白樺脂酸對(duì)免疫性肝損傷小鼠細(xì)胞因子及Bcl-2、activated-Caspase-3表達(dá)的影響

汪佰莉， 吳煥童， 曹暢， 張淑萍， 覃筱燕

(1. 中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京100081； 2. 中央民族大學(xué)北京市食品環(huán)境與健康工程技術(shù)研究中心，北京100081； 3. 中央民族大學(xué)醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100081)

白樺脂酸對(duì)免疫性肝損傷小鼠細(xì)胞因子及Bcl-2、activated-Caspase-3表達(dá)的影響

汪佰莉1， 3#， 吳煥童1， 2#， 曹暢1， 2#， 張淑萍1， 2*， 覃筱燕1， 2*

(1. 中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京100081； 2. 中央民族大學(xué)北京市食品環(huán)境與健康工程技術(shù)研究中心，北京100081； 3. 中央民族大學(xué)醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100081)

目的 研究白樺脂酸(BA)對(duì)刀豆蛋白(Con A)誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷小鼠細(xì)胞因子及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、activated-Caspase-3表達(dá)量的影響。方法 將60只雄性KM小鼠隨機(jī)分為6組，包括正常對(duì)照組，肝損傷模型組，聯(lián)苯雙酯(BIF)陽(yáng)性對(duì)照組，BA高、中、低劑量組(H-BA、M-BA、L-BA組劑量分別為30 mg·kg-1、15 mg·kg-1、7.5 mg·kg-1)。BIF陽(yáng)性對(duì)照組和BA高、中、低劑量組預(yù)防性給藥15 d后，尾靜脈注射20 mg·kg-1Con A構(gòu)建小鼠急性免疫性肝損傷模型。采用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清肝功能指標(biāo)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量；ELISA法測(cè)定血清炎性細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平；Western blot法檢測(cè)肝組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、activated-Caspase-3表達(dá)量的變化。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，肝損傷模型組血清ALT和AST含量明顯降低，IL-2、IL-4、IL-10和腫瘤壞死因子(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)水平明顯升高，Bcl-2表達(dá)量下降而activated-Caspase-3表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與肝損傷模型組比較，BA不同劑量組可顯著降低Con A所致急性肝損傷小鼠血清ALT和AST含量，使小鼠血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ水平顯著降低，而IL-10水平顯著升高，尤其是H-BA組、M-BA組，同時(shí)使Bcl-2表達(dá)量升高、activated-Caspase-3表達(dá)量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 BA對(duì)由Con A誘導(dǎo)的小鼠急性免疫性肝損傷具有拮抗作用。其機(jī)制可能與抗凋亡及降低炎性細(xì)胞因子水平和提高抗炎細(xì)胞因子水平、減輕T淋巴細(xì)胞毒性作用有關(guān)。

白樺脂酸；刀豆蛋白；急性免疫性肝損傷；細(xì)胞因子；Bcl-2；activated-Caspase-3

刀豆蛋白(concanavalin A，Con A)誘導(dǎo)的小鼠急性免疫性肝損傷是近年來(lái)新建立的且為通過(guò)T細(xì)胞毒性介導(dǎo)的肝損傷動(dòng)物模型(Qinetal.，2010；Zhouetal.，2013；楊逸等，2015；鄭晨宏，謝曉華，2016)。該模型適合用于人類(lèi)病毒性肝炎、自身免疫性肝病等的病理機(jī)制和進(jìn)行抗肝損傷的藥物篩選(Wahletal.，2009；Wangetal.，2012)。Con A與肝細(xì)胞漿膜有極強(qiáng)的親和性，注入體內(nèi)后大量聚集于肝臟，誘導(dǎo)大量免疫細(xì)胞向肝組織聚集并激活，通過(guò)其釋放多種炎性細(xì)胞因子引起炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)肝損傷過(guò)程，并進(jìn)一步激活腫瘤壞死因子(TNF-a)，繼而通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制損害肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(Qinetal.，2010；Zhouetal.，2013；鄭晨宏，謝曉華，2016)。

近年來(lái)，已有不少關(guān)于植物活性成分防治肝損傷的研究開(kāi)展，并取得了很好的研究進(jìn)展。白樺脂酸(betulinic acid，BA)屬羽扇烷型三萜類(lèi)化合物，在自然界中廣泛存在，眾多文獻(xiàn)闡述了BA在不同屬植物中的存在，但最豐富的自然資源是白樺樹(shù)，干燥的白樺樹(shù)外皮中含有約30%的白樺三萜類(lèi)化合物(Schühlyetal.，1999)。BA具有廣泛的生物學(xué)及藥理學(xué)活性，如抗氧化、抗炎性和抗腫瘤活性(Cichewicz & Kouzi,2004；張琛琛等，2014；孫嘉等，2015)。本實(shí)驗(yàn)研究采用Con A建立急性免疫性肝損傷動(dòng)物模型，在前期的研究基礎(chǔ)(Qinetal.，2010；楊逸等，2015)上探討B(tài)A在急性免疫性肝損傷中的作用及對(duì)細(xì)胞因子和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、activated-Caspase-3表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只雄性健康KM小鼠，體質(zhì)量18～22 g，清潔級(jí)，由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所繁育場(chǎng)提供，合格證號(hào)：SCXK-(軍)2007-004。于清潔級(jí)動(dòng)物室飼養(yǎng)，自由飲食，室內(nèi)溫度20 ℃～25 ℃，相對(duì)濕度60%～80%，保持通風(fēng)，定時(shí)換氣，每日光照/黑暗更替周期為12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

BA購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，貨號(hào)：120327，純度>98%。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，貨號(hào)：C010-1、C009-1；聯(lián)苯雙酯(bifendate，BIF)為北京協(xié)和藥廠產(chǎn)品，批號(hào)：11090201；Con A為Sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)：C2272；腫瘤壞死因子(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)、IL-2、IL-4、IL-10試劑盒(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)：DKW12-2720、DKW12-2000、DKW12-2020、DKW12-2027、DKW12-2055)。activated-Caspase-3抗體(rabbit，產(chǎn)品編號(hào)：C2312)、Bcl-2(N-19)抗體(rabbit，產(chǎn)品編號(hào)：L1311)，均為Santa Cruz Biotechnology產(chǎn)品；Actin抗體(mouse，貨號(hào)：A5316)，為Sigma產(chǎn)品；goat-anti-mouse IgG(產(chǎn)品編號(hào)：MD161)、goat-anti-rabbit IgG(產(chǎn)品編號(hào)：MD162)、goat-anti-rabbit IgG-HRP(產(chǎn)品編號(hào)：H1211)，均為Santa Cruz Biotechnology產(chǎn)品；組織裂解液、Tween-20等為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。無(wú)水乙醇：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，貨號(hào)：20120728；冰醋酸：分析純，北京化學(xué)試劑公司，貨號(hào)：10000292。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

7020型全自動(dòng)生化分析儀(日本HITACHI公司)；冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)；sunrise酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；恒溫水浴鍋(北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表廠)；DYY-TC型電泳儀(北京六一廠)；化學(xué)發(fā)光成像儀Tanon 4200(上海天能公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及處理

60只KM小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只：正常對(duì)照組、肝損傷模型組、BIF陽(yáng)性對(duì)照組(150 mg·kg-1)、BA高、中、低劑量組(H-BA、M-BA、L-BA組劑量分別為30 mg·kg-1、15 mg·kg-1、7.5 mg·kg-1)。正常對(duì)照組和肝損傷模型組給予藥品溶劑(0.1 mL·10 g-1)，每日1次。BIF陽(yáng)性對(duì)照組給予BIF(0.15 mL·10 g-1)，每日1次。BA高、中、低劑量組分別給予相應(yīng)劑量的藥物(0.1 mL·10 g-1)。15 d后，除正常對(duì)照組外，其余各組均尾靜脈注射20 mg·kg-1Con A，建立肝損傷模型，禁食不禁水12 h后，對(duì)全部小鼠進(jìn)行摘眼球取全血處理，所取血液經(jīng)3 000 r·min-1離心10 min后，取血清用于實(shí)驗(yàn)。外周血采集完畢后，暴露肝臟，快速取肝組織，分別保存于3 mL EP管中，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)洗滌，盡量將血細(xì)胞去除，-20 ℃暫存。實(shí)驗(yàn)時(shí)取適當(dāng)大小肝組織于1.5 mL EP管中，用電動(dòng)組織研磨器在冰上用細(xì)胞裂解液(1∶9)分別將小鼠肝組織研磨，冰上裂解30 min后4 ℃，13 000 r·min-1離心25 min，取上清即為所需蛋白，可暫存于-20 ℃，用于Western blot實(shí)驗(yàn)。

2.2 小鼠血清ALT、AST活性檢測(cè)

血清ALT、AST檢測(cè)采用國(guó)際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟(IFCC)推薦法，按照試劑盒說(shuō)明操作，使用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)505 nm處測(cè)定吸光度(A)值，根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出ALT及AST的含量。

2.3 小鼠血清TNF-α、IFN-γ含量測(cè)定

采用ELISA方法，測(cè)定時(shí)向TNF-α、IFN-γ單抗包被的96孔板中每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液或待檢樣本100 μL，并設(shè)空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)曲線孔。各試劑稀釋濃度和步驟按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定相應(yīng)吸光度(A)值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算成TNF-α、IFN-γ含量。

2.4 Western blot法檢測(cè)肝組織Bcl-2、activated-Caspase-3表達(dá)量變化

Western blot法如前期工作文獻(xiàn)描述(Yangetal.，2014)。用BCA法測(cè)定蛋白濃度，對(duì)提取的肝組織總蛋白進(jìn)行蛋白定量。將每個(gè)樣品的蛋白濃度調(diào)成一致，用10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)，5%的脫脂奶粉封閉30 min，一抗(1∶1 000)孵育過(guò)夜(4 ℃)，TBST洗3～5次，室溫下二抗(1∶1 000)孵育1 h，TBST洗3～5次，加化學(xué)發(fā)光液(A液與B液等體積混合)在化學(xué)發(fā)光成像儀Tanon 4200下檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量，拍照。結(jié)果以實(shí)驗(yàn)組目的蛋白灰度值與對(duì)照組β-Actin灰度值的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 BA對(duì)Con A所致免疫性肝損傷小鼠ALT、AST的影響

肝損傷模型組小鼠血清中ALT、AST活性較正常對(duì)照組明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明造模成功。給予藥物防治后，與肝損傷模型組比較，2種轉(zhuǎn)氨酶均有不同程度的降低，H-BA組、M-BA組和BIF陽(yáng)性對(duì)照組的ALT、AST降低最為明顯(P<0.01)；L-BA組ALT、AST降低的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示BA能顯著降低Con A所致肝損傷小鼠ALT和AST活性(表1)。

表1 白樺脂酸對(duì)刀豆蛋白所致急性免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響(n=10)Table 1 The impacts of betulinic acid on ALT and AST of concanavalin A-induced acute immune liver injury mice (n=10)

注： 與對(duì)照組相比，▲▲P<0.01； 與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01； 下表同。

Notes： compared with the normal group，▲▲P<0.01； compared with the model group，*P<0.05，**P<0.01； the same below.

3.2 BA對(duì)免疫性肝損傷小鼠IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ的影響

肝損傷模型組小鼠血清中IL-2、IFN-r、IL-4、TNF-α、IL-10含量較正常對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與肝損傷模型組比較，H-BA組和BIF陽(yáng)性對(duì)照組IL-2、IFN-r、IL-4、TNF-α含量明顯降低(P<0.01)，M-BA組IL-2、IFN-r、IL-4、TNF-α含量降低(P<0.05或P<0.01)，L-BA組只有IL-2、TNF-α、IFN-r含量明顯降低(P<0.05)，而IL-4含量降低無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與肝損傷模型組比較，各BA劑量組IL-10含量明顯升高(P<0.05或P<0.01)，而B(niǎo)IF陽(yáng)性對(duì)照組IL-10含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。提示BA通過(guò)降低免疫細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子和提高抗炎性細(xì)胞因子的作用，能減輕T淋巴細(xì)胞毒性對(duì)肝細(xì)胞的損傷。

表2 白樺脂酸對(duì)刀豆蛋白所致急性免疫性肝損傷小鼠IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ的影響(n=10)Table 2 The effects of betulinic acid on cytokines (IL-2， IL-4， IL-10， TNF-α， IFN-γ) of concanavalin A-induced acute immune liver injury mice (n=10)

3.3 BA對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量的影響

造模后，同正常對(duì)照組相比，肝損傷模型組小鼠肝組織中Bcl-2的表達(dá)量明顯下降(P<0.001)，而給藥后，H-BA組、M-BA組、L-BA組與BIF陽(yáng)性對(duì)照組較肝損傷模型組Bcl-2的表達(dá)量明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義或有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.001)(圖1)。說(shuō)明免疫性肝損傷小鼠肝組織Bcl-2表達(dá)量明顯下降，而B(niǎo)A能上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞的存活。

3.4 BA對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝組織中凋亡相關(guān)蛋白activated-Caspase-3表達(dá)量的影響。

造模后，與正常對(duì)照組相比，肝損傷模型組小鼠肝組織中activated-Caspase-3的表達(dá)量明顯上升(P<0.001)，而給藥后，H-BA組、M-BA組、L-BA組與BIF陽(yáng)性對(duì)照組較肝損傷模型組activated-Caspase-3的表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.001)(圖2)。說(shuō)明免疫性肝損傷小鼠肝組織activated-Caspase-3的表達(dá)量明顯上升，引起肝細(xì)胞凋亡，加速肝組織損傷，而B(niǎo)A能下調(diào)activated-Caspase-3的表達(dá)量，減少了肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝組織的修復(fù)。

4 討論

許多研究表明，肝內(nèi)免疫反應(yīng)是引起肝損傷的重要機(jī)制之一，在乙肝發(fā)病過(guò)程中引起肝細(xì)胞損傷和破壞的直接因素是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)(Qinetal.，2010；楊逸等，2015)。T淋巴細(xì)胞作為免疫效應(yīng)細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，在機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)中均有重要作用。

Con A誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷是通過(guò)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性肝損傷動(dòng)物模型(Wahletal.，2009；Qinetal.，2010；Zhouetal.，2013；楊逸等，2015)。Con A與肝細(xì)胞漿膜有極強(qiáng)的親和性，注入體內(nèi)后大量聚集在肝臟，小鼠體內(nèi)ALT和AST迅速升高，同時(shí)大量免疫細(xì)胞向肝臟聚集，激活T淋巴細(xì)胞及kupffer細(xì)胞等，通過(guò)釋放多種細(xì)胞因子引起炎癥反應(yīng)參與肝損傷過(guò)程，并進(jìn)一步激活釋放TNF-α，通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制加速肝細(xì)胞損害(Gongetal.，2010；Chenetal.，2012；Fullertonetal.，2013；Tsutsui &Nishiguchi，2014)。ALT和AST是肝細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)(Qinetal.，2010；楊逸等，2015)。本研究結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)尾靜脈注射Con A 12 h后，血清中ALT、AST水平均明顯升高，而且TNF-α等細(xì)胞因子的血清含量亦明顯升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致(Qinetal.，2010；楊逸等，2015)，提示Con A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷模型成功建立。本研究結(jié)果還顯示，與肝損傷模型組比較，H-BA、M-BA、L-BA組小鼠血清中ALT、AST明顯降低，提示BA對(duì)免疫性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。

圖1 Western blot檢測(cè)各組小鼠肝組織中Bcl-2的表達(dá)量Fig. 1 The expression of Bcl-2 in mice liver tissue as determined by Western blot

與正常對(duì)照組比較，***P<0.001； 與肝損傷模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，n=3； 下圖同。

Compared with the normal group，***P<0.001; compared with the model group，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，n=3； the same below.

圖2 Western blot檢測(cè)各組小鼠肝組織中activated-Caspase-3的表達(dá)量Fig. 2 The expression of activated-Caspase-3 in mice liver tissue as determined by western blot

研究表明，Con A造成的免疫性肝損傷小鼠模型中IFN-、TNF-α是引起急性肝損傷的重要炎癥細(xì)胞因子(Guilhoetal.，1996；Qinetal.，2010)。T淋巴細(xì)胞的激活在整個(gè)肝損傷發(fā)生過(guò)程中起了核心的調(diào)節(jié)作用。T淋巴細(xì)胞激活，可導(dǎo)致Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IFN-及Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平均顯著升高。IL-2、IL-4和IFN-等炎性細(xì)胞因子可以激活kupffer細(xì)胞誘導(dǎo)TNF-等其他炎癥因子的產(chǎn)生，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，引起持續(xù)的肝細(xì)胞損傷(Tiegsetal.，1992；Guilhoetal.，1996；Kakumuetal.，1997；Qinetal.，2010)。IL-10為巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞在肝內(nèi)產(chǎn)生的強(qiáng)有力的抗炎性細(xì)胞因子，可以抑制Th1細(xì)胞因子(IL-2、IFN-等)的細(xì)胞免疫功能，對(duì)急性肝損傷具有保護(hù)作用(Mizuharaetal.，1996；Zhangetal.，2001)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看到，肝損傷時(shí)小鼠血清中炎性細(xì)胞因子IL-2、IFN-、IL-4、TNF-的含量顯著升高，而抗炎性因子IL-10的含量也有明顯升高，可能與肝臟損傷后機(jī)體自身可釋放一定量的抗炎性因子有關(guān)。而給予BA干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)BA各劑量組可顯著下調(diào)肝損傷小鼠血清中已經(jīng)升高的IL-2、IFN-、IL-4、TNF-因子含量，同時(shí)升高抗炎性因子IL-10的含量，提示BA可以進(jìn)一步促進(jìn)抗炎性因子的釋放以對(duì)抗炎癥反應(yīng)。

Con A造成的免疫性肝損傷中，肝細(xì)胞的死亡有肝細(xì)胞的凋亡和壞死，炎癥細(xì)胞因子可以通過(guò)死亡配體和受體的相互作用誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡(Gantneretal.，1995)。細(xì)胞凋亡的發(fā)生與抗凋亡蛋白因子如Bcl-2和蛋白激酶B等以及促凋亡蛋白因子如Caspase-3、細(xì)胞色素c和Bax等有密切的關(guān)系(Muoz-Pinedo，2012；Yangetal.，2014)。Caspase-3通過(guò)選擇性地切割某些物質(zhì)，從而造成細(xì)胞凋亡。activated-Caspase-3是幾乎所有細(xì)胞凋亡的最后執(zhí)行者(Munoz-Pinedo，2012；Yangetal.，2014)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Con A造模后，小鼠肝組織中Bcl-2表達(dá)下降，activated-Caspase-3表達(dá)量明顯升高，說(shuō)明肝細(xì)胞啟動(dòng)了凋亡機(jī)制，引起肝損傷，藥物干預(yù)后，Bcl-2表達(dá)量上升，activated-Caspase-3表達(dá)量明顯下調(diào)，說(shuō)明BA通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)抑制肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)肝組織的修復(fù)，減少肝損傷。

綜上所述，BA對(duì)Con A誘導(dǎo)的小鼠急性免疫性肝損傷具有拮抗作用。BA通過(guò)減少免疫細(xì)胞炎性細(xì)胞因子同時(shí)提高抗炎性細(xì)胞因子的釋放，以及上調(diào)Bcl-2和下調(diào)activated-Caspase-3的抗凋亡機(jī)制而發(fā)揮拮抗肝損傷的作用。

孫嘉， 馬丹， 王萍， 等. 2015. 白樺脂酸聯(lián)合硼替佐米誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究[J]. 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 40(10)： 1024-1028.

楊逸， 覃筱燕， 郭哲， 等. 2015. 人參皂苷Rg1對(duì)小鼠免疫性肝損傷保護(hù)作用[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生， 31(3)： 309-311.

張琛琛， 魯佩， 田玉科， 等. 2014. 白樺脂酸預(yù)處理對(duì)小鼠腦缺血再灌注時(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響[J]. 中華麻醉學(xué)雜志， 34(7)： 859-862.

鄭晨宏， 謝曉華. 2016. 刀豆蛋白A誘導(dǎo)肝損傷模型中免疫細(xì)胞及因子研究進(jìn)展[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 37(2)： 191-194.

Chen J， Duan L， Xiong A，etal. 2012. Blockade of IL-33 ameliorates Con A-induced hepatic injury by reducing NKT cell activation and IFN-γ production in mice[J]. Journal of Molecular Medicine， 90(12)： 1505-1515.

Cichewicz RH， Kouzi SA. 2004. Chemistry biological activity and chemotherapeutic potential of Betulinic acid for the prevention and treatment of cancer and HIV infection[J]. Medicinal Research Reviews， 24(1)： 90-114.

Fullerton AM， Roth RA， Ganey PE. 2013. Pretreatment with TCDD exacerbates liver injury from Concanavalin A： critical role for NK cells[J]. Toxicollogical Sciences， 136(1)： 72-85.

Gantner F， Leist M， Lohse AW，etal. 1995. Concanavalin A-induced T cell-mediated hepatic injury in mice： the role of tumor mecrosis factor[J]. Hepatology， 21(1)： 190-198.

Gong Q， Zhang H， Li J，etal. 2010. High-mobility group box 1 exacerbates concanavalin A-induced hepatic injury in mice[J]. Journal of Molecular Medicine， 88(12)： 1289-1298.

Guilhot S， Miller T， Cornman G，etal. 1996. Apoptosis induced by tumor mecrosis factor-alpha in rat hepatocyte cell lines expressing hepatitis B virus[J]. The American Journal of Pathology， 148(3)： 801-814.

Kakumu S， Okurnra A， Ishikawa T，etal. 1997. Production of interleukin-10 and 12 by peripheral blood monoclear cells (PBMC) in chronic hepatitis C virus (HCV) infection[J]. Clinical & Experimental Immunology， 108(1)： 138-143.

Mizuhara H， Uno M， Seki N，etal. 1996. Critical involvement of interferon gamma in the pathogenesis of T-cell activation-associated hepatitis and regulatory mechanisms of interleukin-6 for the manifestations of hepatitis[J]. Hepatology， 23(6)： 1608-1615.

Qin XY， Li T， Yan L，etal. 2010. Tanshinone ⅡA protects against immune-mediated liver injury through activation of T-cell subsets and regulation of cytokines[J]. Immunopharmacology & Immunotoxicology， 32(1)： 51-55.

Schühly W， Heilmann J， Calis I，etal. 1999. New triterpenoids with antibacterial activity fromZizyphusjoazeiro[J]. Planta Medica， 65(8)： 740-743.

Tiegs G， Hentschel J， Wendel A. 1992. A T cell-denendent experimental liver injury in mice inducible by Concanavalin A[J]. The Journal of Clinical Investigation， 90(1)： 196-203.

Tsutsui H， Nishiguchi S. 2014. Importance of kupffer cells in the development of acute liver injuries in mice[J]. International Journal of Molecular Sciences， 15(5)： 7711-7730.

Wahl C， Wegenka UM， Leith?user F，etal. 2009. IL-22-dependent attenuation of T cell-dependent (Con A) hepatitis in herpes virus entry mediator deficiency[J]. The Journal of Immunology， 182(8)： 4521-4528.

Wang C， Nie H， Li K，etal. 2012. Curcumin inhibits HMGB1 releasing and attenuates concanavalin A-induced hepatitis in mice[J]. European Journal of Pharmacology， 697(1)： 152-157.Yang XP， Liu TY， Qin XY，etal. 2014. Potential protection of 2， 3， 5， 4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside against staurosporine-induced toxicity on cultured rat hippocampus neurons[J]. Neuroscience Letters， 576(2)： 79-83.

Zhang XL， Quan QZ， Sun ZQ，etal. 2001. Protective effects of cyclosporine A on T-cell dependent Con A-induced liver injury in Kunming mice[J]. World Journal of Gastroenterol， 7(4)： 569-571.

Zhou YQ， Dai WQ， Lin CL，etal. 2013. Protective effects of necrostatin-1 against concanavalin A-induced acute hepatic injury in mice[J]. Mediators of Inflammation， (2013)： 706156.

The Effects of Betulinic Acid on the Expression of Cytokines and Apoptosis-related Proteins in Immune Liver Injury Induced by Concanavalin A

WANG Baili1， 3#， WU Huantong1， 2#， CAO Chang1， 2#， ZHANG Shuping1， 2*， QIN Xiaoyan1， 2*

(1. College of Life & Environmental Science， Minzu University of China， Beijing 100081， China；2. Beijing Engineering Research Center of Food Environment and Health， Minzu University of China， Beijing 100081， China；3. The School Hospital Clinical Laboratory， Minzu University of China， Beijing 100081， China)

Objective To study the effects of betulinic acid (BA) on the expression of cytokines and apoptosis-related proteins in acute immune liver injury induced by concanavalin A (Con A). Methods A total of 60 male KM mice were divided into six groups randomly， including control group， Con A model group， bifendate (BIF) group and three BA groups with gradient concentrations. Saline diluted BA (30 mg·kg-1， 15 mg·kg-1， 7.5 mg·kg-1) was given orally to mice. After 15 days’ BA pretreatment， mice were then injected with Con A (20 mg·kg-1) to establish the mouse model with acute immune liver injury. Automatic biochemical analyzer was conducted to determine serum liver function indices such as plasma alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST)； ELISA was used to determine the levels of serum inflammatory cytokines (IL-2， IL-4， IL-10， TNF-α， IFN-γ)； Western blot was used to detect the expression of liver tissue apoptosis related proteins (Bcl-2 and activated-Caspase-3). Results Compared with the control group， Con A treated mice showed significantly lower serum ALT and AST levels， while the levels of inflammatory cytokines (IL-2， IL-4， IL-10， TNF-α， IFN-γ) increased significantly. The expression of Bcl-2 was significantly decreased (P<0.05)， whereas the expression of activated-Caspase-3 was significantly increased (P<0.01). Compared with the Con A model group， the mice that treated with different doses of BA， especially the middle and high dose groups， showed significantly reduced serum ALT and AST levels， as well as significantly decreased serum IL-2， IL-4， TNF-α and IFN-γ levels but increased IL-10. The apoptosis related proteins Bcl-2 and activated-Caspase-3 also showed contrary expression changes： the former increased while the latter decreased. Conclusion These findings suggested that BA had antagonistic action on the mouse with acute immune liver injury induced by Con A to some extent， and the mechanism of this process may be related with the anti-apoptosis and anti-inflammatory functions of BA to reduce the toxic effects of T lymphocytes.

betulinic acid； concanavalin A； acute immune liver injury； cytokines； Bcl-2； activated-Caspase-3

2016-04-18 接受日期：2016-06-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372225)； 中央民族大學(xué)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(YLDX01013)； 社會(huì)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(2015MDTD13C)； 高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃(B08044)

汪佰莉(1979—), E-mail:13811636247@163.com; 吳煥童(1992—), E-mail:13810472177@163.com; 曹暢(1991—), E-mail:caochang511@163.com#共同第一作者

*通信作者Corresponding author, E-mail:bjqinxiaoyan@muc.edu.cn; zhangshuping@muc.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20160091

Q78

A

1000-7083(2016)04-0511-06