大熊貓糞便野外暴露時(shí)間對(duì)微衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)的影響

王承東， 楊波， 黃杰， 黃炎， 成彥曦， 李仁貴， 黃山， 李德生， 張和民*

(1.中國保護(hù)大熊貓研究中心，四川臥龍623006； 2. 四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610064； 3. 河南商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南商丘476000)

大熊貓糞便野外暴露時(shí)間對(duì)微衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)的影響

王承東1， 楊波1， 黃杰2， 3， 黃炎1， 成彥曦1， 李仁貴1， 黃山1， 李德生1， 張和民1*

(1.中國保護(hù)大熊貓研究中心，四川臥龍623006； 2. 四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610064； 3. 河南商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南商丘476000)

非損傷性取樣，如從糞便中獲取DNA用于分子生物學(xué)研究已經(jīng)在珍稀野生動(dòng)物中得到了廣泛應(yīng)用。DNA質(zhì)量與后續(xù)研究很大程度上依賴于糞便暴露時(shí)間的長短。本研究通過分析不同新鮮程度糞便樣品的DNA質(zhì)量和微衛(wèi)星基因分型效果探討大熊貓糞便野外暴露時(shí)間對(duì)分子實(shí)驗(yàn)的影響。研究表明，暴露時(shí)間越短，糞便DNA降解程度越低，所提取的DNA質(zhì)量也較高。同時(shí)糞便DNA的降解程度與季節(jié)和暴露環(huán)境也有一定的關(guān)系：春、秋季14 d以內(nèi)、夏季7 d以內(nèi)、冬季21 d以內(nèi)的糞便樣品提取的DNA質(zhì)量較好，微衛(wèi)星能成功分型；另外，野外臥穴口的糞便樣品DNA保存時(shí)間相對(duì)較長。本研究對(duì)野外大熊貓糞便采集工作具有指導(dǎo)意義。

大熊貓；糞便；暴露時(shí)間；微衛(wèi)星

20世紀(jì)90年代中期出現(xiàn)的野生動(dòng)物非損傷性取樣已得到廣泛應(yīng)用(Taberletetal.，1999；陳璐，岳曦，2007；Roquesetal.，2014；Sugimotoetal.，2014)。在所有非損傷性取樣中，糞便最易收集，且對(duì)動(dòng)物的干擾及負(fù)面影響最小，因此是非損傷性取樣中最具有潛在價(jià)值的研究材料(魏輔文等，2001；Zhanetal.，2006；Zhuetal.，2013)。在野生動(dòng)物的物種鑒定(Roquesetal.，2014)、個(gè)體識(shí)別(Taberlet & Luikart，1999；Chakrabortyetal.，2014)、性別鑒定(Baumgardtetal.，2013；Roquesetal.，2014)、交配方式分析(Canigliaetal.，2014)、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析(Canigliaetal.，2014)、遺傳多樣性評(píng)估(Sugimotoetal.，2014)、基因流分析(Saarinenetal.，2014)、種群數(shù)量及保護(hù)管理單元的制定(方盛國等，1996)等方面已得到廣泛應(yīng)用。

糞便暴露在野外環(huán)境中，DNA會(huì)因被核酸內(nèi)切酶作用而降解，DNA降解隨著暴露時(shí)間的延長而增加，影響PCR的擴(kuò)增甚至不能擴(kuò)增(Frantzenetal.，1998)。雖然有研究表明，在野外暴露12 h甚至1 d的糞便樣品能夠獲得很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Murphyetal.，2002；Chambersetal.，2004；Nsubugaetal.，2004)，但DNA的降解受到多種因素的影響，如溫度、濕度、光照強(qiáng)度等(Femandoetal.，2003)。大熊貓Ailuropodamelanoleuca野生個(gè)體數(shù)量稀少，在野外生活十分警覺，遇見率極低，野外樣品的采集對(duì)糞便的依賴度更高，而且在野生環(huán)境中很難獲得新鮮糞便。因此，較準(zhǔn)確地辨別大熊貓糞便暴露時(shí)間和確定暴露多久的糞便能夠用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究對(duì)于大熊貓野外種群數(shù)量調(diào)查(方盛國等，1996)、種群遺傳學(xué)(Luetal.，2001；Zhangetal.，2007；Shenetal.，2009；Yangetal.，2011；Zhuetal.，2011；Huangetal.，2015)以及野化放歸(楊波等，2013)等生態(tài)學(xué)問題的研究具有重要意義。本研究旨在探討不同新鮮程度糞便樣品的DNA提取質(zhì)量與后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)的效果，為野外工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與處理

2013年1月采集中國保護(hù)大熊貓研究中心臥龍核桃坪野化基地3只圈養(yǎng)大熊貓的糞便樣品，每只大熊貓采集2團(tuán)糞便，做2個(gè)環(huán)境處理。仿野外環(huán)境：將糞便置于四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院樓外草叢中(溫度9.97 ℃±3.16 ℃，濕度48.27%±16.38%)；恒定環(huán)境：室內(nèi)恒溫箱溫度22.5 ℃±0.5 ℃，濕度62.5%±2.5%。每周1次采樣并提取DNA，利用10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行分析。

2013年6月獲取中國保護(hù)大熊貓研究中心雅安碧峰峽基地的大熊貓糞便樣品共24份，編號(hào)為YA01～YA24。樣品均置于人工竹林中，竹密度為每平方米31株，平均竹高1.5 m，竹蓋度92%，溫度21.4 ℃±2.0 ℃，濕度80.8%±10.7%，暴露不同時(shí)間用于取樣檢測。

2014年8月采集中國保護(hù)大熊貓研究中心臥龍核桃坪野化基地4只半野化大熊貓的糞便樣品，做4個(gè)環(huán)境處理。

A. 竹林地：竹密度為每平方米27株，竹蓋度95.5%，基質(zhì)為腐竹葉和枯竹稈混合的松軟泥土，郁閉度0.92，25°左右的半陰陽坡，溫度16.6 ℃±2.9 ℃，濕度77.2%±28.3%。

B. 苔蘚地：竹密度為每平方米12株，竹蓋度90%，基質(zhì)為潮濕的苔蘚地，郁閉度0.85，2°左右的半陰陽坡，為竹林邊緣地帶，類似大熊貓過道的生境類型，溫度16.8 ℃±3.0 ℃，濕度77.7%±28.0%。

C. 臥息地：高大喬木底部，基質(zhì)為覆蓋有枯枝葉的硬質(zhì)泥地，郁閉度0.90，18°左右的半陰陽坡，溫度17.2 ℃±2.8 ℃，濕度80.0%±30.0%。

D. 臥穴口：位于巖石底部內(nèi)凹處，基質(zhì)為碎石，郁閉度0.78，10°左右的陰坡，溫度17.3 ℃±2.8 ℃，濕度76.0%±27.0%。

2015年9月下旬采集中國保護(hù)大熊貓研究中心都江堰基地的圈養(yǎng)大熊貓糞便樣品，做2個(gè)環(huán)境處理。

E. 草地：竹蓋度約95%，松軟泥土，上蓋腐竹葉，并夾生草本植物，陰涼潮濕；溫度19.5 ℃±3.5 ℃，濕度64.5%±6.8%。

F. 裸露地：完全暴露在陽光下的碎石地，相對(duì)干燥，東南面有一建筑，距離約1 m；溫度20.0 ℃±2.9 ℃，濕度61.9%±3.9%。

糞便新鮮程度共設(shè)計(jì)6個(gè)時(shí)間梯度，即1 d、3 d、7 d、14 d、21 d和28 d。

1.2 糞便DNA提取

大熊貓糞便樣品DNA提取使用德國Qiagen生產(chǎn)的試劑盒QIAamp DNA Stool Kit，步驟及方法按廠商使用說明操作，瓊脂糖凝膠電泳初步檢測DNA提取是否成功、DNA濃度及質(zhì)量，-20 ℃保存。

1.3 微衛(wèi)星位點(diǎn)選擇

Huang等(2015)基于大熊貓基因組微衛(wèi)星篩選了能夠有效使用的大熊貓糞便DNA的微衛(wèi)星位點(diǎn)。本文使用了其中10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，并對(duì)每1個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的上游引物F’端進(jìn)行熒光標(biāo)記。

1.4 PCR反應(yīng)條件及基因分型

25 μL PCR反應(yīng)體系：25 ng DNA，2.5 μL 10×PCR buffer，1.0～2.0 μm MgCl2，200 μM dNTP，上、下游引物各1.0 μm，1 U Taq酶，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)在iCycler PCR反應(yīng)儀(Bio-Rad，USA)中進(jìn)行，PCR產(chǎn)物4 ℃避光保存，每個(gè)樣本PCR產(chǎn)物取5 μL，用1%瓊脂糖電泳檢測每個(gè)樣本是否成功擴(kuò)增，確定獲得產(chǎn)物為單一、大小正確的DNA片段。各個(gè)樣本PCR產(chǎn)物使用377 DNA sequencer(ABI PRISM，USA)進(jìn)行基因分型，使用GeneMapper v3.2確定樣本等位基因數(shù)，等位基因大小相對(duì)于分子內(nèi)標(biāo)ROX-500[基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)(北京)有限公司]決定?；蚍中陀杀本╅單⒒蚬就瓿伞?/p>

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 DNA提取質(zhì)量

糞便樣品暴露時(shí)間的不同，所提取的DNA質(zhì)量存在差異。2013年1月放置于四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院樓外草叢中的糞便樣品暴露不同時(shí)間后，提取DNA電泳檢測發(fā)現(xiàn)，14 d以內(nèi)均能獲得較高質(zhì)量的DNA(圖1)。2013年6月放置于雅安碧峰峽基地人工竹林中的糞便樣品，暴露7 d后已有一些降解，但仍有部分樣品能夠提取較高質(zhì)量的DNA(編號(hào)為13～15)，而暴露了18 d(編號(hào)為16～19)和30 d的樣品(編號(hào)為20～24)提取的DNA質(zhì)量較差，降解嚴(yán)重(圖2)。2014年8月放置于臥龍核桃坪野化基地野生環(huán)境下的樣品(圖3)，3 d內(nèi)均能提取質(zhì)量較好的DNA，從7 d后開始出現(xiàn)不同程度的降解；而臥穴口的糞便即使暴露14 d后，其DNA質(zhì)量仍然較好。2015年9月下旬放置于都江堰基地模擬野生環(huán)境下的樣品，暴露21 d后還可以提取出較好質(zhì)量的DNA(圖4)。表明不同環(huán)境下，糞便樣品DNA的保存時(shí)間差異較大。

圖1 2013年1月放置于四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院樓外的大熊貓糞便樣品DNA提取質(zhì)量Fig. 1 DNA extracted from Ailuropoda melanoleuca feces exposed outside the building of College of Life Sciences， Sichuan University， January 2013

圖2 2013年6月放置于中國保護(hù)大熊貓研究中心雅安碧峰峽基地大熊貓糞便樣品DNA提取質(zhì)量Fig. 2 DNA extracted from Ailuropoda melanoleuca feces exposed in the field of Ya’an Bifeng Gorge Base， China Conservation and Research Center for Giant Panda， Sichuan， June 2013

圖3 2014年8月放置于中國保護(hù)大熊貓研究中心臥龍核桃坪野化基地大熊貓糞便樣品DNA提取質(zhì)量Fig. 3 DNA extracted from Ailuropoda melanoleuca feces exposed in the field of Wolong Base， China Conservation and Research Center for Giant Panda， Sichuan， August 2014A.竹林地 bamboo forest， B.苔蘚地 moss， C.臥息地 bed site， D.臥穴口 entrance of cave; 下同， the same below.

圖4 2015年9月放置于中國保護(hù)大熊貓研究中心 都江堰基地大熊貓糞便樣品DNA提取質(zhì)量Fig. 4 DNA extracted from Ailuropoda melanoleuca feces that exposed in the field of Dujiangyan Disease Control Center， China Conservation and Research Center for Giant Panda， Sichuan， September 2015

E.草地 grassland， F.裸露地 open ground; 下同， the same below.

2.2 微衛(wèi)星基因分型結(jié)果

利用10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)不同暴露時(shí)間糞便樣品的DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增及基因分型。每個(gè)樣品3次重復(fù)，結(jié)果無差異，同環(huán)境、同暴露時(shí)間樣品間的分析結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同環(huán)境中的樣品分析結(jié)果存在一定差異，即樣品DNA的PCR擴(kuò)增成功率均隨著暴露時(shí)間的增加而降低。樣品暴露35 d后，環(huán)境導(dǎo)致的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。置于恒溫(22.5 ℃±0.5 ℃)、恒濕(62.5%±2.5%)的環(huán)境條件下，暴露35 d后，選取的10個(gè)位點(diǎn)中有6個(gè)以上的位點(diǎn)能成功分型；而置于室外環(huán)境條件下(溫度9.97 ℃±3.16 ℃)，由于溫度較低，暴露42 d后樣品中的10個(gè)位點(diǎn)中仍有6個(gè)以上的位點(diǎn)能成功分型(表1)。

根據(jù)Huang等(2015)建立的個(gè)體識(shí)別系統(tǒng)，15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，使用6個(gè)位點(diǎn)能夠成功進(jìn)行大熊貓的個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。放置于中國保護(hù)大熊貓研究中心雅安碧峰峽基地模擬野化環(huán)境中的糞便樣品，基因分型結(jié)果顯示，暴露18 d內(nèi)的樣品平均有6個(gè)以上的位點(diǎn)能成功分型，能夠用于個(gè)體識(shí)別研究。而超過18 d的樣品，DNA降解較為嚴(yán)重，給基因分型帶來一定的難度，而超過30 d的樣品，分型成功率僅為45%，不能滿足個(gè)體識(shí)別及親子鑒定的要求(表2)。

2014年8月放置于中國保護(hù)大熊貓研究中心臥龍核桃坪野化基地野外環(huán)境中的糞便樣品暴露7 d后，微衛(wèi)星分型成功率出現(xiàn)明顯下降，苔蘚地樣品的分型成功率只有50%左右，不能用于后續(xù)分析。不管怎樣，臥穴口樣品的DNA保存較好，暴露21 d后仍有大約60%的位點(diǎn)可以成功分型。2015年9月放置于中國保護(hù)大熊貓研究中心都江堰基地的樣品暴露7 d后DNA保存較好，約有60%以上的位點(diǎn)可以成功分型，暴露14 d時(shí)，草地樣品的DNA降解嚴(yán)重，成功分型的位點(diǎn)降至一半以下，而裸露地樣品的位點(diǎn)仍有60%以上能夠成功分型，可以進(jìn)行后續(xù)分析(表3)。

表1 2013年1月四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院樓外大熊貓糞便樣品在不同暴露時(shí)間下微衛(wèi)星成功分型的平均位點(diǎn)數(shù))Table 1 The mean numbers of successfully genotyped microsatellite loci using Ailuropoda melanoleuca feces DNA (S1， S2， and S3) with different exposure times outside the building of College of Life Sciences， Sichuan University )

注Notes:*P<0.05，**P<0.01; In. 恒溫恒濕環(huán)境constant temperature and humidity environment， Out. 室外環(huán)境outdoor environment; 下表同， the same below.

表2 2013年6月在中國保護(hù)大熊貓研究中心雅安碧峰峽基地大熊貓糞便樣品在不同暴露時(shí)間下微衛(wèi)星成功分型的平均位點(diǎn)數(shù))Table 2 The mean numbers of successfully genotyped microsatellite loci using Ailuropoda melanoleuca feces DNA with different exposure times in Ya’an Bifeng Gorge Base， China Conservation and Research Center for Giant Panda， Sichuan )

表3 2014年8月在中國保護(hù)大熊貓研究中心臥龍核桃坪野化基地和2015年9月在都江堰基地 大熊貓糞便樣品在不同暴露時(shí)間下微衛(wèi)星成功分型的平均位點(diǎn)數(shù))Table 3 The mean numbers of successfully genotyped microsatellite loci using Ailuropoda melanoleuca feces DNA with different exposure times in the field of Wolong Base (A， B， C， D) and in the field of Dujiangyan Disease Control Center (E， F)， China Conservation and Research Center for Giant Panda， Sichuan )

3 討論

本研究旨在探討大熊貓糞便暴露時(shí)間與DNA提取質(zhì)量以及后續(xù)分子生物學(xué)研究的關(guān)系，進(jìn)而對(duì)野外糞便采集提供參考。本研究于2012年12月—2013年1月，在四川大學(xué)校園內(nèi)模擬野外環(huán)境暴露糞便樣品，發(fā)現(xiàn)冬季寒冷干燥的環(huán)境最適于糞便的保存，即使暴露時(shí)間長達(dá)42 d，依然可以獲得較高質(zhì)量的DNA。但是，2013年6月在更接近野外環(huán)境的中國保護(hù)大熊貓研究中心雅安碧峰峽基地的人工竹林中，暴露18 d的樣品降解嚴(yán)重，這可能由于研究期處于初夏，正是多雨時(shí)節(jié)，溫、濕度高，糞便DNA降解速度快。2014年8月在有野生大熊貓分布的中國保護(hù)大熊貓研究中心臥龍核桃坪野化基地的野外環(huán)境中，暴露7 d的糞便樣品DNA降解就較為嚴(yán)重，8月氣溫更高，相關(guān)酶活性也更高，DNA降解更快。因此不同季節(jié)，糞便樣品中DNA的保存時(shí)間差異顯著，建議野外糞便樣品的采集盡可能選擇在氣溫較低、少雨的秋、冬季進(jìn)行。

糞便DNA降解嚴(yán)重與否，除與氣溫和天氣有關(guān)外，與糞便暴露的環(huán)境也有一定的關(guān)系。野外環(huán)境中的植被類型、郁閉度、灌木蓋度、坡度和坡向等因子直接影響環(huán)境中的溫度和濕度，因而與糞便中DNA的保存時(shí)間必然相關(guān)。先前研究表明，四川野生大熊貓常出現(xiàn)在郁閉度大于0.50的落葉闊葉林和針闊混交林中，微生境為竹林，其多選擇平均高度為2～5 m、蓋度大于50%的竹林中覓食，喜歡在平緩的(坡度在6～30°范圍內(nèi))東南坡向或陽坡與半陽坡的生境中活動(dòng)，在海拔2 000～3 000 m的活動(dòng)較多(魏輔文，馮祚建，1999；張澤鈞，胡錦矗，2000；康東偉等，2011；趙秀娟等，2012)。本研究中臥龍的試驗(yàn)樣地符合大熊貓日?；顒?dòng)的生境。研究表明暴露7 d的糞便樣品中的DNA約有一半以上的微衛(wèi)星位點(diǎn)能夠成功分型，且微生境較干燥的環(huán)境，比如臥穴口糞便樣品中的DNA保存時(shí)間更長，暴露14 d以內(nèi)的糞便可以滿足微衛(wèi)星分析要求，甚至暴露21 d的糞便也可以分析。這些結(jié)果可以為野外糞便的收集提供參考。

4 糞便樣品采集建議

在野外糞便樣品采集時(shí)，需要根據(jù)樣品的外形特點(diǎn)，如糞便表皮黏膜組織的干燥程度、黏膜的光澤度、黏膜厚度，判斷糞便樣品暴露的大致時(shí)間。據(jù)野外觀察，在3 d以內(nèi)排出的大熊貓糞便很容易辨認(rèn)，糞便表面的黏液完整，有光澤，觸摸有光滑細(xì)膩的感覺，打開即能嗅到一股清香的竹味，表面顏色與里面相同，成色新鮮，糞團(tuán)表面無霉菌滋生(郭建，胡錦矗，2001)。暴露7 d的糞便在濕熱的微環(huán)境下，其表面無黏膜，有少量白色菌絲，糞便稍松散；而在較干燥的環(huán)境下，其表面有一層猶如薄紙狀的略帶光澤的黏膜，無菌絲滋生，外形保持完整。暴露14 d的糞便松散，表面霉菌明顯增多，菌絲長度在1 cm左右，有霉味；較干燥環(huán)境下的糞便與暴露7 d時(shí)的幾乎無變化。暴露21 d的糞便外形松散嚴(yán)重，霉味嚴(yán)重，霉菌布滿糞便表面，菌絲最長長度在2 cm左右；較干燥的環(huán)境下，糞便干裂，表面無薄紙狀黏膜或極少。

基于本研究結(jié)果，我們對(duì)野外大熊貓糞便的采集有以下建議：(1)野外糞便采集盡量選擇在秋、冬季開展，糞便暴露時(shí)間最好不超過14 d，如果需要在春、夏季采樣，則糞便暴露時(shí)間最好不超過7 d。(2)野外糞便采集時(shí)，盡量選擇干燥、透氣微生境中的糞便，因?yàn)楦稍?、透氣環(huán)境中糞便DNA保存時(shí)間較長。(3)采集時(shí)記錄清晰、詳盡，并注意重復(fù)采樣，以便后續(xù)研究。

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Effect of Exposure Time ofAiluropodamelanoleucaFeces on Microsatellites Analysis

WANG Chengdong1， YANG Bo1， HUANG Jie2， 3， HUANG Yan1， CHENG Yanxi1，LI Rengui1， HUANG Shan1， LI Desheng1， ZHANG Hemin1*

(1. China Conservation and Research Center for the Giant Panda， Wolong， Sichuan Province 623006， China; 2. Sichuan Key Laboratory of Conservation Biology on Endangered Wildlife， College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610064，China; 3. College of Life Sciences， Shangqiu Normal University， Shangqiu， Henan Province 476000， China)

Noninvasive sampling methods， such as acquiring host genomic DNA from fecal samples for molecular biology research， are increasingly used in endangered wild animals. However， it is difficult to obtain fresh feces in the field. By focusing on the effects of feces after different exposure times in the field on molecular studies for giant pandas (Ailuropodamelanoleuca)， we found that shorter exposure time of feces would lower the level of DNA degradation， and increase the quality of the feces DNA. The degradation level of feces DNA was also related to seasonal variation and field environment. The valid time was no longer than 14 days in spring and autumn， less than 7 days in summer and no longer than 21 days in winter. Moreover， dry environment such as the entrance of the cave may be the best place for preserving feces samples in the field. The results of this study provided guidance for the feces collection of wild giant pandas in the field.

Ailuropodamelanoleuca; feces; exposure time; microsatellite

2016-02-16 接受日期：2016-03-24

大熊貓國合資金項(xiàng)目(AD1413)：大熊貓飼養(yǎng)、繁育及管理； 重點(diǎn)區(qū)域野生大熊貓疫病本底調(diào)查與監(jiān)測

王承東， 博士， 高級(jí)工程師， 主要從事大熊貓飼養(yǎng)管理、獸醫(yī)及放歸研究

*通信作者Corresponding author， E-mail:wolong-zhm@126.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160033

Q958.1; Q953

A

1000-7083(2016)04-0481-07