示自體BMSC移植治療肝臟疾病有效。本研究結果與上述研究結果相似，治療組4周后，患者的ALT較治療前有明顯好轉，TBil從12周始較治療前有明顯好轉，肝臟的合成功能指標以及MELD評分從12 周始較治療前有明顯改善。對照組治療后4周，患者的ALT較治療前也有明顯好轉，TBil從12周始較治療前也有明顯好轉；但MELD評分未見有明顯變化。隨訪至48周，兩組病死率及肝癌發(fā)生率均差異無統(tǒng)計學意義，考慮BMSC移植不會增加肝細胞癌發(fā)生率，同時因BMSC移植不能從根本上糾正患者肝硬化病因，因而未能減少患者病死率，但考慮BMSC可能定向分化為肝樣細胞及自身的旁分泌等作用，有助于改善肝硬化患者的肝功能。

目前，進行BMSC移植治療肝病的途徑主要有經(jīng)肝動脈、門靜脈和外周靜脈等[15]。姚鵬等[16]采用經(jīng)肝動脈注入自體BMSC治療慢性肝衰竭患者，證實其在改善患者癥狀和降低病死率方面效果明顯。Pai等[17]將BMSC經(jīng)肝動脈輸入到酒精性肝硬化患者肝內，患者膽紅素水平明顯下降，Child-Pugh評分改善。其機制可能是肝動脈介入輸注細胞可使干細胞在肝臟局部產(chǎn)生高濃度的細胞群，有利于其在肝臟中定植并發(fā)揮作用。

本研究采用經(jīng)肝固有動脈移植自體BMSC治療36例失代償期肝硬化患者，發(fā)現(xiàn)干細胞治療前后患者癥狀改善明顯，治療組與對照組在治療后48周相比，血清肝功能及MELD評分改善方面有顯著性差異。國內外的基礎及臨床研究均表明，BMSC移植治療肝硬化主要有以下優(yōu)點[18]：①BMSC移植來源方便，不受供體缺乏的限制，還可免除免疫排斥反應的發(fā)生；②治療效果明顯，可顯著改善癥狀，在移植8～12周后干細胞開始分化，隨著新的肝細胞不斷增加，受損肝組織得到修復，肝功能逐漸恢復；③與活體肝移植相比費用低廉，且可以為肝臟移植贏得等待供體的時間；④技術風險小，手術本身過程并不復雜，加上采用的是介入微創(chuàng)手段，安全性較好，患者能夠耐受手術。

綜上所述，失代償期肝硬化患者在常規(guī)治療的前提下應用自體BMSC移植治療，雖不能給患者帶來治愈性的效果，但可以在很大程度上控制肝硬化的進展，提高肝硬化患者的生存質量，是在藥物及原位肝移植治療之外可供選擇的治療方案。

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(本文編輯：易玲)

Clinical study of autologous bone marrow mesenchymal stem cells transplantation through proper hepatic artery for decompensated cirrhosis patientsZHENGSheng1,YANGJuan1,LIUQiong2,LOUWei-xin2.1.DepartmentofLiverDiseases,YunnanThethirdPeople’sHospital,Kunming650011,China; 2.DepartmentofLiverDiseases,TheNo.533HospitalofPeople’sLiberationArmy,Kunming650000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the clinical therapeutic effect and safety of autologous bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) transplantation through proper hepatic artery in patients with decompensated liver cirrhosis. MethodsEighty-four patients with decompensated liver cirrhosis, which admitted in Department of Liver Diseases of the No.533 Hospital of People's Liberation Army from 2012 Jun to 2013 Jun, were randomly divided into transplantation group (n=36) and control group (n=48). Patients in control group received routine treatment, while patients in transplantation group received additional autologous BMSC transplantation through proper hepatic artery. Alanine aminotransferase (ALT), albumin (Alb), total bilirubin (TBil), prothrombin time (PT) and model for end stage liver disease (MELD) were evaluated in both groups during follow-up at week 4, 12, 24 and 48, respectively. Comparison of liver function at different time after therapy between two groups carried out by independent t test , F test and LSD test. Incidence of hepatocellular carcinoma (HCC) and mortality were analyzed by χ2 test. ResultsFour weeks after treatment, there were 15 cases (41.7%) ascites subsiding, 21 cases (58.3%) abdominal distention disappearing and 13 cases (36.1%) edema of lower limbs relieving in transplantation group, while there were 15 cases (31.3%), 20 cases (41.7%) and 11 case (22.9%) in control group, respectively, which revealed statistically significant differences (P<0.05). In transplantation group at week 4, 12, 24, 48, there were significant improvements in ALT, Alb, TBiL, PT and MELD (F=6.172, 9.795, 10.961, 11.198, 19.652, P=0.000, respectively) than those at baseline. In control group, some parameters, including ALT, Alb and TBiL, had significant improvement (F=5.594, 13.664, 12.612, P=0.000, respectively), while other parameters, including PT and MELD, did not changed before and after therapy. At week 48, ALT, Alb, TBiL, PT and MELD showed significant differences between transplantation and control groups (t=5.477, 8.830, 6.371, 11.362, 9.426, P<0.05, respectively). No significant differences were observed in incidence of HCC and mortality (χ2=4.815、6.286, P<0.05, respectively). Additionally, no severe adverse effects occured in patients during and after transplantation. ConclusionAutologous BMSC transplantation through proper hepatic artery for decompensated liver cirrhosis is a safe and effective therapy, which could be a bridging or a complementary treatment.

【Key words】Cirrhosis; Bone marrow mesenchymal stem cells; Transplantation, autologous; Hepatic artery; Treatment

(收稿日期：2015-08-03)

Corresponding author:ZHENG Sheng, Email: zheng_sheng523@163.com; YANG Juan, Email: 53573885@qq.com

通信作者：鄭盛，Email：zheng_sheng523@163.com； 楊涓，Email：53573885@qq.com

基金項目：云南省自然科學基金(2012FD095)；云南省教育廳科研基金重點項目(2014Z125)