鱷膽素與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響

丁玉梅，翁夢婷，毛云子，董　欣，鄧軼韜，陳清西

(廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建廈門361102)

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鱷膽素與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響

丁玉梅，翁夢婷，毛云子，董欣，鄧軼韜，陳清西*

(廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建廈門361102)

摘要:研究了鱷膽素( crocodile choline，Cro)聯(lián)合阿霉素( doxorubicin，Dox)對人肝癌細(xì)胞SMMC－7721凋亡的誘導(dǎo)作用．用鱷膽素( 15 μg/mL)和阿霉素( 0．4 μg/mL)單獨(dú)或聯(lián)合作用SMMC－7721細(xì)胞后，測定了培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶( LDH)的滲漏率，吖啶橙/溴化乙錠( AO/EB)熒光染色觀察細(xì)胞的凋亡形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧( ROS)水平和細(xì)胞線粒體膜電位變化，免疫印跡( Western blot)檢測凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C( CytC)及p53的表達(dá)量變化．結(jié)果(圖3)顯示鱷膽素和阿霉素單獨(dú)或者聯(lián)合作用都能促進(jìn)細(xì)胞中LDH的滲漏，與對照組相比，聯(lián)合作用組有極顯著差異( p＜0．01)，其作用呈時間依賴性．經(jīng)藥物處理后，AO/EB熒光染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的凋亡特征．細(xì)胞中ROS水平顯著升高，同時細(xì)胞線粒體膜電位降低．Western blot結(jié)果顯示單獨(dú)用藥組及聯(lián)合用藥組都能上調(diào)促凋亡蛋白p53的表達(dá)，促進(jìn)凋亡蛋白CytC由線粒體釋放到胞質(zhì)中，聯(lián)合用藥組作用效果更為顯著．以上結(jié)果表明鱷膽素和阿霉素單獨(dú)或聯(lián)合作用都對人肝癌SMMC－7721細(xì)胞凋亡有誘導(dǎo)作用，且以聯(lián)合用藥組作用效果更加顯著．兩藥聯(lián)合作用可能通過線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡．本研究有望為肝癌的聯(lián)合用藥治療提供理論依據(jù)．

關(guān)鍵詞:鱷膽素;阿霉素;聯(lián)合用藥;肝癌;細(xì)胞凋亡;線粒體途徑

肝癌是人類常見惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤發(fā)病中男性居第5位，女性居第7位;致死率居惡性腫瘤第3位，僅次于肺癌和胃癌［1］．乙肝是肝癌的主要誘因之一，且每年的肝癌患者數(shù)均有增加［2］．手術(shù)切除仍是提高肝癌患者生存率的主要方法，但多數(shù)患者會出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等，需要使用全身化療法輔助治療［3－4］．化療是一種全身性治療方法，對原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶均有治療作用．阿霉素是臨床肝癌的常用化療藥物，單藥有效率能達(dá)到16%［5］，但同多數(shù)化療藥物一樣選擇性差，對正常細(xì)胞有殺傷作用，毒副作用很強(qiáng)，容易產(chǎn)生耐受性，在臨床應(yīng)用中受到了一定的限制．因此，尋求新的更有效的肝癌治療方法和抗肝癌藥物組方是現(xiàn)在醫(yī)藥界面臨的重要挑戰(zhàn)．本實驗室前期研究［6］發(fā)現(xiàn)鱷膽素、阿霉素單獨(dú)使用對人肝癌SMMC－7721細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，兩者聯(lián)合使用有協(xié)同效果．鱷膽素( 15 μg/mL)與阿霉素( 0．4 μg/mL)聯(lián)合使用不僅能抑制肝癌SMMC－7721細(xì)胞的增殖及細(xì)胞的集落形成能力，還能使細(xì)胞周期發(fā)生S期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡．本研究擬以肝癌SMMC－7721細(xì)胞為研究對象，用篩選得到具有協(xié)同作用的鱷膽素和阿霉素聯(lián)合組方作用于SMMC－7721細(xì)胞，探討兩者聯(lián)合作用誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)理．

1材料與方法

1. 1材料

鱷膽素為本實驗室從暹羅鱷膽汁中經(jīng)皂化、酸化、萃取等步驟提取分離得到的白色粉末，是多種膽汁酸的混合物，－20℃避光保存，臨用前加入二甲亞砜( DMSO)溶解，0．22 μm微孔濾膜過濾除菌．阿霉素購自上海生工生物工程有限公司; RPMI－1640培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清購自Hyclone公司;熒光探針2'，7'－二氯熒光素二乙酸酯( DCFH－DA)和熒光染料羅丹明123( Rh123)購自Sigma公司;吖啶橙( AO)和溴化乙錠( EB)購自Amresco公司;人肝癌SMMC－7721細(xì)胞由廈門華僑亞熱帶植物引種園惠贈．

1. 2實驗方法

1. 2. 1細(xì)胞培養(yǎng)及分組

肝癌SMMC－7721細(xì)胞在含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、1%(體積分?jǐn)?shù))雙抗( 100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)的RPMI－1640培養(yǎng)基( pH 7．2)上，37℃，5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2中培養(yǎng)．本實驗室前期研究已篩選出鱷膽素與阿霉素聯(lián)合使用具有協(xié)同作用的組方，為15 μg/mL鱷膽素+0．4 μg/mL阿霉素［6］，因此本實驗分為對照組、鱷膽素單用藥組( 15 μg/mL)、阿霉素單用藥組( 0．4 μg/mL)和聯(lián)合用藥組( 15 μg/mL鱷膽素+0．4 μg/mL阿霉素)．

1. 2. 2普通光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

取對數(shù)生長期的肝癌SMMC－7721細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，加入藥物處理48 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)．

1. 2. 3乳酸脫氫酶( LDH)活力測定

用藥物分別處理SMMC－7721細(xì)胞24和48 h后，取培養(yǎng)液上清按照LDH試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行操作并在450 nm處測定吸光度( OD)．酶活力單位的定義:每100 mL待測樣品中的LDH在37℃與底物2，4－二硝基苯肼作用15 min，生成1 μmol丙酮酸即為一個LDH活力單位．細(xì)胞活力以培養(yǎng)基中LDH的酶活大小表示，LDH酶活越高表明細(xì)胞受損越嚴(yán)重，細(xì)胞活力越差．

1. 2. 4 AO/EB熒光染色

取對數(shù)生長期的肝癌SMMC－7721細(xì)胞接種于含多聚賴氨酸處理過的蓋玻片的6孔板中，細(xì)胞貼壁后加入藥物處理48 h．取長有細(xì)胞的爬片，磷酸鹽緩沖液( PBS)清洗3次，固定10 min; PBS再洗3次，滴加等體積預(yù)混的AO/EB染液(質(zhì)量濃度均為10 μg/mL)，室溫避光孵育10 min，PBS洗3次后，晾干，封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照．

1. 2. 5細(xì)胞內(nèi)活性氧( ROS)水平的測定

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的肝癌SMMC－7721細(xì)胞接種于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后加入藥物處理48 h．離心( 800 r/min，5 min，下同)收集貼壁和懸浮細(xì)胞，PBS洗滌，再次離心，棄上清．加入終濃度為10 μmol/L的DCFH－DA完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，37℃避光孵育30 min，離心，棄上清;再加入1 mL PBS洗滌，離心后吸去上清;加入1 mL PBS重懸細(xì)胞，300目篩絹過濾，F(xiàn)ortessa型流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowjo－V10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析．

1. 2. 6線粒體膜電位的改變

取對數(shù)生長期的肝癌SMMC－7721細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后加入藥物作用48 h．培養(yǎng)結(jié)束后PBS洗2次，滴加1 mg/mL Rh123染液，室溫避光孵育5～10 min，PBS洗滌，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照．

1. 2. 7免疫印跡( Western blot)檢測

取對數(shù)生長期的肝癌SMMC－7721細(xì)胞，經(jīng)藥物處理48 h后，收集貼壁和懸浮的所有細(xì)胞，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，混勻后于冰上裂解30 min;低溫高速離心( 4℃，10 000 r/min，10 min)，取上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒(生工生物工程股份有限公司)測定總蛋白濃度．

每管加入適量5×上樣緩沖液，沸水中煮沸5 min使蛋白變性，取等量蛋白樣品進(jìn)行電泳．然后轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯( PVDF)膜，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶封閉1 h; TBST( 10 mmol/L Tris－HCl ( pH 7．2)，150 mmol/L NaCl，0．05%(體積分?jǐn)?shù)) Tween 20)緩沖液洗膜3次，每次10 min，一抗孵育過夜;相同方法洗膜后，加入辣根過氧化物酶( HRP)標(biāo)記的二抗孵育1 h;再洗膜后滴加化學(xué)發(fā)光底物于PVDF膜上，在暗室中進(jìn)行膠片曝光、顯影和定影．

2結(jié)果與分析

2. 1鱷膽素與阿霉素聯(lián)用對細(xì)胞形態(tài)的影響

鱷膽素與阿霉素單獨(dú)或聯(lián)合作用SMMC－7721細(xì)胞48 h后，普通倒置光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果如圖1所示:對照組細(xì)胞呈梭形、不規(guī)則多邊形，細(xì)胞生長均勻飽滿;鱷膽素單用藥組貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，半數(shù)細(xì)胞變成長梭形，部分細(xì)胞變圓;阿霉素單用藥組貼壁細(xì)胞數(shù)量大量減少，細(xì)胞呈單個生長，說明細(xì)胞的增殖受到了比較明顯的抑制，且細(xì)胞內(nèi)顆粒、空泡明顯增多;聯(lián)合用藥組幾乎沒有細(xì)胞保持正常形態(tài)，多數(shù)細(xì)胞皺縮、變圓、體積縮小，有較多細(xì)胞從皿壁脫落，懸浮于培養(yǎng)液中．用藥組與對照組相比細(xì)胞形態(tài)都有明顯變化，并且聯(lián)合用藥組更為顯著，說明鱷膽素和阿霉素聯(lián)合具有協(xié)同作用．

圖1普通光鏡下觀察鱷膽素與阿霉素單獨(dú)或聯(lián)合作用后SMMC－7721細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化Fig．1 Effect of Cro with or without Dox on the morphologic changes of SMMC－7721 cells under ordinary optical microscope

2. 2鱷膽素與阿霉素聯(lián)用對細(xì)胞LDH滲漏的影響

LDH存在于正常細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，是機(jī)體能量代謝中的一種重要的酶．一旦細(xì)胞膜受損，LDH被釋放到細(xì)胞外．通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)基上清中LDH活性，可以判斷細(xì)胞受損程度．

LDH活性測定結(jié)果如圖2所示:藥物作用24 h后，與對照組相比，阿霉素單用藥組的LDH活性無明顯改變，鱷膽素單用藥組出現(xiàn)了顯著差異( p＜0．05)，而聯(lián)合用藥組出現(xiàn)了極顯著性差異( p＜0．01)，酶活比對照組高132．75%; 48 h后聯(lián)合用藥組與對照組相比差異也極顯著( p＜0．01)，LDH酶活比對照組增加了112．04%．由此可以看出，聯(lián)合用藥組能顯著增加由于細(xì)胞損傷引起的LDH滲漏．

2. 3 AO/EB染色觀察細(xì)胞凋亡

GLONASS L1OC信號采用短時相關(guān)結(jié)合FFT算法實現(xiàn)捕獲，捕獲的結(jié)構(gòu)圖如圖5所示。該捕獲結(jié)構(gòu)采用N個短時相關(guān)支路來實現(xiàn)時域的并行，圖中虛線所示。

AO和EB是兩種不同的熒光核酸染料: AO能透過細(xì)胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光; EB只能透過細(xì)胞膜破損的細(xì)胞，與細(xì)胞核DNA結(jié)合，發(fā)出橘紅色熒光．

圖2鱷膽素與阿霉素單獨(dú)或聯(lián)合作用對SMMC－7721細(xì)胞中LDH滲漏的影響Fig．2 Effect of Cro with or without Dox on the releasing of LDH in SMMC－7721 cells

鱷膽素與阿霉素單獨(dú)或聯(lián)合作用SMMC－7721細(xì)胞48 h后，經(jīng)AO/EB雙染色觀察，結(jié)果(圖3)顯示:對照組細(xì)胞呈均勻的綠色熒光;鱷膽素單用藥組細(xì)胞核固縮，部分細(xì)胞核可見致密濃染的橙黃色熒光;阿霉素單用藥組細(xì)胞形態(tài)略變圓，邊緣不清晰，部分細(xì)胞核染色發(fā)出橙色至橘紅色熒光;聯(lián)合用藥組細(xì)胞密度急劇減少，發(fā)橙色、橘紅色熒光，凋亡特征十分明顯．以上結(jié)果表明，鱷膽素和阿霉素都能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而兩藥聯(lián)合作用效果顯著高于單用藥．

2. 4細(xì)胞內(nèi)ROS的變化

熒光探針DCFH－DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成2'，7'－二氯熒光素雙酚( DCFH) ; DCFH不能透過細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)．細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的二氯熒光素( DCF)，檢測DCF的熒光強(qiáng)度就可以反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平．

鱷膽素和阿霉素單獨(dú)或聯(lián)合作用SMMC－7721細(xì)胞24 h后，對細(xì)胞進(jìn)行DCFH－DA熒光染色．流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果(圖4)表明:阿霉素單用藥組中ROS水平升高的細(xì)胞比例( P2)增加;兩藥聯(lián)合后增加更為顯著，與對照組相比，聯(lián)合用藥組P2增加了4．5倍．以上結(jié)果表明鱷膽素與阿霉素聯(lián)合作用誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡可能與細(xì)胞內(nèi)ROS的積累有關(guān)．

2. 5線粒體膜電位的改變

Rh123是一種可透過細(xì)胞膜的陽離子熒光染料，可以指示線粒體跨膜電位．Rh123在正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)，熒光強(qiáng)度減弱或粒體膜通透性改變，引起線粒體跨膜電位的崩潰，Rh123從線粒體中被重新釋放出來，繼而發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光．因此，可通過檢測細(xì)胞內(nèi)熒光信號的強(qiáng)弱來判斷細(xì)胞線粒體膜電位的變化和凋亡的發(fā)生．

圖3 AO/EB染色觀察鱷膽素與阿霉素單獨(dú)或聯(lián)合作用后SMMC－7721細(xì)胞的凋亡情況Fig．3 Effect of Cro with or without Dox on the apoptosis changes of SMMC－7721 cells by staining with AO/EB

圖4鱷膽素與阿霉素單獨(dú)或聯(lián)合作用對SMMC－7721細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig．4 Effects of Cro with or without Dox on the ROS level in SMMC－7721 cells

消失;在細(xì)胞發(fā)生凋亡時，線粒體膜完整性被破壞，線

肝癌細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h后，Rh123染色，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn):對照組細(xì)胞線粒體分布均勻，形態(tài)一致，發(fā)出弱的綠色熒光;鱷膽素單用藥組細(xì)胞數(shù)量減少，少數(shù)細(xì)胞線粒體發(fā)出強(qiáng)的黃綠色熒光，說明細(xì)胞可能正在經(jīng)歷線粒體膜電位的改變;阿霉素單用藥組的細(xì)胞，線粒體形態(tài)改變較大，多分布在核周，呈團(tuán)塊狀，發(fā)出強(qiáng)的黃綠色熒光;聯(lián)合用藥組的細(xì)胞線粒體分布與阿霉素單用藥組類似，但是數(shù)量明顯稀少．上述現(xiàn)象說明兩藥聯(lián)合作用對細(xì)胞線粒體損傷程度最大，對線粒體膜電位的影響遠(yuǎn)超于單用藥，具有協(xié)同作用．

圖5 Rh123染色觀察鱷膽素與阿霉素單獨(dú)或聯(lián)合作用對SMMC－7721細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響Fig．5 Changes of membrane potential of mitochondrion after treated with Cro with or without Dox for 24 h by staining with Rh123

2. 6凋亡相關(guān)蛋白p53和細(xì)胞色素C( CytC)表達(dá)的變化

p53基因是一類重要的腫瘤抑制基因，在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用．大量研究［7－8］表明p53蛋白既能促進(jìn)促凋亡因子轉(zhuǎn)錄，也能抑制抗凋亡因子轉(zhuǎn)錄．還有研究發(fā)現(xiàn)p53蛋白表達(dá)增加能使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，從而導(dǎo)致線粒體通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［9］．線粒體中CytC的釋放是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵步驟．線粒體膜通透性增高能引發(fā)CytC的釋放，同時Bcl－2蛋白家族對其釋放也有調(diào)控作用．因此，本研究進(jìn)而探討以上諸多因素改變后對SMMC－7721細(xì)胞中p53、CytC蛋白表達(dá)的影響．

Western blot檢測結(jié)果如圖6所示:對照組細(xì)胞質(zhì)中有少量CytC蛋白;鱷膽素單用藥組中，CytC蛋白的釋放量有所增加;阿霉素單用藥組中，CytC蛋白的釋放量大量增加，與對照組相比差異顯著;兩藥聯(lián)合組中，釋放到細(xì)胞質(zhì)中的CytC蛋白量也顯著增加，較單用藥組更為明顯．p53蛋白在對照組中幾乎沒有表達(dá);鱷膽素單用藥組中有少量的p53蛋白;阿霉素單用藥組中，p53蛋白表達(dá)量增加;兩藥聯(lián)合組中，p53蛋白表達(dá)量較單用藥組有顯著增加．上述結(jié)果與線粒體膜電位變化的結(jié)果一致．

圖6鱷膽素與阿霉素單獨(dú)或聯(lián)合作用對SMMC－7721細(xì)胞中p53、CytC蛋白表達(dá)的影響Fig．6 The effect of Cro with or without Doxon the protein levels of p53 and CytC

3討論

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，治療困難．早期肝癌比較有效的治療方法是手術(shù)治療，但由于肝癌早期癥狀不明顯，當(dāng)患者發(fā)現(xiàn)患病時已到中晚期，錯過了最佳治療時機(jī)．化療在肝癌的治療中占有非常重要的地位．聯(lián)合化療是采用兩種或兩種以上的化療藥物聯(lián)合使用，目的在于增強(qiáng)療效，降低毒副反應(yīng)及耐藥性［10］．本實驗室前期研究［6］發(fā)現(xiàn)，鱷膽素與阿霉素聯(lián)合作用對肝癌SMMC－7721細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用，同時能使細(xì)胞周期發(fā)生S期阻滯．在此基礎(chǔ)上，本文探討了鱷膽素與阿霉素聯(lián)合作用對SMMC－7721細(xì)胞凋亡的影響及可能的分子機(jī)制．

鱷膽素、阿霉素單獨(dú)或聯(lián)合處理后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化．AO/EB熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)藥物處理后部分細(xì)胞發(fā)橘紅色熒光，展現(xiàn)出明顯的凋亡特征，且聯(lián)合用藥組效果更顯著;細(xì)胞LDH的滲漏經(jīng)聯(lián)合藥物處理大幅增加，表明細(xì)胞受到損傷．

線粒體是細(xì)胞能量代謝的中心，細(xì)胞凋亡會導(dǎo)致其正常功能的喪失．ROS是生物代謝過程中產(chǎn)生的一類性質(zhì)活潑的物質(zhì)，能導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA等氧化損傷，誘發(fā)細(xì)胞凋亡．細(xì)胞內(nèi)ROS的累積可導(dǎo)致線粒體膨大，達(dá)到一定水平將激活線粒體上非特異性的通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔道( PTP)開放，使線粒體跨膜電位降低，CytC從內(nèi)膜脫落并釋放到細(xì)胞質(zhì)中［11］．CytC的釋放是線粒體凋亡路徑的主要步驟，在dATP/ATP存在的情況下，從線粒體釋放的CytC與凋亡蛋白酶活化因子Apaf1形成多聚復(fù)合體，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)入線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑［12］．流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鱷膽素與阿霉素聯(lián)合作用于SMMC－7721細(xì)胞后，能顯著升高細(xì)胞內(nèi)的ROS水平;同時采用Rh123染色，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥能降低線粒體膜電位．由此推測，鱷膽素與阿霉素聯(lián)合用藥能對SMMC－7721細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，使線粒體膜通透性改變，發(fā)生線粒體膜電位崩潰，以致凋亡因子CytC釋放到胞質(zhì)中，啟動細(xì)胞凋亡程序．

研究發(fā)現(xiàn)定位于線粒體上的轉(zhuǎn)錄因子p53能與Bcl－2家族蛋白Bax直接相互作用，兩者結(jié)合產(chǎn)生促凋亡的結(jié)構(gòu)構(gòu)象;另外這種相互作用還能引起B(yǎng)ax的多聚化，導(dǎo)致線粒體通透性改變，使促凋亡因子(如CytC)釋放到細(xì)胞質(zhì)中［13］．鱷膽素與阿霉素聯(lián)合用藥能顯著上調(diào)p53蛋白和Bax蛋白［6］的表達(dá)，可能加速CytC釋放，進(jìn)而加速細(xì)胞凋亡．

綜上結(jié)果，鱷膽素與阿霉素聯(lián)合作用誘導(dǎo)肝癌SMMC－7721細(xì)胞凋亡，可能是通過線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑發(fā)揮作用．在外界條件(如藥物)刺激下，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，線粒體膜電位降低，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，凋亡信號蛋白CytC釋放到胞質(zhì)中，引發(fā)細(xì)胞凋亡．本論文研究結(jié)果有望為臨床肝癌藥物聯(lián)合治療提供理論支持．

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Effect of Crocodile Choline Combined with Doxorubicin on Apoptosis of Human Hepatocellular Carcinoma Cells SMMC-7721

DING Yumei，WENG Mengting，MAO Yunzi，DONG Xin，DENG Yitao，CHEN Qingxi*

( School of Life Sciences，Xiamen University，Xiamen 361102，China)

Abstract:In this paper，we studied the effect of crocodile choline combined with doxorubicin on apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells SMMC－7721．SMMC－7721 cells were treated with crocodile choline( 15 μg/mL) alone or combined with doxorubicin( 0．4 μg/mL)，followed by LDH release assay，AO/EB staining，flow cytometry analysis and Western blot to detect relative indicators．The results showed that crocodile choline with or without doxorubicin could promote the releasing of LDH in SMMC－7721 cells，and there were very significant difference ( p＜0．01) between combined group and control group．SMMC－7721 cells exhibited obvious characteristics of apoptosis by AO/EB staining．We found that the level of ROS was markedly increased and much higher than control group when different drugs were used to treat the SMMC－7721 cells．Western blot results showed that crocodile choline with doxorubicin up－regulated expression of CytC and p53 protein in SMMC－7721 cells．Taking together，these results showed that crocodile choline alone or combined with doxorubicin could induce SMMC－7721 cells apoptosis，and the combination group showed better talents．This study suggests that mitochondrial－dependent signal transduction pathways are involved in crocodile choline with doxorubicin－induced SMMC－7721 cells apoptosis，supplying theoretical support for the treatment of human hepatocellular carcinoma on drug combination．

Key words:crocodile choline; doxorubicin; drug combination; hepatocellular carcinoma; apoptosis; mitochondrial pathway

*通信作者:chenqx@ xmu．edu．cn

基金項目:廈門市科技計劃項目( 3502Z20133009) ;廈門大學(xué)基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金( J1310027)

收稿日期:2015－04－22錄用日期: 2015－06－12

doi:10．6043/j．issn．0438－0479．2016．01．013

中圖分類號:Q 356．1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:0438－0479( 2016) 01－0072－06

引文格式:丁玉梅，翁夢婷，毛云子，等．鱷膽素與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對肝癌SMMC－7721細(xì)胞凋亡的影響［J］．廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2016，55( 1) : 72－77．

Citation: DING Y M，WENG M T，MAO Y Z，et al．Effect of crocodile choline combined with doxorubicin on apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells SMMC－7721［J］．Journal of Xiamen University( Natural Science)，2016，55( 1) : 72－77．( in Chinese)