不同廠家口炎清產(chǎn)品中綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的含量比較

姚小華，匡艷輝，張一凡，張曉燕

(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東 廣州 510515)

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不同廠家口炎清產(chǎn)品中綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的含量比較

姚小華，匡艷輝，張一凡，張曉燕

(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東 廣州 510515)

目的 研究不同廠家口炎清的質(zhì)量情況，為提高藥品標準、正確評價藥品質(zhì)量提供理論依據(jù)。方法 采用高效液相色譜(HPLC)法對4個廠家生產(chǎn)的10批口炎清中的主要成分綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的質(zhì)量分數(shù)進行測定，色譜柱為Waters XBridgeTMC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min；流動相為乙腈-0.4%(體積分數(shù))醋酸(梯度洗脫)，綠原酸采用二極管陣列檢測器(PDAD)檢測，檢測波長為330 nm，灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測，檢測條件：霧化室溫度60 ℃，漂移管溫度65 ℃，N2的載氣流量1.6 L/min，進樣量8 μL。結(jié)果 不同廠家口炎清產(chǎn)品中綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙質(zhì)量分數(shù)差別較大。口炎清顆粒劑的質(zhì)量相比膠囊劑和片劑較好；口炎清膠囊中不但灰氈毛忍冬皂苷乙質(zhì)量分數(shù)非常低，而且檢測不到川續(xù)斷皂苷乙；口炎清片樣品中灰氈毛忍冬皂苷乙的質(zhì)量分數(shù)卻異常高。結(jié)論 不同廠家的口炎清產(chǎn)品由于原材料質(zhì)量、制劑工藝等不同，導(dǎo)致了產(chǎn)品中有效成分的質(zhì)量分數(shù)存在較大差異。

口炎清； HPLC法； 綠原酸； 灰氈毛忍冬皂苷乙； 川續(xù)斷皂苷乙

口炎清顆粒是由山銀花、天冬、麥冬、玄參、甘草5味中藥組成的復(fù)方制劑，具有滋陰清熱、解毒消腫之功效，用于陰虛火旺所致的口腔炎癥，現(xiàn)行2015年版《中國藥典》一部收載的口炎清顆粒標準中只對單一成分綠原酸含量進行了測定[1]，其他藥效成分未予控制，難以全面反映藥品質(zhì)量?？谘浊逄幏街械木帪樯姐y花，是抗菌消炎的主要藥味，天冬、麥冬、玄參、甘草輔佐可增強山銀花抗炎活性等藥效[2-4]。山銀花主要含有揮發(fā)油、黃酮、有機酸和三萜類成分[2]，有文獻報道采用HPLC-UV、HPLC-ELSD法等對山銀花中的有效成分進行檢測[5-6]，卻鮮見對不同廠家口炎清產(chǎn)品中多種有效成分開展的對比研究?；覛置潭碥找液痛ɡm(xù)斷皂苷乙是山銀花藥材的特有成分，金銀花藥材中幾乎不含灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙，2015年版《中國藥典》一部收載的山銀花藥材標準的質(zhì)量分數(shù)測定項下是以綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙作為指標成分進行質(zhì)量控制[7]，[1]30-31。本文擬采用高效液相色譜(HPLC)法測定口炎清產(chǎn)品山銀花中的綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的質(zhì)量分數(shù)，對比分析不同廠家口炎清產(chǎn)品的質(zhì)量差異，探討產(chǎn)生質(zhì)量差異的原因，為提升其質(zhì)量控制水平提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；BT214D電子分析天平(瑞士沙多利斯Sartorius公司)；CP225D電子分析天平(瑞士沙多利斯Sartorius公司)；SB25-12DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

綠原酸對照品(批號為110753-201314，質(zhì)量分數(shù)以96.6%計)，灰氈毛忍冬皂苷乙對照品(批號為111814-201303，質(zhì)量分數(shù)以92.8%計)和川續(xù)斷皂苷乙對照品(批號為111813-201202，質(zhì)量分數(shù)以93.4%計)均購自中國食品藥品檢定研究院。9批口炎清產(chǎn)品分別來自于廣東、陜西、四川、浙江4個省的4個廠家，批號分別為L4A007、F4A010、K4A002、A5A010、A5A001、A5A002、140904、20130804、14111301，分別簡寫為A1、A2、A3(顆粒劑)，B1、B2、B3(顆粒劑)，C1(顆粒劑)，D1(膠囊劑)，E1(片劑)。

乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridgeTMC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.4%(體積分數(shù)，下同)醋酸(B)梯度洗脫，洗脫程序：0～10 min，8%A→15%A；10～12 min，15%A→29%A；12～18 min，29%A→33%A；18～25 min，33%A→40%A；流速：1 mL/min，綠原酸采用二極管陣列檢測器(PDAD)，檢測波長：330 nm，灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙采用ELSD檢測，檢測條件：蒸發(fā)溫度60 ℃，漂移管溫度65 ℃，N2氣體積流量1.6 L/min，柱溫30 ℃。進樣量：8 μL。分別精密吸取混合對照品、供試品(批號：L4A007)、缺山銀花陰性對照溶液8 μL注入高效液相色譜儀，分別按上述條件測定，見圖1。

mAu6004002000110008006004002000mAu32A1A20510152025B1B2C1C24003002001000600400200010152025t/min05400300200100012001000800600400200010152025t/min05t/min231

1.綠原酸； 2.灰氈毛忍冬皂苷乙； 3.川續(xù)斷皂苷乙。

A.混合對照品溶液(1為DAD檢測，2為ELSD檢測，下同)； B.供試品溶液； C.缺山銀花的陰性對照溶液。

圖1 口炎清測定的HPLC圖
Figure 1 HPLC chromatograms of determinations of Kouyanqing products

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸對照品4.37 mg、灰氈毛忍冬皂苷乙對照品6.49 mg置①號25 mL容量瓶中，用少量50%(體積分數(shù)，下同)甲醇溶解得對照品溶液1；另精密稱取川續(xù)斷皂苷乙對照品9.18 mg，置②號25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液2。精密吸取5 mL對照品溶液2，置①號25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即制成每1 mL含綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙分別為174.8、259.6、73.44 μg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取口炎清產(chǎn)品適量，研細，取約5.0 g(樣品A)，或約1.5 g(樣品B～E)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率37 Hz)30 min，放冷。再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 缺山銀花的陰性對照溶液 取天冬、麥冬、玄參、甘草4味藥材,按2015年版《中國藥典》一部“口炎清顆?！表椣碌闹品ㄖ瞥申幮詫φ疹w粒。取陰性對照顆粒適量，研細，取約5.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按“2.2.2”項下方法操作，即得。

2.3 線性關(guān)系的考察

分別精密吸取混合對照品溶液2、4、6、8、10、20 μL進樣，按“2.1”項下條件分別測定綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的峰面積，其中綠原酸以峰面積(Y)對綠原酸對照品的進樣量(X)進行線性回歸，而灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙則分別以峰面積(Y)的ln對數(shù)對相應(yīng)的對照品進樣量(X)的ln對數(shù)進行線性回歸，得3種成分的線性方程見表1。2.4 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液8 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)測定6次，測得綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙峰面積的RSD值分別為1.57%、1.47%、2.19%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗

取同一批(批號：A1)口炎清產(chǎn)品約5.0 g，共6份，精密稱定。分別按“2.2.2”項下方法制得6份供試品溶液，分別進樣8 μL，按“2.1”項下色譜條件測定并計算3種成分的質(zhì)量分數(shù)。結(jié)果綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙質(zhì)量分數(shù)的RSD值分別為1.86%、1.28%、2.26%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一批口炎清產(chǎn)品(批號：A1)供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣8 μL，分別按“2.1”項下色譜條件測得其綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙峰面積的RSD值分別為0.83%、1.25%、1.94%(n=8)，表明樣品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗

稱取已知質(zhì)量分數(shù)的口炎清產(chǎn)品(A1)約2.5 g，共6份，精密稱定。分別精密加入綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙對照品溶液(三者質(zhì)量濃度分別為3.35、5.83、0.78 mg/mL)各1 mL。分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取8 μL，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算回收率。結(jié)果綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的平均回收率分別為100.7%、101.0%、99.6%；RSD分別為1.59%、1.03%、1.34%(n=6)。見表2。

2.8 樣品的測定

顆粒劑A1～A3一次服用量是2袋，每袋10 g；顆粒劑B1～B3一次服用量是2袋，每袋3 g；顆粒劑C1一次服用量是2袋，每袋10 g；膠囊劑D1一次服用量是4粒，每粒0.5 g；片劑E1一次服用量是6片，每片0.36 g。分別取4個不同廠家生產(chǎn)的10 批口炎清適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件測定各成分質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表3。

表1 綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的線性方程Table 1 The linear regression equations of chlorogenic aicd,macranthoidin B and dipsacoside B (n=6)

表2 口炎清中3種成分的加樣回收率試驗結(jié)果Table 2 Recovery results of 3 components in Kouyanqing products(n=6)

表3 不同廠家口炎清產(chǎn)品中3種成分的質(zhì)量分數(shù)

由表3可知，不同廠家生產(chǎn)的口炎清產(chǎn)品質(zhì)量差異很明顯，顆粒劑(A1、A2、A3、B1、B2、B3)的質(zhì)量相比膠囊劑(D1)和片劑(E1)更好。D1樣品中不但灰氈毛忍冬皂苷乙質(zhì)量分數(shù)非常低，而且檢測不到川續(xù)斷皂苷乙；E1樣品中灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的質(zhì)量分數(shù)卻異常高。

3 討論

口炎清產(chǎn)品主要含有有機酸、皂苷和黃酮等有效成分，而2015年版《中國藥典》一部中口炎清顆粒質(zhì)量控制的目標成分只有綠原酸，這為產(chǎn)品的質(zhì)量埋下很大隱患。本文采用高效液相色譜-紫外與蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用的方法同時測定口炎清產(chǎn)品中的綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的質(zhì)量分數(shù)，方法準確穩(wěn)定[8-10]。灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的最大紫外吸收是末端吸收，當(dāng)采用紫外檢測器檢測時，這2種皂苷的質(zhì)量分數(shù)誤差較大；而綠原酸在330 nm有最大吸收，所以分別采用PDAD、ELSD檢測綠原酸、皂苷的質(zhì)量分數(shù)，使目標成分的檢測誤差最小化[11-14]。由于ELSD中的蒸發(fā)溫度(流動相在漂移管中蒸發(fā)的溫度)、霧化溫度和N2的載氣流速直接影響皂苷的質(zhì)量分數(shù)[15-16]，所以本文通過實驗比較確定這3個參數(shù)的設(shè)置，最后選擇蒸發(fā)溫度為65 ℃,霧化溫度為60 ℃,N2流速為1.6 L/min。

本試驗收集的口炎清產(chǎn)品包括有顆粒劑、片劑和膠囊劑，以綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的質(zhì)量分數(shù)為指標進行比較，發(fā)現(xiàn)不同口炎清產(chǎn)品中綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙質(zhì)量分數(shù)的差異較大，有效成分的差異化必然會影響用藥療效[17]。

綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙都來源于山銀花藥材，而口炎清的組方配伍經(jīng)過多年的臨床驗證和科學(xué)證明，并非是山銀花藥材的投入量越大，口炎清的藥效就越好。某種成分的質(zhì)量分數(shù)高低無法表征中藥藥效，發(fā)揮中藥藥效的應(yīng)該是有效成分之間的協(xié)同作用。當(dāng)處方中的各藥材都在最佳的配比范圍時，藥效的協(xié)同作用才能最優(yōu)化。鄭艷芳等[4]采用均勻設(shè)計方法構(gòu)建口炎清顆粒具有不同藥材投料比例的差異樣品，通過藥效學(xué)研究獲得差異樣品的抗感染活性數(shù)據(jù)，運用灰色關(guān)聯(lián)分析方法研究口炎清顆粒差異樣品藥材質(zhì)量分數(shù)與藥效間的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)口炎清顆粒原配方比例的樣品藥效作用最強。王慧玉[18]在文中指出顆粒劑較膠囊劑和片劑吸收更快，只有藥物被吸收之后才能發(fā)揮藥效，故藥物吸收的效果直接關(guān)系到藥效。

筆者認為不同廠家生產(chǎn)的口炎清產(chǎn)品中有效成分質(zhì)量分數(shù)差異較大的原因：一是不同廠家采購的中藥材原料因采收季節(jié)、產(chǎn)地、土壤、氣候等因素而導(dǎo)致質(zhì)量差異較大；二是不同劑型的口炎清產(chǎn)品制劑工藝的區(qū)別、不同的生產(chǎn)設(shè)備型號和設(shè)備使用年限的差異也會直接影響制劑中有效成分的質(zhì)量分數(shù)。因此，只有嚴格把控中藥材原料質(zhì)量，采用合理的生產(chǎn)工藝、淘汰陳舊的生產(chǎn)設(shè)備，實現(xiàn)生產(chǎn)在線質(zhì)量控制，建立完善的現(xiàn)代化生產(chǎn)流水線，才是保證口炎清產(chǎn)品良好質(zhì)量的關(guān)鍵。

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(責(zé)任編輯：劉曉涵)

Determinations of chlorogenic aicd,macranthoidin B and dipsacoside B in Kouyanqing products from different manufactures

YAO Xiaohua，KUANG Yanhui，ZHANG Yifan，ZHANG Xiaoyan

(HutchisonWhampoaGuangzhouBaiyunshanChineseMedicineCo.,Ltd.,Guangzhou510515,China)

Objective To improve the drug standard and provide a theoretical basis for the quality evaluation of Kouyanqing products from different manufactures. Methods The contents of chlorogenic acid,macranthoidin B and dipsacoside B in 10 batches of Kouyanqing products from 4 manufactures were determined by HPLC. The determination was performed on Waters XBridgeTM-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)with column temperature set at 30 ℃ and the flow rate was 1 mL/min. The mobile phase was composed of acetonitrile and 0.4% acetum (gradient elution). The chlorogenic acid was detected by diode array detector (PDAD),and the UV detection wavelength was 330 nm. The atomization chamber temperature was set at 60 ℃ and the drift tube temperature of ELSD was set at 65 ℃,with the nitrogen flow rate of 1.6 L/min for macranthoidin B and dipsacoside B. The injection volume was 8 μL. Results Significant difference was observed in contents of chlorogenic aicd,macranthoidin B and dipsacoside in Kouyanqing products from different manufactures. Conclusion The quality of the Kouyanqing products varied greatly among different manufactures,which may result from different raw materials and preparation process.

Kouyanqing; HPLC; chlorogenic aicd; macranthoidin B; dipsacoside B

2016-06-13

姚小華(1983—)，女，碩士，工程師，主要從事中藥質(zhì)量標準研究，電話：020-66282450，Email：yaoxiaohua@813zy.com。

時間：2016-09-30 15:05

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.1505.008.html

R284.1

A

1006-8783(2016)05-0596-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016061301