綿馬貫眾3種間苯三酚類化合物及其抑菌活性研究

賈小舟,李細霞,袁麗鵬,尹永芹,楊雄輝,沈志濱

(1.廣東藥科大學 中藥學院,廣東 廣州 510006； 2.肇慶醫(yī)學高等專科學校,廣東 肇慶 526020；3.國藥集團德眾(佛山)藥業(yè)有限公司,廣東 佛山 528000)

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綿馬貫眾3種間苯三酚類化合物及其抑菌活性研究

賈小舟1,李細霞2,袁麗鵬1,尹永芹1,楊雄輝3,沈志濱1

(1.廣東藥科大學 中藥學院,廣東 廣州 510006； 2.肇慶醫(yī)學高等?？茖W校,廣東 肇慶 526020；3.國藥集團德眾(佛山)藥業(yè)有限公司,廣東 佛山 528000)

目的 對綿馬貫眾中3種間苯三酚類成分進行研究,并考察它們對紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、犬小孢子菌3種真菌的抑菌活性。方法 采用硅膠柱色譜法、Sephadex LH-20凝膠柱色譜等色譜手段進行分離純化,并通過波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)對化合物進行鑒定。采用M38-A2微量稀釋法,篩選單體化合物對紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、犬小孢子菌3種真菌的抑菌活性,并測定最小抑菌濃度(MIC)。 結(jié)果 分離得到3個間苯三酚類化合物,分別為白綿馬素AA、三環(huán)黃綿馬酸ABB、黃綿馬酸AB；3個化合物對紅色毛癬菌的MIC分別為160、60、70 μg/mL,對犬小孢子菌的MIC分別為140、90、80 μg/mL,對須癬毛癬菌的MIC值均>160 μg/mL。結(jié)論 3個間苯三酚類化合物對3種真菌均有不同程度的抑制作用,對紅色毛癬菌和犬小孢子菌的活性均優(yōu)于須癬毛癬菌。

綿馬貫眾； 間苯三酚類化合物； 抑菌活性

綿馬貫眾為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨(DryopteriscrassirhizomaNakai)的干燥根莖及葉柄殘基,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,味起初淡而微澀,后漸苦、辛,性微寒,有小毒,具有清熱解毒、殺菌驅(qū)蟲、止血等功效[1]。綿馬貫眾為臨床常用中藥材,具有抗病毒、抗瘧、抗腫瘤、抗癌、驅(qū)蟲、止血、抗細菌等多種藥理活性[2-3]。目前,對綿馬貫眾的研究主要集中在抗細菌感染、抗瘧、抗腫瘤等方向,而對抑制真菌,尤其是對臨床常見皮膚癬菌的抑制作用研究較少。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),間苯三酚類化合物對淺部真菌具有明顯的抑制作用,而且鱗毛蕨屬植物富含間苯三酚類化合物[4],因此本文擬對綿馬貫眾的間苯三酚類化合物進行提取分離,并對間苯三酚類化合物對淺部真菌抑制活性進行研究。

1 儀器與材料

Varian UNITY INOVA 500型超導脈沖傅里葉變換核磁共振儀(美國Varian公司)；ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Zf20D暗箱式紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)；X-5顯微熔點測定儀(河南鞏義市科瑞儀器有限公司)；XYQ-SG46-280S手提式壓力蒸汽滅菌鍋(杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司)；DZF-6053電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海東麓儀器設(shè)備有限公司)；SW-CJ-1F超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)。

層析硅膠(批號：0140015,青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20型凝膠(批號：081209,Pharmacia公司)；羧甲基纖維素鈉(批號：101210,廣東汕頭市西隴化工廠)；堅牢藍BB鹽(上海遠慕生物科技有限公司)；色譜甲醇、乙腈(Ocenpeak)；二甲基亞砜(DMSO,廣州瑞舒生物科技有限公司)；RPMI Medium 1640粉末(批號：1256837,美國GIBICO公司)；巴氏吸管(批號：20160107,NEST Biotechnology Co.Ltd);其余試劑均為分析純。

綿馬貫眾產(chǎn)于東北的黑龍江省,購于廣州采芝林連鎖藥業(yè)(大學城店),經(jīng)廣東藥科大學中藥學院劉基柱副教授鑒定為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨(DryopteriscrassirhizomaNakai)的葉柄殘基和干燥根莖。

供試真菌：紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum,編號：CMCC(F)T1d)；須癬毛癬菌(Trichophytonmentagrophytes,編號：CMCC(F)T5c)；犬小孢子菌(Microsporumcanis,編號：CMCC(F)M3d)；近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis,編號：ATCC 22019)；以上真菌由中國醫(yī)學科學院皮膚研究所(南京)提供。鹽酸特比萘芬原料藥(純度>98%,濟南明鑫制藥股份有限公司)；氟康唑注射液(純度99.4%,壽光富康制藥有限公司,批號：A-10511211001)。

2 提取與分離

稱取綿馬貫眾干燥藥材30 kg,粉碎成粗粉狀,陰涼通風干燥處保存。用10倍體積95%(體積分數(shù))乙醇回流提取3次,時間分別為2、1.5、1 h,減壓濃縮回收乙醇至無醇味得到浸膏3.0 kg。用硅膠拌樣,進行硅膠柱色譜法的初步分離,依次采用不同比例的石油醚-乙酸乙酯洗脫(體積比分別為100∶0,100∶1,50∶1,20∶1,10∶1,5∶1,2∶1),TLC檢測合并相同組分得A(60 g)、B(305 g)、C(380 g)、D(120 g)、E(80 g)5個組分。組分A以石油醚-乙酸乙酯洗脫(體積比100∶1～20∶1),合并相同組分,得A1、A2、A3、A4,其中A3中有白色粉末沉淀出現(xiàn),經(jīng)丙酮反復(fù)重結(jié)晶得化合物Y1(12 mg)。組分B以石油醚-乙酸乙酯洗脫(體積比200∶1～50∶1),合并相同組分,得B1、B2、B3,B2以環(huán)己烷-丙酮洗脫(體積比60∶1～10∶1)得化合物Y2(14 mg)。組分E以石油醚-乙酸乙酯洗脫(體積比50∶1～10∶1),合并相同組分,得E1、E2、E3、E4,E3部分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析,餾分經(jīng)丙酮重結(jié)晶得化合物Y3(4 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Y1：白色不規(guī)則粉末(正己烷-丙酮),mp 166～168 ℃,甲醇和乙腈中的溶解度較差,易溶于三氯甲烷。硅膠薄層層析板展開,紫外下有吸收,噴以0.3%(質(zhì)量分數(shù),下同)堅牢藍BB顯色劑呈橙紅色,噴以堅牢藍B鹽顯粉紅色。ES-MSm/z:403(M-H),推測分子式為C21H24O8。1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ：13.01(1H,s,4,4′-OH),12.29(1H,s,6,6′-OH),3.29(2H,s,H-7),2.71(3H,s,H-9,9′),1.52(3H,brs,H-10,10′),1.47(3H,brs,H-11,11′)。13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ：203.39(8,8′-C),199.59(2,2′-C),187.82(4,4′-C),173.73(6,6′-C),110.91(1,1′-C),108.66(3,3′-C),44.72(5-C),44.67(5′-C),29.51(9-C),29.42(9′-C),25.52(10,10′-C),24.37(11,11′-C),17.40(7-C)。以上數(shù)據(jù)與文獻[5-6]報道的基本一致,確定化合物Y1為白綿馬素AA(Albaspidin AA)。

化合物Y2：類白色不規(guī)則結(jié)晶粉末(丙酮),mp 118～120 ℃,硅膠薄層層析板上展開,紫外燈下有吸收,噴以0.3%堅牢藍BB顯色劑,105 ℃加熱呈現(xiàn)橘紅色斑點。ES-MSm/z:626(M-H),推測分子式為C33H38O12。1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ：13.28(1H,s,4-OH),13.01(1H,s,6-OH),11.58(1H,s,4′,2″-OH),10.83(1H,s,2′,6″-OH),10.22(1H,s,6,4″-OH),3.60(2H,s,H-7′),3.52(2H,s,H-7),3.19(2H,t,H-9′,8″),2.73(3H,s,H-11′,10″),2.58(3H,s,H-9),1.74(2H,m,H-10′,9″),1.52(3H,s,H-10,11),1.00(3H,t,H-11′,10″)。13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ：208.33(8′-C),208.24(7″-C),203.65(8-C),198.97(2-C),197.34(4-C),195.94(6-C),178.88(4′,2″-C),172.97(6′-C),172.11(4″-C),159.87(6″-C),159.00(2′-C),111.58(3-C),111.36(1-C),108.66(1″-C),108.49(3′-C),107.01(1′-C),106.44(5″-C),105.99(5′-C),105.89(3″-C),46.21(5-C),44.73(8″-C),44.56(9′ -C),29.56(9-C),25.44(10-C),24.41(11-C),18.14(10′,9″-C),16.74(7-C),14.32(11′-C),14.20(10″-C),7.9(7′-C),4.2(12″-C)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7-8]報道的基本一致,確定化合物Y2為三環(huán)黃綿馬酸 ABB(Trisflavaspidic acid ABB)。

化合物Y3：淡黃色針狀結(jié)晶(丙酮),mp 189～191 ℃,易溶于三氯甲烷,且在三氯甲烷中比較穩(wěn)定。硅膠薄層層析板展開,紫外燈光下顯色有紫外吸收,說明有共軛結(jié)構(gòu)。噴灑0.3%堅牢藍BB顯色劑,105 ℃下呈橙紅色。1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ：13.02(1H,s,4-OH),11.59(1H,s,6-OH),10.83(1H,s,6′-OH),10.20(1H,s,4′-OH),10.23(1H,s,2′-OH),3.56(2H,s,H-7),3.20(3H,t,H-9′),2.73(3H,s,H-9),2.59(3H,s,H-12′),1.72(2H,m,J=7.2 Hz,H-10′),1.55(3H,s,H-10),1.43(3H,s,H-11),1.00(3H,t,H-11′)。13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ：208.37(8′-C),203.72(8-C),199.44(2′-C),198.96(2-C),188.28(4,4′-C),172.97(6′-C),172.10(6-C),111.47(3-C),108.42(1-C),107.01(5′-C),105.89(3′-C),105.56(1′-C),46.17(5-C),44.56(9′-C),31.81(7-C),29.63(9-C),25.62(10-C),24.40(11-C),18.04(10′-C),14.22(11′-C),7.72(12′-C)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道的基本一致,確定化合物Y3為黃綿馬酸AB(Flavaspidic acid AB)。

4 間苯三酚化合物抑菌試驗

4.1 供試液的配制

三環(huán)黃綿馬酸ABB、白綿馬素AA和黃綿馬酸AB分別用二甲基亞砜(DMSO)溶解,各配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液。氟康唑藥液質(zhì)量濃度為2 mg/mL。將鹽酸特比萘芬原料藥用生理鹽水溶解,配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的藥液。

4.2 沙氏培養(yǎng)基(SDA)的配制

稱取蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g置燒杯中,加入蒸餾水1 000 mL混勻,玻璃棒攪拌,微波爐加熱熔化,并用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至5.4±0.2,培養(yǎng)基分裝、密封,121 ℃高壓滅菌20 min,冷卻后置于4 ℃冰箱備用[10]。

4.3 RPMI-1640培養(yǎng)基的配制

稱取RPMI-1640粉末10.4 g,加蒸餾水900 mL,稱取3-(N-嗎啉基)丙磺酸鹽粉末34.5 g,攪拌使溶解。同時用1 mol/L NaOH溶液調(diào)培養(yǎng)基的pH為7.0±0.1,加蒸餾水使培養(yǎng)基終體積為1 000 mL,0.22 μm針式濾器濾過,無菌分裝至錐形瓶內(nèi),置于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

4.4 菌懸液的制備

將受試菌株紅色毛癬菌等3種真菌接種于含沙氏培養(yǎng)基(SDA)的培養(yǎng)皿上,28 ℃培養(yǎng)4～5 d充分活化,置于組織研磨器中,加入質(zhì)量濃度0.85%無菌生理鹽水,均勻研磨,調(diào)整濁度至0.5麥氏濁度,并用血細胞計數(shù)板計數(shù)調(diào)整菌液濃度為1×103～3×103CFU/mL。

4.5 最低抑菌濃度(MIC)的測定

按美國CLSI制定的M38-A2方案[11]進行測定：用RPMI-1640培養(yǎng)基將“4.1”項下制備的間苯三酚供試液稀釋為20 μg/mL,并于96孔板上的第1至第10列用RPMI-1640液體培養(yǎng)基進行橫向倍比稀釋；第11列為生長對照孔,加入RPMI-1640液體培養(yǎng)基100 μL；第12列為空白對照,加入RPMI-1640液體培養(yǎng)基200 μL。再于第1～11列各孔中加入接種菌液100 μL,此時,第1～10列單體化合物質(zhì)量濃度為20～0.039 μg/mL。將96孔板置于35 ℃恒溫孵育7 d,以肉眼觀察,視相當于與生長對照即11列,產(chǎn)生了80%生長抑制的終濃度為MIC。各株菌按以上操作平行重復(fù)測定4次,計算MIC的幾何均數(shù)。鹽酸特比萘芬陽性組同上操作。

在每次測定的同時,平行操作條件下進行質(zhì)量控制。質(zhì)控(QC)株采用近平滑念珠菌(ATCC 22019),質(zhì)控藥物為氟康唑。QC株的MIC應(yīng)在1.0～4.0 μg/mL范圍內(nèi),試驗結(jié)果表明均符合操作標準。見表1～表2。

表1 3種單體化合物對3種真菌的MIC值Table 1 MICs of three compounds on three fungus

表2 氟康唑?qū)交钪榫淖饔肨able 2 The effect of fluconazole on Candida parapsilosis

注：“-”為不長菌； “+”為生長； 生長對照為不含單體化合物； 陰性對照為空白培養(yǎng)基。

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(責任編輯：陳翔)

Study on the three kinds of phloroglucinol derivatives ofDryopteriscrassirhizomaNakai and their antifungal activity

JIA Xiaozhou1,LI Xixia2,YUAN Lipeng1,YIN Yongqin1,YANG Xionghui3,SHEN Zhibin1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.DepartmentofAnatomy,ZhaoqingMedicalCollege,Zhaoqing526020,China； 3.SinopharmGroupDezhongPharmaceuticalLimitedCompany,Foshan528000,China)

Objective To study the three kinds of phloroglucinol derivatives ofDryopteriscrassirhizomaNakai,and screen for antifungal activity againstTrichophytonrubrum,TrichophytonmentagrophytesandMicrosporumcanis. Methods The phloroglucinol derivatives ofDryopteriscrassirhizomaNakai were isolated and purified by silica gel column chromatography and Sephadex LH-20 column chromatography. All the compounds were identified by spectral analyses and physiochemical properties. The antimicrobial activity of compounds againstTrichophytonrubrum,TrichophytonmentagrophytesandMicrosporumcaniswas studied by using M38-A2 microdilution method,and the minimum inhibitory concentration(MIC) was determined. Results Three compounds were isolated and identified as Albaspidin AA,Trisflavaspidic acid ABB,Flavaspidic acid AB. MIC of the three compounds againstTrichophytonrubrumwas 160,60 and 70 μg/mL,and MIC forMicrosporumcaniswas 140,90 and 80 μg/mL,and MIC forTrichophytonmentagrophyteswas all greater than 160 μg/mL. Conclusion Three compounds had different degree of inhibitory effect on the three fungus. The activity of theTrichophytonrubrumand the culture of the dog was better than that of the tinea.

DryopteriscrassirhizomaNakai; phloroglucinol derivatives; bacteriostatic activity

2016-07-20

廣東省應(yīng)用型科技研發(fā)扶持專項(2015B020234009)

賈小舟(1991—),女,2014級碩士研究生,Email：2630151879@qq.com；通信作者：沈志濱(1964—),女,博士,教授,主要從事中藥及復(fù)方化學成分研究,Email：szb8113@126.com。

時間：2016-09-29 16:21

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160929.1621.003.html

R282.2

A

1006-8783(2016)05-0582-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016072002