益生菌對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠腸黏膜Toll樣受體表達(dá)的影響及其意義

劉　超　朱耀明

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院　宜昌市中心人民醫(yī)院胃腸外科,湖北　宜昌　443000)

?

益生菌對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠腸黏膜Toll樣受體表達(dá)的影響及其意義

劉超朱耀明

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院宜昌市中心人民醫(yī)院胃腸外科,湖北宜昌443000)

〔摘要〕目的探討益生菌對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠腸黏膜Toll樣受體(TLR)的影響及其臨床意義。方法40只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、益生菌組和美沙拉嗪組。對照組正常飼養(yǎng)，不予任何處理；模型組、益生菌組和美沙拉嗪組給予含5%葡聚糖硫酸鈉飲用水10 d建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，益生菌組和美沙拉嗪組于第11天分別給予酪酸梭菌活菌和美沙拉嗪灌胃治療14 d。14 d后處死所有大鼠，觀察疾病活動(dòng)指數(shù)，進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分，RT-PCR法檢測TLR2和TLR4的表達(dá)，免疫組化方法檢測轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB的活性。結(jié)果模型組的疾病活動(dòng)指數(shù)和組織學(xué)評(píng)分顯著高于對照組，益生菌組和美沙拉嗪組低于模型組(P<0.05)。模型組TLR2和TLR4的表達(dá)顯著高于對照組，益生菌組和美沙拉嗪組高于對照組且低于模型組(P<0.05)，而益生菌組和美沙拉嗪組間差異不顯著(P>0.05)。模型組NF-κB的活性顯著高于對照組，益生菌組和美沙拉嗪組高于對照組且低于模型組(P<0.05)，而益生菌組和美沙拉嗪組間差異不顯著(P>0.05)。結(jié)論潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠中TLR表達(dá)異常，NF-κB的活性增加，益生菌及美沙拉嗪制劑可降低潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠TLR表達(dá)和NF-κB的活性，是治療潰瘍性結(jié)腸炎的有效方法。

〔關(guān)鍵詞〕潰瘍性結(jié)腸炎；Toll樣受體；益生菌；酪酸梭菌活菌葡聚糖硫酸鈉片；葡聚糖硫酸鈉

目前，潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明〔1〕。Toll樣受體(TLR)是先天性免疫重要的跨膜受體和模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式，阻斷通路中各轉(zhuǎn)導(dǎo)節(jié)點(diǎn)，減弱潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)，有助于治療的評(píng)定治療作用〔2〕。益生菌是一類微生態(tài)制劑，研究表明益生菌對潰瘍性結(jié)腸炎具有緩解作用，但其作用機(jī)制尚不明確〔3〕。本研究旨在探究益生菌治療潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料40只SD大鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)：SCXK(京)DBQ800)，體重230～270 g，均為雄性。引物由上海生土生物土程有限公司設(shè)計(jì)，RT-PCR試劑盒購于Fermentas公司，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購于BD公司，Marker購于天根生化科技有限公司。葡聚糖硫酸鈉購于Sigma公司，酪酸梭菌活菌片(青島東海藥業(yè)有限公司)，美沙拉嗪膠囊(葵花藥業(yè)集團(tuán)佳木斯鹿靈制藥有限公司)，其他試劑為國產(chǎn)。

1.2動(dòng)物模型制備及處理40只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、益生菌組和美沙拉嗪組，每組10只。對照組正常飼養(yǎng)，不給予任何干預(yù)，其他三組大鼠在動(dòng)物房飼養(yǎng)1 w后，給予含5%葡聚糖硫酸鈉飲用水10 d建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，益生菌組和美沙拉嗪組于第11天分別給予酪酸梭菌活菌(700 mg·kg-1·d-1，1次/d)和美沙拉嗪(500 mg·kg-1·d-1，1次/d)灌胃給藥治療14 d，模型組等容量生理鹽水灌胃，稱取大鼠體重，觀察大便形態(tài)和便血情況。治療14 d后處死所有大鼠，切開結(jié)腸管，觀察黏膜損傷情況，分別取遠(yuǎn)中近段組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色觀察及檢測核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB活性，組織樣本保存在液氮罐中10 min,取出放于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3腸上皮細(xì)胞提取將腸道組織翻轉(zhuǎn)內(nèi)膜向外，用D-Hanks溶液沖洗以去除黏膜的糞便，將腸組織置于含5.0 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和0.145 mg/ml二硫蘇糖醇(DTT)的D-Hank溶液中37℃搖床 90 min，3 000 r/min離心10 min，沉淀為腸上皮細(xì)胞。

1.4檢測方法RT-PCR法：結(jié)腸組織按Trizol法提取RNA，在260/280 nm處檢測RNA的濃度，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體步驟參照RT試劑盒說明。PCR擴(kuò)增引物序列，TLR2 上游：ttgctcctgcgaactcctat，下游：gctttcttgggcttcctctt；TLR4 上游：gctttcacctctgccttcac，下游：cgaggcttttccatccaata；β-actin上游：accacagtccatgccatcac，下游：tccaccaccctgttgctgta。反應(yīng)條件：94℃ 40 s，59℃ 30 s，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，目標(biāo)mRNA的表達(dá)使用內(nèi)參β-actin進(jìn)行校正。免疫組織化學(xué)方法應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的三步法進(jìn)行檢測，一抗為NF-κB p65亞基的單克隆抗體，二抗為山羊抗鼠IgG抗體，NF-κB活化評(píng)分在400倍高倍顯微鏡進(jìn)行，每個(gè)視野中NF-κB陽性細(xì)胞百分比0%～1%為0分，2%～5%為1分，6%～10%為2分，11%～25%為3分〔4〕。

1.5疾病活動(dòng)指數(shù)和組織學(xué)評(píng)分疾病活動(dòng)指數(shù)，①體重下降：體重不變0分、下降1%～5%1分、下降5%～10%2分、下降10%～15%3分、下降>15%4分。②大便形態(tài)：0分為正常、2分為松散、3分為腹瀉。③便血：0分為正常、2分為隱性出血、4分為顯性出血。疾病活動(dòng)指數(shù)=(體重指數(shù)+大便形狀+出血情況)/3。

組織學(xué)評(píng)分：針對處理免疫組化結(jié)果評(píng)分方法，將各組切片內(nèi)陽性的細(xì)胞數(shù)量及其染色強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的數(shù)值，達(dá)到對組織染色半定量的目的，使用Σpi(i+1)表示，式中pi表示陽性細(xì)胞數(shù)量占切片中所有細(xì)胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù)；i代表著色強(qiáng)度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各模型組疾病活動(dòng)指數(shù)和組織學(xué)評(píng)分比較模型組、益生菌組、美沙拉嗪組給予含5%葡聚糖硫酸鈉飲用水7～8 d出現(xiàn)腹瀉、便血、進(jìn)食量明顯減少、體質(zhì)量下降等。益生菌組、美沙拉嗪組進(jìn)過灌胃治療后腹瀉、便血癥狀明顯好轉(zhuǎn)，模型組癥狀持續(xù)無減輕，體質(zhì)量下降，對照組則無上述典型癥狀出現(xiàn)，體質(zhì)量逐漸增加。模型組、益生菌組和美沙拉嗪組的疾病活動(dòng)指數(shù)(8.92±1.13，3.67±0.75，4.03±0.84)及組織學(xué)評(píng)分(12.13±0.94，5.53±0.68，5.82±0.79)顯著高于對照組(0.15±0.11，0.21±0.09)，其中益生菌組和美沙拉嗪組均低于模型組(P<0.05)，而益生菌組和美沙拉嗪組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2組織病理學(xué)變化對照組腸腺體排列整齊，腺體間有較多杯狀細(xì)胞，固有層少量淋巴細(xì)胞浸潤。模型組腸黏膜下炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)構(gòu)紊亂，隱窩膿腫形成，潰瘍邊緣腺體增生較重，杯狀細(xì)胞減少，下層出血水腫。益生菌組、美沙拉嗪組黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤減少，黏膜充血水腫明顯減輕。見圖1。

對照組

模型組

益生菌組

美沙拉嗪組

2.3腸上皮細(xì)胞TLR2和TLR4的表達(dá)模型組、益生菌組和美沙拉嗪組的TLR2(0.92±0.13，0.67±0.09，0.64±0.10)和TLR4(1.13±0.14，0.53±0.09，0.52±0.09)的表達(dá)水平均顯著高于對照組(0.25±0.08，0.31±0.08)，其中益生菌組和美沙拉嗪組均低于模型組(P<0.05)，而益生菌組和美沙拉嗪組間差異不顯著(P>0.05)。

2.4NF-κB免疫組織化學(xué)結(jié)果模型組、益生菌組和美沙拉嗪組的NF-κB的活性分別為(2.43±0.54)、(0.85±0.31)、(0.82±0.29)，均顯著高于對照組的(0.41±0.28)，其中益生菌組和美沙拉嗪組均低于模型組(P<0.05)，而益生菌組和美沙拉嗪組間差異不顯著(P>0.05)。

3討論

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病主要與遺傳易感性、腸道菌群紊亂、腸黏膜免疫異常、感染等因素有關(guān)〔5〕。隨著對腸道微生態(tài)學(xué)及免疫學(xué)的發(fā)展，證實(shí)腸道菌群的紊亂與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病存在一定的相關(guān)性。研究顯示〔6〕，與緩解期潰瘍性結(jié)腸炎患者相比，急性期腸道有益菌明顯減少，而中間菌及有害菌大量增多，腸道菌群紊亂，炎癥持續(xù)存在。益生菌具有抑制腸道有害菌生長、毒素釋放，增大腸道蠕動(dòng)頻率，促進(jìn)消化，改善腸道機(jī)能，且其通過刺激腸道內(nèi)的免疫功能，將過低或過高的免疫活性調(diào)節(jié)至正常狀態(tài)，有助于增強(qiáng)人體免疫力，對潰瘍性結(jié)腸炎具有緩解及改善預(yù)后的作用。

TLR是天然免疫系統(tǒng)識(shí)別微生物的蛋白，在防御機(jī)制中具有重要作用，表達(dá)于天然免疫細(xì)胞和特異性免疫細(xì)胞，TLR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)可導(dǎo)致固有免疫細(xì)胞活化，分泌促炎癥細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，同時(shí)可誘導(dǎo)并刺激分子表達(dá)，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答產(chǎn)生〔7〕。TLR能夠通過識(shí)別病原相關(guān)分子，最終激活NF-κB和絲裂原蛋白激酶，加重潰瘍性結(jié)腸炎炎癥發(fā)展〔8〕。本研究說明酪酸梭菌活菌和美沙拉嗪治療潰瘍性結(jié)腸炎療效顯著，可顯著緩解患者的腸道炎癥，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，恢復(fù)便狀。分析原因：酪酸梭菌活菌能耐受胃酸進(jìn)入腸道，分泌腸黏膜再生和修復(fù)所需的重要營養(yǎng)物質(zhì)酪酸(丁酸)，并能促進(jìn)有益菌生長，抑制腸道有害菌生長，恢復(fù)腸道菌群平衡〔9〕；抑制抗結(jié)腸抗體IgG的過度表達(dá)，降低B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，提高T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，糾正腸免疫紊亂，恢復(fù)腸免疫耐受力。美沙拉嗪是治療潰瘍性結(jié)腸炎的活性成分，對腸壁的炎癥也有顯著的抑制作用〔10〕。

本研究進(jìn)一步提示潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與發(fā)展可能與TLR、NF-κB的表達(dá)有關(guān)，而酪酸梭菌活菌和美沙拉嗪可通過調(diào)節(jié)TLR、NF-κB的表達(dá)水平來改善患者癥狀。本研究說明益生菌和美沙拉嗪治療潰瘍性結(jié)腸炎效果相當(dāng)。

4參考文獻(xiàn)

1Siqqers RH,Hzckam DJ.The role of innate immune-stimulated epithelial apoptosis during gastrointestinal inflammatory diseases〔J〕.Cell Mol Life Sci,2011;68(22):3623-34.

2Pedersen G.Development,validation and implementation of an in vitro model for the study of metabolic and immune function in normal and inflamed human colonic epithelium〔J〕.Dan Med J,2015;62(1):B4973.

3李雅琳,鄭海倫,王啟之,等.Toll樣受體4、核因子-κb通路在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的應(yīng)用〔J〕.蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013;38(1):16-9.

4Bantel H,Berg C,Vieth M,etal.Mesalazine inhibits activation of transcription factor NF-κB in inflamed mucosa of patients with ulcerative colitis〔J〕.Am J Gastroenterol,2000;95(12):3452-7.

5高海瑞,趙剛,遲玉花,等.甘露聚糖肽對潰瘍性結(jié)腸炎病人TLR-2和TLR-4表達(dá)影響〔J〕.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015;51(3):290-2.

6魏妮,郭長存,沙素梅,等.利用表達(dá)譜基因芯片篩選潰瘍性結(jié)腸炎差異表達(dá)基因〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015;15(1):53-7.

7何斌,邱洪清,程志健,等.潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血單核細(xì)胞中Toll樣受體4,NF-κB的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.臨床消化病雜志,2013;25(2):76-8.

8劉勝楠,盧雪峰,孫娜,等.Toll樣受體2,4及核因子-κB在潰瘍性結(jié)腸炎黏膜組織中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.山東大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2012;50(2):60-3.

9Mann ER,Bernardo D,Ng SC,etal.Human gut dendritic cells drive aberrant gut-specific t-cell responses in ulcerative colitis,characterized by increased IL-4 production and loss of IL-22 and IFN〔J〕.Inflamm Bowel Dis,2014;20(12):2299-307.

10譚芳,高鴻亮,楊濤,等.益生菌對急性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜Toll樣受體表達(dá)的影響〔J〕.中國微生態(tài)學(xué)雜志,2015;27(7):749-52.

〔2015-07-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號(hào)〕R574.62

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)06-1304-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.011

通訊作者：朱耀明(1952-)，男，主任醫(yī)師，主要從事胃腸外科方面的研究。

第一作者：劉超(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胃腸外科方面的研究。