清熱疏肝顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

孫冬梅，陳秋谷，李養(yǎng)學(xué)，李素梅

(1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405；3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095)

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清熱疏肝顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

孫冬梅1，2，3，陳秋谷2，李養(yǎng)學(xué)1，3，李素梅1，3

(1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405；3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095)

目的 建立清熱疏肝顆粒的質(zhì)量控制方法。方法 采用薄層色譜(TLC)法對(duì)清熱疏肝顆粒中的黃芩、柴胡、連翹、魚腥草進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定方中黃芩苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果 薄層色譜(TLC)法所得斑點(diǎn)清晰、分離效果好，且陰性對(duì)照無干擾；黃芩苷在0.114～0.684 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，r=0.999 9 ，平均回收率為97.33%，RSD=0.87%(n=3) 。結(jié)論 所建立的方法簡(jiǎn)便精確、重復(fù)性良好、專屬性強(qiáng)，可用于清熱疏肝顆粒的鑒別、質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制。

清熱疏肝顆粒； 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； TLC法； HPLC法； 黃芩苷

清熱疏肝顆粒是廣東省第二中醫(yī)院的中藥成方制劑，由黃芩、連翹、柴胡、魚腥草、板藍(lán)根、薄荷、生姜、金銀花、甘草9味中藥組成，具有清熱解毒、疏肝散結(jié)的功效，臨床上主要用于治療感冒發(fā)熱、肺熱咳嗽等癥。該方為中醫(yī)臨床經(jīng)典驗(yàn)方，其療效顯著，被廣大患者所接受。為了更好地控制其質(zhì)量、保證臨床療效，本研究采用薄層色譜法對(duì)方中黃芩、柴胡、連翹、魚腥草進(jìn)行了定性鑒別，并采用高效液相色譜法對(duì)方中君藥黃芩的有效成分黃芩苷進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定，所建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定且無干擾，可作為清熱疏肝顆粒的質(zhì)量控制方法[1]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CAMAG TLC Visualizer薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG公司)；Camag automatic tlc sampler4全自動(dòng)點(diǎn)樣儀(瑞士CAMAG公司)；Mettler xs205du電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；ELECTRONIC BALANLE電子天平(上海上天精密儀器有限公司)；Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；ZF-6050真空干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；939型薄層制板器(重慶市兩岸貝爾德儀器技術(shù)廠)；Milli-Q Advantagc A10超純水系統(tǒng)(美國默克密理博公司)；KQ-700DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；HWS-26電熱恒溫水浴鍋(上海金壇市科析儀器有限公司)；DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)：110715-200212)、黃芩藥材(批號(hào)：120995-201309)、柴胡藥材(批號(hào)：120992-201108)、連翹藥材(批號(hào)：120908-201216)、魚腥草藥材(批號(hào)：121046-201105)均購自中國食品藥品檢定研究院；清熱疏肝顆粒(批號(hào)：20150404、20150405、20150406)由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供。

甲醇、H3PO4為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜的鑒別

2.1.1 黃芩的薄層鑒別[2]取清熱疏肝顆粒1.0 g，研細(xì)，加乙酸乙酯-甲醇(體積比3∶1)20 mL，超聲處理(功率700 W，頻率100 kHz)30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芩對(duì)照藥材0.25 g，加乙酸乙酯-甲醇(體積比3∶1)20 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取按處方比例制備缺黃芩的陰性對(duì)照樣品 1.0 g，同法制得缺黃芩的陰性對(duì)照溶液。按照薄層色譜法(2015年版《中國藥典》四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(體積比10∶3∶1∶2)為展開劑，預(yù)飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以5%(質(zhì)量濃度)三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾，結(jié)果見圖1。

1 2 3 4 5

1.黃芩對(duì)照藥材溶液； 2～4.供試品溶液； 5.缺黃芩陰性對(duì)照溶液。

圖1 黃芩鑒別的TLC色譜圖
Figure 1 TLC chromatogram of Radix Scutellariae

2.1.2 柴胡的薄層鑒別[3]取清熱疏肝顆粒2.0 g，研細(xì)，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解。用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，分別用水和氨試液洗滌2次，棄去水液和氨試液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取柴胡對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取按處方比例制備的缺柴胡陰性對(duì)照樣品2.0 g，同法制得缺柴胡的陰性對(duì)照溶液。按照薄層色譜法(2015年版《中國藥典》四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-乙酸乙酯-氨試液(體積比4∶1∶5)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%(質(zhì)量濃度)對(duì)二甲氨基苯甲醛的40%(體積分?jǐn)?shù))硫酸溶液，60 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，有相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性無干擾，結(jié)果見圖2。

1 2 3 4 5

1.柴胡對(duì)照藥材溶液； 2～4.供試品溶液； 5.缺柴胡陰性對(duì)照溶液。

圖2 柴胡鑒別的TLC色譜圖
Figure 2 TLC chromatogram of Radix Bupleuri

2.1.3 連翹的薄層鑒別[4]取清熱疏肝顆粒2.0 g，研細(xì)，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用稀HCl調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙醚振搖提取3次，每次20 mL，棄去乙醚液，再用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取連翹對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取按處方比例制備的連翹陰性對(duì)照樣品2 g，同法制得缺連翹陰性對(duì)照溶液。按照薄層色譜法(2015年版《中國藥典》四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮(體積比6∶4)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%(質(zhì)量濃度)對(duì)二甲氨基苯甲醛的40%(體積分?jǐn)?shù))硫酸溶液，60 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，有相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性無干擾，結(jié)果見圖3。

1 2 3 4 5

1.連翹對(duì)照藥材溶液； 2～4.供試品溶液； 5.缺連翹陰性對(duì)照溶液。

圖3 連翹鑒別的TLC色譜圖
Figure 3 TLC chromatogram of Fructus Forsythiae

2.1.4 魚腥草的薄層鑒別[5]取清熱疏肝顆粒2.0 g，研細(xì)，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加氨試液調(diào)pH至11～12，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取魚腥草對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取按處方比例制備的缺魚腥草陰性對(duì)照樣品2.0 g，同法制得缺魚腥草的陰性對(duì)照溶液。按照薄層色譜法(2015年版《中國藥典》四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸-水(體積比20∶10∶10∶1)的上層液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，有相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性無干擾，結(jié)果見圖4。

1 2 3 4 5

1.魚腥草對(duì)照藥材溶液； 2～4.供試品溶液； 5.缺魚腥草陰性對(duì)照溶液。

圖4 魚腥草鑒別的TLC色譜圖
Figure 4 TLC chromatogram of Herba Houttuyniae

2.2 黃芩苷的測(cè)定[6-11]

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取在60 ℃減壓干燥4 h的黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含黃芩苷114 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取清熱疏肝顆粒粉末0.2 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加入70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇適量，超聲處理(功率700 W，頻率100 kHz)30 min，取出，放冷，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺黃芩的陰性對(duì)照樣品約0.2 g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 色譜條件 色譜柱：Aglient ZOKBAX SB-C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.2%(體積分?jǐn)?shù))H3PO4(體積比47∶53)；流速：1 mL/min； 柱溫：25 ℃； 檢測(cè)波長：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取黃芩苷對(duì)照品、供試品、缺黃芩陰性對(duì)照溶液10 μL，分別按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，供試品溶液在與黃芩苷對(duì)照品溶液相應(yīng)保留時(shí)間處有相同的色譜峰對(duì)應(yīng)，缺黃芩陰性對(duì)照溶液無干擾，結(jié)果見圖5。

2.2.6 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度114 μg/mL)1、2、3、4、5、6 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為11.4、22.8、34.2、45.6、57.0、68.4 μg/mL的對(duì)照品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=3.034 6×103X-0.694 4，r=0.999 9(n=6)。結(jié)果表明黃芩苷在0.114～0.684 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

40302010040302010040302010005101520253011ABCt/minmAUmAUmAU

1.黃芩苷。A.黃芩苷對(duì)照品溶液； B.供試品溶液； C.缺黃芩陰性對(duì)照溶液。

圖5 清熱疏肝顆粒的HPLC 色譜圖
Figure 5 HPLC of Qingre Shugan granules

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)：20150404)10 μL，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定黃芩苷峰面積。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為0.16%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)：20150404)10 μL，分別于制備0、2、4、8、10、12 h進(jìn)樣，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD值為0.22%(n=7)，表明供試品溶液在 12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批清熱疏肝顆粒(批號(hào)：20150404) 6 份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果黃芩苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 21.465 5 mg/g，RSD值為0.51%，表明方法重復(fù)性好。

2.2.10 加樣回收率測(cè)定 精密稱取9份已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)(21.465 5 mg/g)的清熱疏肝顆粒(批號(hào)： 20150404)0.1 g，置100 mL容量瓶中，分別精密加入黃芩苷對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度2.28 mg/mL)0.8、1.0、1.2 mL，各3份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見表 1。

表1 清熱疏肝顆粒中黃芩苷的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

Table 1 Recovery results of baicalin in Qingre Shugan granules (n=3)

編號(hào)樣品量/g樣品中的量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%10.10202.18951.8243.95596.7920.10232.19591.8243.96496.9330.10212.19161.8243.94095.8540.10232.19592.2804.40997.0650.10152.17872.2804.39897.3460.10202.18952.2804.39196.5670.10342.21952.7364.91798.5980.10312.21312.7364.90598.3990.10292.20882.7364.90298.44平均回收率=97.33%;RSD=0.87%

2.2.11 樣品的測(cè)定 分別稱取3批清熱疏肝顆粒(批號(hào)：20150404、20150405、20150406)約0.2 g，精密稱定，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行操作2份。分別按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定黃芩苷的峰面積，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果3批清熱疏肝顆粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值分別為21.493 4、22.068 4、21.897 4 mg/g。

3 討論

方中黃芩、柴胡、連翹、魚腥草所采用的薄層色譜條件均在2015年版《中國藥典》一部各項(xiàng)藥材鑒別基礎(chǔ)上作出調(diào)整，調(diào)整后的方法分離效果較好、比移值適中，且陰性對(duì)照無干擾。

本文曾參考2015年版《中國藥典》一部柴胡藥材鑒別項(xiàng)下收載的薄層方法對(duì)處方中的柴胡進(jìn)行TLC鑒別，結(jié)果顯示供試品溶液色譜中，與柴胡對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上有相同顏色的斑點(diǎn)，但供試品斑點(diǎn)拖尾嚴(yán)重、分離效果差且陰性對(duì)照有干擾。故將甲醇提取液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，合并正丁醇液，再分別用水和氨試液洗滌2次，將乙酸乙酯-乙醇-水(體積比8∶2∶1)展開劑改換為正丁醇-乙酸乙酯-氨試液(體積比4∶1∶5)的上層溶液。結(jié)果表明供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，有相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。

本文曾參考2015年版《中國藥典》一部黃芩藥材鑒別項(xiàng)下的薄層方法鑒別處方中的黃芩，發(fā)現(xiàn)黃芩在紫外光燈(365 nm)下，暗色斑點(diǎn)不易觀看，故噴以5%(質(zhì)量濃度)三氯化鐵乙醇溶液進(jìn)行顯色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)日光檢視結(jié)果較紫外光燈下檢視更為明顯，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，各斑點(diǎn)分布均勻、清晰，且陰性對(duì)照無干擾。

試驗(yàn)過程中還對(duì)魚腥草鑒別進(jìn)行了硅膠G板與1%NaOH溶液制備的硅膠G板的比較，結(jié)果顯示：在1%NaOH溶液制備的硅膠G板條件下，對(duì)照藥材的斑點(diǎn)稍有拖尾，斑點(diǎn)分離效果較差；而在硅膠G板條件下展開，供試品溶液與對(duì)照藥材溶液的斑點(diǎn)均清晰，陰性無干擾。

處方中黃芩為君藥，其黃芩苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，且其藥理作用與本方的療效具有顯著相關(guān)性，故選擇黃芩苷作為定量測(cè)定的指標(biāo)。本試驗(yàn)曾參照2015年版《中國藥典》與相關(guān)文獻(xiàn)[6-11]，對(duì)比了甲醇-0.2%H3PO4系統(tǒng)不同比例流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果顯示，當(dāng)甲醇、0.2% H3PO4體積比為 47∶53 時(shí)，目標(biāo)峰分離度理想；且通過方法學(xué)驗(yàn)證表明，本方法準(zhǔn)確、可靠，重復(fù)性好，可作為清熱疏肝顆粒中黃芩苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法。

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(責(zé)任編輯：劉曉涵)

Study on quality standard of Qingre Shugan granules

SUN Dongmei1,2,3,CHEN Qiugu2,LI Yangxue1,3,LI Sumei1,3

(1.GuangdongProvincicalInstitubeofTCM,Guangzhou510095,China; 2.GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China; 3.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentinTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510095)

Objective To establish the quality standard of Qingre Shugan granules．Methods Thin layer chromatography (TLC) was used to identify Radix Scutellariae,Radix Bupleuri,Fructus Forsythiae and Herba Houttuyniae. Baicalin was determined by high performance liquid chromatography (HPLC)． Results The TLC spots of Radix Scutellariae,Radix Bupleuri,Fructus Forsythiae and Herba Houttuyniae were clear with good resolution and free of interference of negative samples．It showed a good linearity for baicalin in the range of 0.114-0.684 μg (r=0.999 9). The average recovery was 97.33%(RSD=0.87%)．Conclusion The method is simple,rapid,reproducible,and could be used for the quality control of Qingre Shugan granules．

Qingre Shugan granules; quality standard; TLC; HPLC; baicalin

2016-06-04

廣東省醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑研發(fā)技術(shù)平臺(tái)建設(shè)(2013B040200040)

孫冬梅(1969—)，主任中藥師，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥新藥研發(fā)及中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，Email：564290061@qq.com。

時(shí)間：2016-09-30 15:02

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.1502.007.html

R284.1

A

1006-8783(2016)05-0601-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016060403