高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定抗骨增生膠囊中的毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷

朱燕，黃義純，嚴(yán)曉明

(韶關(guān)市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 韶關(guān) 512028)

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藥物分析

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定抗骨增生膠囊中的毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷

朱燕，黃義純，嚴(yán)曉明

(韶關(guān)市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 韶關(guān) 512028)

目的 建立同時(shí)測(cè)定抗骨增生膠囊中毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷3種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高效液相色譜法。方法 采用依利特Hypersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以水(A)、甲醇(B)、乙腈(C)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，柱溫為30 ℃。結(jié)果 毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷測(cè)定的線性范圍分別為5.02～100.4、7.38～147.6 和5.20～104.0 μg/mL，r值均大于0.999，平均加樣回收率分別為100.7%、100.4%和99.3%，RSD值均小于2.0%(n=6)。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，可有效地控制抗骨增生膠囊的質(zhì)量。

高效液相色譜； 抗骨增生膠囊； 毛蕊花糖苷； 柚皮苷； 淫羊藿苷

抗骨增生膠囊為國(guó)家基本醫(yī)療保險(xiǎn)藥品目錄收載品種,是由熟地黃、雞血藤、酒肉蓯蓉、炒萊菔子、狗脊、骨碎補(bǔ)、女貞子(鹽制)、淫羊藿、牛膝9味中藥制成的中藥成方制劑,收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部[1]950，用于增生性脊椎炎(肥大性胸椎炎，肥大性腰椎炎)、頸椎綜合征和骨刺等疾病[2]。熟地黃、淫羊藿、骨碎補(bǔ)均為該復(fù)方制劑的主要藥味，其主要活性成分分別為毛蕊花糖苷(verbascoside)、淫羊藿苷(icariine)等黃酮類(lèi)和柚皮苷(naringin)等二氫黃酮類(lèi)化合物[1]256，124，其藥效與該制劑功能主治相一致?？构窃錾z囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[1] 950僅對(duì)淫羊藿苷進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定，未能全面控制其質(zhì)量，國(guó)內(nèi)亦未見(jiàn)對(duì)抗骨增生膠囊中毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷3種有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)同時(shí)進(jìn)行測(cè)定的報(bào)道及文獻(xiàn)。為了較全面控制抗骨增生膠囊質(zhì)量并簡(jiǎn)化其測(cè)定方法，筆者參考文獻(xiàn)[1] ，[2-4]，以毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷為指標(biāo)性成分，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定它們?cè)诳构窃錾z囊中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以控制方中熟地黃、淫羊藿、骨碎補(bǔ)等主藥的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent1260 高效液相色譜儀(包括VWD 檢測(cè)器LC solution 工作站)，AG-135 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，HT-300BQ 超聲儀(山東濟(jì)寧恒通超聲電子設(shè)備有限公司)，Shimadzu UV-2450 紫外分光光度計(jì)。

毛蕊花糖苷對(duì)照品(批號(hào)111530-201512,質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.7%)、柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)110722-201312,質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.7%)、淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào)110737-201516,質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.2%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，抗骨增生膠囊購(gòu)自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司(0.35 g/丸，批號(hào)：141105、141209、150501)。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為依利特Hypersil ODS2柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為H2O(A)-甲醇(B)-乙腈(C)，按表1程序進(jìn)行梯度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。

表1 抗骨增生膠囊中3種有效成分測(cè)定的梯度洗脫程序

Table 1 Gradient elution program of three active ingredients in Kanggu Zengsheng capsules

t/minφ(流動(dòng)相A)/%φ(流動(dòng)相B)/%φ(流動(dòng)相C)/%08002013800201470525267052528800203780020

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用50%乙醇(體積分?jǐn)?shù)，下同)溶解并定量稀釋制成質(zhì)量濃度分別為0.502、0.738、0.520 mg/mL 的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別精密量取上述3種對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2 mL，置于同一20 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，作為毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷質(zhì)量濃度分別為0.050 2、0.073 8、0.052 0 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取抗骨增生膠囊內(nèi)容物10粒，精密稱(chēng)定，混勻，研細(xì),取約0.7 g，精密稱(chēng)定。置具塞錐形瓶中,精密加入50%乙醇50 mL，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)45 min，放冷，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方量制備缺熟地黃、淫羊藿和骨碎補(bǔ)的樣品，同“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密吸取混合對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果理論塔板數(shù)按毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷計(jì)算均不低于3 500，3種成分色譜峰與相鄰峰之間分離度均大于1.5，對(duì)稱(chēng)因子在0.95～1.05 內(nèi)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。

t/min6040200200150100500806040200mAUmAUmAUABC12332110152025303505

1.毛蕊花糖苷； 2.柚皮苷； 3.淫羊藿苷。

圖1 混合對(duì)照品(A)、供試品(B)和陰性樣品(C)溶液的HPLC色譜圖

Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A),sample(B) and negative sample(C)

2.4 線性關(guān)系的考察

分別精密量取毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 mL，置于同一25 mL容量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(ρ)進(jìn)行線性回歸，得到3種成分的回歸方程、r及線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 抗骨增生膠囊中3種成分的回歸方程、r值及線性范圍

Table 2 Regression equations,rvalues and linear ranges of three constituents in Kanggu Zengsheng capsules

成分回歸方程r線性范圍/(μg·mL-1)毛蕊花糖苷A=8.422ρ+19.231230.99925.02～100.4柚皮苷A=8.317ρ+20.125380.99967.38～147.6淫羊藿苷A=20.971ρ+25.361840.99965.20～104.0

2.5 檢測(cè)限的測(cè)定

將“2.4”項(xiàng)下質(zhì)量濃度最低的對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)婪ㄟM(jìn)行測(cè)定，當(dāng)各成分峰的信噪比為3∶1時(shí)，計(jì)算得毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷的最低檢測(cè)限分別為0.22、0.30、0.13 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一批供試品溶液(批號(hào)：150501)10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并記錄色譜圖。結(jié)果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面積平均值的RSD值(n=6)分別為0.72%、0.77%、0.58%，表明本法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品溶液(批號(hào)：150501)，分別于制備后0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并記錄色譜圖。結(jié)果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面積平均值的RSD值(n=7)分別為0.82%、0.68%、0.79%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

平行取同一批抗骨增生膠囊(批號(hào)：150501) 共6 份，每份0.7 g，精密稱(chēng)定，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并記錄峰面積。結(jié)果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面積的RSD 值分別為1.5%、1.2%和1.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

分別取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)(毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷分別為0.39、0.56、0.51 mg/丸)的抗骨增生膠囊(批號(hào)：150501)約0.7 g，精密稱(chēng)定，共6份，分別精密加入3種對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷的平均加樣回收率分別為100.7%、100.4%、99.3%，RSD值(n=6)分別為1.7%、1.6%、1.3%。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 抗骨增生膠囊中3種有效成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Recovery results of three active ingredients in Kanggu Zengsheng capsules (n=6)

2.10 樣品的測(cè)定

分別取3批抗骨增生膠囊(批號(hào)：141105、141209、150501)，約0.7 g，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行處理3份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按峰面積外標(biāo)法計(jì)算其中3種有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 抗骨增生膠囊中3種有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

由于抗骨增生膠囊中各成分性質(zhì)差異較大，為使3種有效成分達(dá)到良好分離效果，筆者分別以不同比例的乙腈-水、乙腈-0.1%(體積分?jǐn)?shù))醋酸等為流動(dòng)相系統(tǒng)[4-7]對(duì)色譜條件進(jìn)行考察，但分離效果均不甚理想。如以乙腈-水(體積比20∶80)為流動(dòng)相時(shí)，毛蕊花糖苷、柚皮苷出峰好，但淫羊藿苷保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，而且雜質(zhì)分離效果差，峰形較差；經(jīng)過(guò)進(jìn)一步對(duì)比研究，最終選擇甲醇-乙腈-水三相系統(tǒng)為流動(dòng)相梯度洗脫，可消除雜質(zhì)對(duì)被測(cè)成分的干擾，各成分的色譜峰峰形對(duì)稱(chēng)、理論塔板數(shù)高、分離度好，縮短了多成分檢測(cè)的分析時(shí)間。

3.2 波長(zhǎng)的選擇

采用紫外可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷對(duì)照品溶液，以初始比例流動(dòng)相為空白，在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，兼顧多種成分的最大吸收，重點(diǎn)考察334、284、270 nm波長(zhǎng)處的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在270 nm波長(zhǎng)處，3種有效成分均有較強(qiáng)吸收，因此選擇淫羊藿苷的最大吸收波長(zhǎng)270 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，可同時(shí)得到3種成分較好的色譜峰，并能滿足定量測(cè)定的要求。

3.3 樣品前處理方法的確定

筆者分別對(duì)文獻(xiàn)中較常見(jiàn)的冷浸法、回流提取法、超聲法[4-7]這3種提取方法方法進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示：采用冷浸法提取時(shí)，為獲得較好的效果，需不定期振搖，且浸泡時(shí)間長(zhǎng)、提取效率較低；回流提取40 min可基本提取完全，但提取溫度較高，可能對(duì)其活性成分產(chǎn)生較大的影響，活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著溫度的提高均有不同程度的降低[8]；而超聲法可在30 min內(nèi)基本提取完全，且具有提取時(shí)間短、提取溫度低、提取率高等特點(diǎn)，所以選用超聲法提取?？疾炝颂崛r(shí)間分別為15、30、45、60 min時(shí)的超聲提取效果，結(jié)果表明，超聲處理30 min 后各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不再增加，考慮到樣品間的差異性，選擇超聲處理45 min。在提取溶劑方面，分別采用乙醇、50%乙醇、50%甲醇、甲醇作為溶劑對(duì)樣品進(jìn)行提取。結(jié)果表明：50%甲醇和50%乙醇超聲提取完全且雜質(zhì)干擾峰較少，結(jié)果差異不大；但甲醇毒性較乙醇大，結(jié)合經(jīng)濟(jì)實(shí)用的角度考慮，選擇50%乙醇作為提取溶劑。

本文所確定方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確穩(wěn)定，能快速、準(zhǔn)確地對(duì)抗骨增生膠囊中毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷3種成分同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了重要參考。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2015年版一部[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

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(責(zé)任編輯：劉曉涵)

Simultaneous determination of verbascoside,naringin and icariin in Kanggu Zengsheng capsules by HPLC

ZHU Yan,HUANG Yichun,YAN Xiaoming

(ShaoguanInstituteforFoodandDrugControl,Shaoguan512028,China)

Objective To establish an HPLC method for determinations of three constituents(verbascoside,naringin and icariin ) in Kanggu Zengsheng capsules. Methods HPLC gradient elution method was applied. The column was Elite Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm,5 μm). The mobile phase was water(A),methanol(B)and acetonitrile(C) solution. The detection wavelength was set at 270 nm and the column temperature was 30 ℃. Results The linear range was 5.02-100.4 μg/mL for verbascoside,7.38-147.6 μg/mL for naringin and 5.20-104.0 μg/mL for icariin,respectively. All the correlation coefficients were above 0.999. The average recovery was 100.7% for verbascoside,100.4% for naringin,and 99.3% for icariin,respectively,and all RSD values were less than 2.0%(n=6). Conclusion The developed HPLC method could be used for the quality control of Kanggu Zengsheng capsules.

HPLC; Kanggu Zengsheng capsules； verbascoside; naringin；icariin

2016-06-23

朱燕(1983—)，本科，主管藥師，從事藥品質(zhì)量檢驗(yàn)與質(zhì)量控制研究，Email：29711825@qq.com；通信作者：嚴(yán)曉明(1979—)，副主任藥師，從事藥品質(zhì)量檢驗(yàn)與質(zhì)量控制研究，Email：99075234@qq.com。

時(shí)間：2016-09-30 15:09

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.1509.009.html

R284.1

A

1006-8783(2016)05-0589-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016062301