六味地黃丸治療SD大鼠酒精性絕經(jīng)綜合征的作用研究

魏立雯， 趙海， 趙明德， 魏微， 劉青青， 韓建紅， 付陸*

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，四川瀘州646000； 2. 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，貴陽(yáng)550025)

六味地黃丸治療SD大鼠酒精性絕經(jīng)綜合征的作用研究

魏立雯1， 趙海2， 趙明德1， 魏微1， 劉青青1， 韓建紅1， 付陸1*

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，四川瀘州646000； 2. 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，貴陽(yáng)550025)

為了研究六味地黃丸在治療酒精性絕經(jīng)綜合征SD大鼠中的作用，構(gòu)建酒精性絕經(jīng)綜合征大鼠模型，然后觀察六味地黃丸對(duì)大鼠精神狀態(tài)、飲食、體質(zhì)量等的影響。HE染色顯微鏡下觀察卵巢形態(tài)學(xué)的變化，測(cè)定血清雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)的含量，檢測(cè)白介素-6(IL-6)在卵巢和子宮中的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：六味地黃丸促進(jìn)了卵巢各級(jí)卵泡發(fā)育及生長(zhǎng)，減輕了卵巢炎癥、囊腫、萎縮狀態(tài)；提高了試驗(yàn)組E2水平，降低了試驗(yàn)組FSH、LH的水平(P<0.01)，而IL-6基因在卵巢和子宮中的mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。本研究證實(shí)六味地黃丸可以明顯改善酒精性絕經(jīng)綜合征SD大鼠的激素分泌水平，可以考慮運(yùn)用于人類(lèi)臨床上絕經(jīng)綜合征的治療，并且細(xì)胞因子IL-6可以為絕經(jīng)綜合征和自身免疫性卵巢早衰的診斷與治療，提供另一個(gè)可靠的臨床參照。

六味地黃丸；絕經(jīng)綜合征；白介素-6；動(dòng)物模型

絕經(jīng)綜合征(menopausal syndrome)是指婦女絕經(jīng)(一般在45～55歲)前后，由于卵巢功能衰退，出現(xiàn)性激素波動(dòng)或減少所致的一系列軀體及精神心理癥狀，會(huì)給患者帶來(lái)極大的痛苦(Campbell & Whitehead，1977)。目前，西醫(yī)習(xí)慣用激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)來(lái)治療和緩解本病癥狀，雖有一定的療效，但副反應(yīng)較多，長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)有致癌風(fēng)險(xiǎn)(Nelsonetal.，2002)。而我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)辨證應(yīng)用中草藥可以從益氣養(yǎng)血、滋腎養(yǎng)肝、補(bǔ)腎滋陰、解郁安神、健脾清心等方面對(duì)絕經(jīng)綜合征進(jìn)行治療(李淑芳，2014；桑海莉，桑雨廷，2014)，在改善卵巢、子宮功能方面具有療效顯著、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)隨著臨床應(yīng)用和藥理研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)六味地黃丸有不少新用途。六味地黃丸是滋補(bǔ)腎陰的代表方劑，在治療結(jié)核、圍更年期失眠、腎病、腎陰虛型經(jīng)間期出血等疾病具有明顯療效(李保院等，2014；李紅，2014)。然而，將六味地黃丸運(yùn)用于治療絕經(jīng)綜合征的報(bào)道很少，其對(duì)機(jī)體調(diào)節(jié)作用的具體分子機(jī)制更有待深入探討(吳煒景等，2011；李沫函等，2013；王萍，王喜軍，2013；翁小微，周惠芳，2015)。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)自身免疫性卵巢早衰的發(fā)生發(fā)展均與白介素-6(IL-6)濃度變化相關(guān)(莊粵冰，2015)，表明其在絕經(jīng)綜合征的診治過(guò)程中具有臨床意義。本研究擬用酒精性絕經(jīng)綜合征SD大鼠，探討六味地黃丸對(duì)大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)差異，性激素分泌水平以及IL-6基因mRNA表達(dá)水平的影響，為六味地黃丸在絕經(jīng)綜合征防治中的新功用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 健康SPF級(jí)雌性SD大鼠80只，6～8周齡，體質(zhì)量200 g±10 g，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2013-17，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2013-065。六味地黃丸(太極集團(tuán)重慶中藥二廠有限公司，批號(hào)1507126)，戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號(hào)167A)，注射用青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥總廠，批號(hào)CC1409027-1)，無(wú)水乙醇(AR)(市售)，雌二醇(E2)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Sigma公司。熒光定量試劑盒iQTMSYBR Green Supermix購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)(Bio-Rad)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.1.2 主要儀器 酶標(biāo)儀(Multiskan FC，美國(guó)Thermo公司)，CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，F(xiàn)A2104A電子天平(上海精天電子儀器公司)，YJ-1450超凈工作臺(tái)(蘇州華新空調(diào)凈化有限公司)，低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，低溫冰箱(日本SANYO公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組及模型構(gòu)建 80只健康SPF級(jí)雌性SD大鼠，正常飼養(yǎng)1周，稱(chēng)重，尾靜脈取血檢測(cè)雌激素水平，選取處于動(dòng)情期的60只SD大鼠，將其隨機(jī)分為5組(每組12只)：正常對(duì)照組(HC)、模型對(duì)照組(MⅠ)、陽(yáng)性藥戊酸雌二醇對(duì)照組(MⅡ)、六味地黃丸低劑量組(MⅢ)和六味地黃丸高劑量組(MⅣ)。HC正常飼養(yǎng)，不做任何處理。絕經(jīng)綜合征模型的構(gòu)建主要根據(jù)盧金福等(2006)的方法，具體操作步驟如下：將SD大鼠稱(chēng)重，以1%的戊巴比妥鈉每200 g體質(zhì)量1 mL腹腔注射麻醉；大鼠取側(cè)臥位，在最末肋骨下，脊柱外側(cè)1.5～2 cm處剪除被毛，常規(guī)用75%乙醇消毒皮膚，切開(kāi)皮膚和背肌約2 cm；用小的鈍頭鑷子將切口視野中白色發(fā)亮的脂肪團(tuán)拉出，找到卵巢，將0.2 mL無(wú)水乙醇注射到卵巢內(nèi)，隨即將卵巢送回大鼠腹腔內(nèi)；以同樣方法處理對(duì)側(cè)卵巢；先縫合肌肉層，再縫合皮膚，皮膚消毒，連續(xù)5 d腹腔注射青霉素鈉1 mL(20萬(wàn)單位)。

1.2.2 藥物處理及采樣 5組SD大鼠飼喂于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF屏障系統(tǒng)中，溫度20 ℃～24 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，系統(tǒng)控制光照時(shí)間為08∶00—20∶00，自由飲食。手術(shù)造模5 d后，分別對(duì)各組SD大鼠進(jìn)行不同藥物的灌胃處理。HC正常飼養(yǎng)、不做灌胃處理。MⅠ給予生理鹽水，MⅡ、MⅢ和MⅣ分別給予0.09 mg·kg-1戊酸雌二醇、1 g·kg-1和10 g·kg-1的六味地黃丸灌胃處理。以上均為固定時(shí)間處理，每日1次，觀察各組的精神狀態(tài)及飲食狀況，并每周稱(chēng)取體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整藥量，持續(xù)4周。采樣前稱(chēng)重每只大鼠，尾靜脈采血并處死，離心取血清，采集雙側(cè)卵巢和子宮，生理鹽水沖洗，分別稱(chēng)重卵巢、子宮，按照卵巢指數(shù)=卵巢質(zhì)量/體質(zhì)量，子宮指數(shù)=子宮質(zhì)量/體質(zhì)量來(lái)計(jì)算。一側(cè)卵巢、子宮固定在4%多聚甲醛中，另一側(cè)卵巢、子宮迅速放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ELISA法檢測(cè)血清中激素水平 在酶標(biāo)儀上，按照ELISA試劑盒的說(shuō)明檢測(cè)血清中E2、FSH、LH的含量。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-6基因的mRNA表達(dá)水平 本試驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)IL-6基因在大鼠子宮和卵巢組織中mRNA的表達(dá)量。采用2-△△CT法(Vandesompeleetal.，2002)，以GAPDH作為內(nèi)參基因，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上完成。根據(jù)NCBI提供的IL-6基因和GAPDH基因的參考序列，設(shè)計(jì)熒光定量引物，由北京六合華大基因有限公司合成，其引物序列信息如下，GAPDH：F：5’-AGGGCATCTTGGGCTACAC-3’，R：5’-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3’(產(chǎn)物211 bp，退火溫度58 ℃)，IL-6：F：5’-GCACTGGCGGAAGTCAATCT-3’，R：5’-TTCTCAGCAGGCAGGTCTCAT-3’(產(chǎn)物94 bp，退火溫度60 ℃)。按照試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)加樣，使用標(biāo)準(zhǔn)品作為板間對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照，每個(gè)待測(cè)樣3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)以Mean±SE表示，運(yùn)用SPSS 17.0分析處理，組間的差異比較采用單因素方差分析。P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵巢組織形態(tài)學(xué)差異

大鼠解剖后，通過(guò)對(duì)卵巢的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與HC比較，MⅠ的卵巢組織發(fā)生了明顯萎縮(9/12)或者病變?yōu)殡p側(cè)囊性囊腫(3/12)，而MⅡ、MⅢ、MⅣ中的卵巢組織只發(fā)生了輕微的萎縮，病變?yōu)槟夷[的個(gè)體僅有1個(gè)(1/36)。如圖1所示，通過(guò)HE切片觀察，

HC各級(jí)卵泡正常生長(zhǎng)，形態(tài)規(guī)則，排列緊密。卵母細(xì)胞形態(tài)完整，呈球形，細(xì)胞核圓潤(rùn)規(guī)則，透明帶清晰可見(jiàn)。與HC比，MⅠ中閉鎖卵泡明顯增多，生長(zhǎng)卵泡和成熟卵泡明顯減少，而MⅡ、MⅢ、MⅣ中各級(jí)卵泡生長(zhǎng)狀況有很大程度改善，成熟卵泡增加，MⅡ和MⅣ中的卵巢組織形態(tài)接近HC，其中MⅣ中的效果更好，說(shuō)明戊酸雌二醇和六味地黃丸對(duì)酒精性絕經(jīng)綜合征的治療有一定的作用。

圖1 各組SD大鼠卵巢組織HE染色結(jié)果(×100)Fig. 1 HE staining of the ovarian from different groups of SD rats (×100)

2.2 子宮和卵巢指數(shù)

如圖2所示，各組SD大鼠的子宮指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。與HC比較，MⅠ的卵巢指數(shù)明顯下降(P<0.01)。經(jīng)戊酸雌二醇和不同濃度六味地黃丸灌胃治療后，與MⅠ比較，MⅡ和MⅣ中的卵巢指數(shù)明顯提高(P<0.01)，而MⅢ的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。

2.3 E2，LH和FSH血清水平的變化

如圖3所示，與HC比較，M Ⅰ的E2水平明顯下降(P<0.01)，表現(xiàn)為卵巢對(duì)E2的分泌功能下降，說(shuō)明造模成功。經(jīng)過(guò)戊酸雌二醇和不同濃度六味地黃丸灌胃治療后，與M Ⅰ比較，M Ⅱ、M Ⅲ和M Ⅳ中的E2水平明顯提高(P<0.01)，接近HC的水平(P>0.01)。與HC比較，MⅠ的LH和FSH水平明顯升高(P<0.01)。經(jīng)過(guò)藥物灌胃治療后，與MⅠ比較，MⅡ、MⅢ和MⅣ中的LH和FSH水平均顯著降低(P<0.01)，接近HC的水平(P>0.01)。

2.4IL-6基因在卵巢和子宮中mRNA的差異表達(dá)

如圖4所示，子宮中IL-6基因的mRNA表達(dá)差異在HC和MⅠ間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與HC相比，MⅠ卵巢中IL-6基因的mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與MⅠ相比，MⅡ、MⅢ和MⅣ中IL-6基因的mRNA表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而MⅡ、MⅢ和MⅣ間IL-6基因的mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。

圖2 各組SD大鼠的子宮和卵巢指數(shù)Fig. 2 The index of uterine and ovarian of SD rats in different groups

UI. 子宮指數(shù)， OI. 卵巢指數(shù); 與HC比較，#P<0.01， 與MⅠ比較，*P<0.01; 下同。

UI. uterus index， OI. ovary index; compared with HC，#P<0.01， compared with MⅠ，*P<0.01; the same below.

圖3 各組SD大鼠血清中E2，LH和FSH的含量Fig. 3 The levels of E2， LH and FSH in serum of SD rats in different groups

圖4 IL-6基因在各組SD大鼠子宮和卵巢組織中mRNA的表達(dá)Fig. 4 The mRNA expression levels of IL-6 gene in uterus and ovary of SD rats in different groups

3 討論

絕經(jīng)綜合征可導(dǎo)致性激素波動(dòng)或減少，給患者的身心健康帶來(lái)極大痛苦。自身免疫性卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是原發(fā)或繼發(fā)性閉經(jīng)，且血促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，伴有一系列不同程度的低雌激素癥。絕經(jīng)綜合征和POF在臨床表現(xiàn)水平上極為相似(Scheidt-Naveetal.，2001)。目前，應(yīng)用較多的HRT因?yàn)橛嘘幍莱鲅?、乳房脹痛等副反?yīng)，還可能增加患者子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)(Collaborators，2003；湯海霞，2014)，探尋HRT以外的更為安全有效的治療方法是大勢(shì)所趨。因此，臨床上廣大絕經(jīng)綜合征患者傾向于使用中草藥治療，而大多實(shí)踐表明補(bǔ)腎中藥和中醫(yī)情志治療婦女絕經(jīng)綜合征具有較好的療效，可以緩解或減輕各種癥狀，使其內(nèi)分泌功能達(dá)到新的平衡(王小云等，2006)。同時(shí)，有研究表明中醫(yī)藥及植物雌激素可用于改善主觀癥狀，二仙湯及大豆黃酮對(duì)酒精性絕經(jīng)綜合征SD大鼠的卵巢和內(nèi)分泌具有一定影響(林靜，劉英杰，2014；夏斌等，2015)。

目前，用于絕經(jīng)綜合征的動(dòng)物模型較少，主要有自然衰老模型、卵巢摘除模型、X射線照射破壞卵巢模型、卵巢摘除配合中藥造模等。這些造模方法各自都存在利弊，均不能夠準(zhǔn)確、全面地反映絕經(jīng)綜合征的臨床癥狀。盧金福等(2006)研究發(fā)現(xiàn)酒精性絕經(jīng)綜合征模型大鼠可以作為一個(gè)較為理想的模型，因?yàn)閯?dòng)物殘存有少量的正常卵巢組織，與卵巢摘除等造模方法相比，更接近臨床。本研究用健康雌性SD大鼠，復(fù)刻了酒精性絕經(jīng)綜合征模型，通過(guò)臨床和組織切片觀察可以確定造模成功，后采用六味地黃丸對(duì)絕經(jīng)綜合征模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，以臨床常用HRT治療作為對(duì)照。結(jié)果顯示，MⅣ血清中E2水平明顯高于MⅠ(P<0.01)，血清中LH、FSH水平明顯低于MⅠ(P<0.01)，提示六味地黃丸具有類(lèi)似雌激素的作用，可以用于臨床上絕經(jīng)綜合征和POF的治療。

目前認(rèn)為，細(xì)胞因子可參與卵巢多方面功能的調(diào)節(jié)，卵巢抗原可以激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生抗卵巢抗體，促進(jìn)免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的改變(Hoeketal.，1997)。研究人員發(fā)現(xiàn)POF患者血液中白細(xì)胞介素水平與臨床癥狀存在顯著相關(guān)性(Scheidt-Naveetal.，2001；Ottetal.，2014)，但沒(méi)有檢測(cè)其組織表達(dá)差異。本研究通過(guò)qPCR在子宮和卵巢組織中檢測(cè)IL-6基因在不同實(shí)驗(yàn)組的mRNA差異表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與HC相比，IL-6基因在子宮、卵巢的表達(dá)量與MⅠ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；MⅡ、MⅢ和MⅣ間IL-6基因的mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。以上結(jié)果表明，在卵巢和子宮組織中IL-6表達(dá)水平與其在血液中的水平有相同趨勢(shì)，進(jìn)一步揭示IL-6在POF的診治過(guò)程中有重要的臨床意義。

4 結(jié)論

六味地黃丸可以明顯改善酒精性絕經(jīng)綜合征SD大鼠的激素分泌水平，可以考慮運(yùn)用于人類(lèi)臨床上絕經(jīng)綜合征的治療，且細(xì)胞因子IL-6可為絕經(jīng)綜合征和自身免疫性卵巢早衰的診斷與治療提供另一個(gè)可靠的臨床參照。

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Investigation of Liuwei Dihuang Wan on the Treatment of Alcoholic Menopausal Syndrome in SD Rats

WEI Liwen1， ZHAO Hai2， ZHAO Mingde1， WEI Wei1， LIU Qingqing1， HAN Jianhong1， FU Lu1*

(1. Department of Laboratory Animal， Southwest Medical University， Luzhou， Sichuan Province 646000， China;2. Institute of Medical Laboratory Animals， Guiyang College of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China)

To study the effect of Liuwei Dihuang Wan on the diagnosis and treatment of alcoholic menopausal syndrome (MS) in SD rats. The MS rat model was first induced by ethanol， and then the effect of Liuwei Dihuang Wan on the mental state， diet， and body weight of rats was detected. The ovarian histomorphology was tested with HE staining and checked using microscope. The levels of estradiol (E2)， follicle stimulating hormone (FSH)， and luteinizing hormone (LH) in serum were detected. The mRNA expression levels of interleukin-6 (IL-6) in the ovary and uterus were also monitored by qPCR. The results showed that Liuwei Dihuang Wan could improve the growth and development of ovarian follicles， and increase the level of E2 but significantly decrease the level of FSH and LH in serum (P<0.01). Furthermore， the mRNA expression levels ofIL-6 gene in the ovary and uterus were significantly different (P<0.01). In conclusion， Liuwei Dihuang Wan can be used for the therapy of alcoholic MS. Meanwhile， IL-6 may be a potential target for the diagnosis and treatment of autoimmune premature ovarian and MS.

Liuwei Dihuang Wan; menopausal syndrome; IL-6; animal model

2016-05-17 接受日期：2016-06-08 基金項(xiàng)目:四川省瀘州市瀘州醫(yī)學(xué)院院級(jí)基金項(xiàng)目(瀘醫(yī)院科[2015]1號(hào))

魏立雯(1987—)， 女， 碩士， 主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究， E-mail：weilwen55@swmu.edu.cn

*通信作者Corresponding author， 男， 博士， 主要從事分子生物學(xué)研究， E-mail：flfyh@swmu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20160129

Q95-33

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1000-7083(2016)04-0579-05