白藜蘆醇對哮喘小鼠磷脂酶A2活性和氣道炎癥的影響

王經韻，邱心敏，羅夏炯，陳小夏，何冰

(1.廣東省人民醫(yī)院 國家臨床藥物實驗機構辦公室，廣東 廣州 510080； 2.廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 510006)

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藥理學

白藜蘆醇對哮喘小鼠磷脂酶A2活性和氣道炎癥的影響

王經韻1，邱心敏2，羅夏炯2，陳小夏2，何冰2

(1.廣東省人民醫(yī)院 國家臨床藥物實驗機構辦公室，廣東 廣州 510080； 2.廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 510006)

目的 探討白藜蘆醇對哮喘小鼠磷脂酶A2活性和氣道炎癥的影響。方法 采用卵清蛋白(OVA)刺激，建立小鼠哮喘模型，測定哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細胞總數及嗜酸粒細胞(EOS)計數；紫外分光光度法測定肺組織中前列腺素E2(PGE2)的含量；鹽酸滴定法測定肺組織和血清中磷脂酶A2活性。結果 白藜蘆醇能顯著減少哮喘模型小鼠BALF中白細胞總數及EOS計數，減少肺組織中PGE2含量，降低磷脂酶A2活性。結論 白藜蘆醇對哮喘小鼠有保護作用，可能與其降低磷脂酶A2活性、減輕炎性細胞浸潤、減少炎癥介質PGE2的產生有關。

白藜蘆醇； 支氣管哮喘； 炎癥細胞； 前列腺素E2； 磷脂酶A2

支氣管哮喘是以慢性氣道炎癥為特征的疾病。在哮喘的發(fā)病中，磷脂酶A2(PLA2)作為催化磷脂二位酰基水解的酶，對白三烯、前列腺素及血小板激活因子等炎性介質的生成及炎癥細胞浸潤有重要作用，并參與了哮喘的一系列病理生理過程[1]。白藜蘆醇屬于非黃酮類的多酚化合物，前期的研究表明白藜蘆醇具有防治肺部疾病的作用[2-3]，對支氣管平滑肌有松弛的作用[4]以及減少哮喘相關炎癥介質的產生[5]。本研究通過觀察哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的炎癥細胞數、肺組織中前列腺素E2(PGE2)含量及PLA2活性，進一步探討白藜蘆醇的抗炎平喘作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性KM小鼠50只，體質量(20±2) g，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2013-0020。

1.2 實驗藥品與試劑

白藜蘆醇(碧云天生物技術研究所，批號20141224)；卵清白蛋白(上海源葉生物科技有限公司，批號KAO431YA25)；地塞米松磷酸鈉注射劑(廣州白云山天心制藥有限公司，批號20141027)；卵磷脂(上海源葉生物科技有限公司，批號20140325)，其他試劑均為國產分析純?？乖海汉寻椎鞍?25 mg和氫氧化鋁1 mg。

1.3 實驗儀器

WH-2000超聲波霧化器(汕頭市粵華醫(yī)療器械廠有限公司)；ZC-10智能型超級恒溫水槽裝置(寧波天恒儀器廠)；PHS-25(數顯)pH計(上海精密科學儀器有限公司)；752/752N 紫外可見分光光度計(杭州匯爾儀器設備有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 小鼠哮喘模型的建立與給藥 50只小鼠隨機分5組，分別為空白組、模型組、白藜蘆醇高劑量組(50 mg/kg)、白藜蘆醇低劑量組(25 mg/kg)、地塞米松陽性對照組(5 mg/kg)。參照文獻[6]建立小鼠哮喘模型，除空白組外，其他各組分別于第1、7、14天腹腔注射10%(φ)卵白蛋白(OVA)抗原液0.2 mL，第15天開始將各組小鼠置于霧化箱中(空白組以生理鹽水霧化攻擊)以1%OVA霧化激發(fā)，使小鼠出現撓鼻、安靜少動、弓背、喘促、腹肌凹陷等急性哮喘發(fā)作癥狀，每天1次，每次30 min，連續(xù)1周。藥物組和陽性對照組于實驗第15天開始灌胃給藥，空白組與哮喘模型組給予等容積的生理鹽水，每次霧化激發(fā)前半小時進行藥物干預，連續(xù)7 d。

1.4.2 標本采集與檢測 小鼠最后一次霧化激發(fā)后1 h，小鼠眼眶取血。處死小鼠后，行支氣管插管，用生理鹽水反復灌洗雙肺3次，回收灌洗液，于4 ℃下1 000 r/min離心10 min，棄上清，細胞用1 mL Hank液重懸，取0.1 mL充板計白細胞總數，涂片，劉氏染色，計數200個細胞作細胞分類計數。取肺組織制備1%肺組織勻漿，將肺組織勻漿0.3 mL置于試管內，參照文獻[7]，用紫外分光光度法檢測PGE2，以吸光度(A)值表示PGE2。取肺組織勻漿0.3 mL及血清0.3 mL，參照文獻[8]，用鹽酸滴定法測定肺組織和血清中PLA2的活性，以在37 ℃每分鐘每毫升樣本反應消耗1 nmol/L鹽酸為1個PLA2活性單位(U)。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 白藜蘆醇對哮喘小鼠全身癥狀的影響

空白組小鼠行為活動正常；模型組小鼠在卵蛋白霧化激發(fā)過程中出現呼吸加深快、點頭呼吸、面部瘙癢撓鼻、前肢縮抬、站立不穩(wěn)等急性哮喘發(fā)作表現；藥物組及陽性對照組小鼠的急性哮喘癥狀明顯改善。

2.2 白藜蘆醇對哮喘小鼠BALF中白細胞總數和嗜酸粒細胞(EOS)計數的影響

結果見表1。模型組BALF中白細胞總數及EOS計數均高于空白組，與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；白藜蘆醇高、低劑量組明顯減少哮喘小鼠BALF中白細胞總數及EOS計數，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。

表1 白藜蘆醇對哮喘小鼠BALF中白細胞總數和EOS計數的影響

組別劑量/(mg·kg-1)白細胞總數/(×107·L-1)EOS/(×107·L-1)空白組-58.06±23.40107.78±4.42模型組-182.50±57.03☆☆115.38±4.61☆白藜蘆醇 低劑量2595.42±50.30**109.79±6.65* 高劑量5082.36±53.27**106.01±3.761*地塞米松組5100.14±34.61**105.70±2.65*

與空白組比較：☆P<0.05，☆☆P<0.01； 與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

2.3 白藜蘆醇對哮喘小鼠肺組織中PGE2含量的影響

結果見表2。模型組肺組織中PGE2含量升高，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；白藜蘆醇高、低劑量組均可降低肺組織中PGE2含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 白藜蘆醇對哮喘小鼠肺組織中PGE2含量的影響

組別劑量/(mg·kg-1)A空白組-0.12±0.01模型組-0.16±0.01☆白藜蘆醇低劑量組250.15±0.01*高劑量組500.14±0.01*地塞米松組50.13±0.01*

與空白組比較：☆P<0.05； 與模型組比較：*P<0.05。

2.4 白藜蘆醇對肺組織和血清中PLA2的影響

結果見表3。模型組肺組織及血清中PLA2活性均升高，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；白藜蘆醇高、低劑量組均可降低哮喘小鼠肺組織及血清中PLA2活性，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 白藜蘆醇對哮喘小鼠肺組織和血清中PLA2活性的影響

組別劑量/(mg·kg-1)肺組織PLA2/U血清PLA2/U空白組-0.47±0.390.53±0.33模型組-1.85±0.41☆2.18±0.54☆白藜蘆醇 高劑量組250.75±0.50*0.59±0.25* 低劑量組500.39±0.23*0.48±0.15*地塞米松組50.69±0.47*0.53±0.23*

與空白組比較：☆P<0.05； 與模型組比較：*P<0.05。

3 討論

白藜蘆醇是一種天然的具有多酚結構的植物抗毒素，主要存在于葡萄皮和子、花生、桑葚和虎杖等植物中，具有廣泛的藥理作用。本研究重點觀察白藜蘆醇對哮喘小鼠PLA2及相關介質與炎性細胞的影響。

支氣管哮喘是以嗜酸性細胞為主的多種炎性細胞及相關介質共同作用于氣道，而誘發(fā)的慢性炎性反應[9]。PLA2是一種作用十分復雜的炎癥因子和啟動脂介質合成的關鍵酶，在支氣管哮喘發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用：①介導炎性細胞(嗜酸性粒細胞、肥大細胞及中性粒細胞等)在氣道內的聚集；②催化水解細胞膜磷脂產生花生四烯酸，促使二十烷類炎性介質(白三烯及前列腺素類物質)的釋放；③降解肺泡表面活性物質，使肺順應性下降，氣道阻力增加；④誘導氣道高反應性[1]。本實驗結果顯示哮喘模型小鼠BALF中白細胞總數、EOS計數、PGE2含量和PLA2活性均顯著高于空白組，顯示了PLA2與炎性細胞聚集及炎性介質釋放的相關性。本實驗觀察白藜蘆醇對哮喘小鼠氣道炎癥的影響，并以地塞米松為陽性對照，結果顯示伴隨PLA2活性的降低，BALF液中白細胞總數及EOS計數這些炎性細胞亦呈降低趨勢，PGE2水平下降，同時小鼠哮喘急性癥狀明顯改善。以上結果提示，白藜蘆醇可降低炎性細胞在氣道內的聚集，減少炎性介質的釋放，實現抗炎平喘，其作用機制可能與抑制PLA2有關。

[1] 劉春麗．磷脂酶A2與支氣管哮喘[J]．國外醫(yī)學：呼吸系統(tǒng)分冊，2001，21(2)：76-78.

[2] 包海榮，劉繼新，劉曉菊．白藜蘆醇抗肺部疾病作用的研究進展[J]．國際呼吸雜志，2007，27(9):681-684.

[3] 何冰，陳小夏，王經韻．白藜蘆醇對兔離體氣管平滑肌收縮功能的影響[J]．中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2010，16(6)：522-523.

[4] 何冰，王經韻，鄭宇翔，等．白藜蘆醇抗喘活性及機制研究[J]．廣東藥學院學報，2012，28(4)：423-426.

[5] 羅夏炯,汪玉倩,盧佩莉,等．白藜蘆醇對小鼠哮喘模型及炎癥介質的影響[J]．廣東藥學院學報，2013,29(6)：640-642.

[6] 田代印，符州，張燕，等．一種改良型小鼠哮喘模型方法的建立及評價[J]．重慶醫(yī)科大學學報，2005，30(4)：601-604.

[7] 曾南，楊旋，周禎昊，等．荊芥揮發(fā)油對哮喘模型小鼠肺組織炎癥介質的影響[J]．四川生理科學雜志，2006，28(4)：154-156.

[8] 陳思鋒，吳中立．體液和組織磷脂酶A2簡便快速測定法[J]．第二軍醫(yī)大學學報，1998，10(3)：254-257.

[9] 中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組．支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療及教育和管理方案)[J]．中華內科雜志，2003，42(11)：817-822．

(責任編輯：幸建華)

Effect of resveratrol on the PLA2activity and airway inflammation in asthmatic mice

WANG Jingyun1,QIU Xinming2,LUO Xiajiong2,CHEN Xiaoxia2,HE Bing2

(1.GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China; 2.CollegeofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Objective To investigate the effect of resveratrol on the PLA2activity and airway inflammation in asthmatic mice. Methods The asthmatic model was induced by ovalbumin provocation in mice. The number of total leukocytes and eosinophils (EOS) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was counted. The PGE2content in lung tissue was measured by ultraviolet spectrophotometry. The PLA2activities of lung tissue and serum were assayed by the hydrochloric acid titration method. Results The inflammatory cells in BALF,the PGE2content and the PLA2activity in resveratrol-treated group were significantly lower than that of the model group. Conclusion Resveratrol displays a protective effect in asthmatic mice,which may be related to reduction of the inflammatory cell infiltration,the PGE2content and the PLA2activity.

resveratrol; bronchial asthma; inflammatory cell; PGE2; PLA2

2016-06-16

廣東省科學技術廳省中醫(yī)藥科學院聯合科研專項項目(粵科社字[2013]102號)

王經韻(1988—),女,藥師,主要從事臨床藥物實驗，Email:dolly_sheep8897@163.com；通信作者:何冰(1959—),女,教授,主要從事心血管藥理、藥物篩選及新藥研究，Email:wahah5566@163.com。

R285.5

A

1006-8783(2016)05-0606-03

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016061601