青海地區(qū)回族、撒拉族胃癌患者雌激素受體基因多態(tài)性研究*

王 成，趙延芳，王 虎，謝艷超

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，青海 西寧 810001)

青海地區(qū)回族、撒拉族胃癌患者雌激素受體基因多態(tài)性研究*

王 成，趙延芳，王 虎，謝艷超

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，青海 西寧 810001)

目的 通過研究青海地區(qū)回族、撒拉族人群中ERα基因PvuⅡ和XbaⅠ、ERβ基因RsaⅠ及AluⅠ單核苷酸多態(tài)性(SNPs)分布情況，分析ERα基因和ERβ基因SNPs與青海地區(qū)回族、撒拉族胃癌患者的關(guān)系。方法 收集青海地區(qū)原發(fā)胃腺癌回族、撒拉族患者及條件與之匹配的健康對照組各80例。采集觀察對象空腹靜脈血2～3 mL提取DNA。應(yīng)用PCR-RFLP法對ERα基因PvuⅡ和XbaⅠ、ERβ基因RsaⅠ及AluⅠ單核苷酸多態(tài)性(SNPs)進行鑒定，利用統(tǒng)計學(xué)方法分析ERα基因PvuⅡ和XbaⅠ、ERβ基因RsaⅠ和AluⅠ基因多態(tài)性與罹患胃癌危險性的關(guān)系。結(jié)果 回族胃癌組和對照組對比ERα-XbaⅠ基因XX、Xx、xx分布存在顯著性差異，撒拉族胃癌組和對照組對比ERα-XbaⅠ基因XX、Xx、xx分布存在顯著性差異；回族、撒拉族胃癌組和對照組ERα-PvuⅡ、ERβ-RsaⅠ、Erβ-AluⅠ基因型分布無差異；研究對象中胃癌組回族和撒拉族ERα-XbaⅠ、ERα-PvuⅡ、ERβ-RsaⅠ、Erβ-AluⅠ基因型分布無顯著性差異。結(jié)論 ERα基因XbaⅠ位點多態(tài)性與青海地區(qū)胃癌的易感性存在相關(guān)性；ERα-XbaⅠ基因分布可能增加了罹患胃癌的危險性。但在青海地區(qū)回族、撒拉族胃癌人群間該基因型分布無顯著性差異。ERα基因PvuⅡ、ERβ基因AluⅠ和RsaⅠ位點多態(tài)性與青海地區(qū)胃癌的易感性不具有相關(guān)關(guān)系。

胃癌 雌激素受體 遺傳易感性 基因多態(tài)性

青海地區(qū)漢、回、藏、撒拉、土、蒙古族胃鏡胃癌檢出率分別為5.959%、8.519%、6.128%、6.868%、6.492%、3.876%；其中回族胃鏡檢出率最高[1]。本研究通過研究雌激素受體基因多態(tài)性與青海地區(qū)回族、撒拉族胃癌易感性的相關(guān)性，初步探討雌激素受體基因多態(tài)性與青海地區(qū)回族、撒拉族胃癌易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

采用1：1配對病例對照研究。將2012年12月至2015年6月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院收治且經(jīng)病理確診為原發(fā)胃腺癌的80例回族、80例撒拉族患者作病例組；收集與病例組在民族、性別、年齡相匹配同期健康體檢者各80例作對照組。所有研究對象在提供血液標(biāo)本前，簽署醫(yī)學(xué)倫理學(xué)同意書，并經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取

抽取胃癌組和對照外周靜脈血2～3 mL，分離血清，運用常規(guī)的鹽析法提取白細胞中的基因組DNA，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成

引物的設(shè)計與合成由上海生工生物工程(股份)有限公司合成。

引物序列：ERα基因PvuII、XbaI多態(tài)性引物

上游：5′-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3′

下游：5′-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3′

PCR產(chǎn)物片段長度1.3 kb；

ERβ基因RsaI

上游：5′-TCTTGCTTTCCCCAGGCTTT-3′

下游：5′-ACCTGTCCAGAACAAGATCT-3′

PCR產(chǎn)物片段長度156 bp；

ERβ基因AluⅠ

上游：5′-TTTTTGTCCCCATAGTAACA-3′

下游：5′-AATGAGGGACCACACAGCA-3′

PCR產(chǎn)物片段長度307 bp。

1.2.3 PCR方法擴增

進行ERα基因片段、ERβ基因RsaⅠ多態(tài)位點片段和ERβ基因AluⅠ多態(tài)位點片段三對引物的PCR擴增。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。外透射儀燈下觀察結(jié)果，行限制性內(nèi)切酶酶切分析。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究采用SPSS22.0軟件進行分析，連續(xù)型資料采用均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗；分類資料采用頻數(shù)表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗進行，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。雌激素受體基因型頻率經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，樣本中各基因型頻率已達遺傳平衡，具有較好的群體代表性。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般資料

回族患者80例，其中男性51例，女性29例，年齡在40～69歲，平均年齡(54.30±7.26)歲；撒拉族患者80例，其中男性58例，女性22例，年齡在42～69歲，平均年齡(54.70±7.21)歲?；刈褰】嫡?0例，其中男性49例，女性31例；年齡40～69歲，平均年齡(53.03±6.98)歲；撒拉族健康者80例，其中男性45例，女性35例；年齡40～69歲，平均年齡(52.34±7.29)歲。四組研究對象性別構(gòu)成經(jīng)卡方檢驗(χ2=4.783，P=0.188)性別構(gòu)成比例無統(tǒng)計學(xué)差異；四組研究對象年齡均值經(jīng)單因素方差分析(F=1.871，P=0.134)年齡沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2 限制性酶切片段長度多態(tài)性結(jié)果

ERα基因PvuⅡ的酶切結(jié)果用P和p表示，PvuⅡ內(nèi)切酶位點多態(tài)性電泳結(jié)果為PP(CC型)：1374bp一個條帶；pp(TT型)：936 bp、438 bp兩個條帶；Pp(CT型)：1374 bp、936 bp、438 bp三個條帶(圖1)。同理ERα基因XbaⅠ內(nèi)切酶位點多態(tài)性電泳結(jié)果為XX(GG型)：1374 bp一個條帶；xx(AA型)：981 bp、393 bp兩個條帶；Xx(AG型)：1374 bp、981 bp、393 bp三個條帶(圖2)。ERβ基因AluI酶切結(jié)果為aa(GG型)：307 bp一個條帶；AA(AA型)：242 bp、65 bp兩個條帶；Aa(AG型)：307 bp、242 bp、65 bp三個條帶(圖3)。ERβ基因Rsal酶切結(jié)果為rr(GG型)：156 bp一個條帶；RR(AA型)：110 bp，46 bp兩個條帶；Rr(AG型)：156 bp，110 bp，46 bp三個條帶(圖4)。圖1至圖4中，M均為DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 ERα基因PvuⅡ的酶切鑒定結(jié)果

Figure 1 Restriction enzyme digestion bands of ERα gene Pvu II

圖2 ERα基因XbaⅠ的酶切鑒定結(jié)果

圖3 ERβ基因AluⅠ的酶切鑒定結(jié)果

圖4 ERβ基因RsaⅠ的酶切鑒定結(jié)果

2.3 雌激素受體基因多態(tài)性統(tǒng)計結(jié)果

回族人群中，胃癌組和對照組的Erα-Xba I(XX，Xx，xx)基因分布概率在1%水平上存在顯著性差異(χ2=34.800，P=0.000)；胃癌組中XX基因型占比為60%，而對照組中XX基因型占比為15%；胃癌組和對照組的Erα-Pvu II(PP，Pp，pp)、ERβ-Rsa l(RR，Rr，rr)、Erβ-Alu I(AA，Aa，aa)基因分布概率均無顯著性差異(表1)。

表1 回族人群胃癌組與對照組不同基因型對比結(jié)果(%)

Table 1 Comparison of different genotypes in the gastric cancer group and control group

撒拉族人群中，胃癌組和對照組的Erα-Xba I(XX，Xx，xx)基因分布概率在1%水平上存在顯著性差異(χ2=10.902，P=0.004)；胃癌組中XX基因型比例為46.25%，而對照組中XX基因型比例為22.5%；胃癌組和對照組的Erα-Pvu II(PP，Pp，pp)、ERβ-Rsa l(RR，Rr，rr)、Erβ-Alu I(AA，Aa，aa)基因分布概率均無顯著性差異(表2)。

表2 撒拉族人群胃癌組與對照組不同基因型對比結(jié)果(%)

Table 2 Comparison of different genotypes in the gastric cancer group and control group

2.4 胃癌病人中不同民族雌激素受體基因多態(tài)性比較結(jié)果

胃癌組中回族和撒拉族ERα-XbaⅠ、ERα-PvuⅡ、ERβ-RsaⅠ、Erβ-AluⅠ基因型分布無顯著性差異(表3)。

表3 胃癌病人中不同民族基因型表達的對比結(jié)果(%)

Table 3 Comparison amongthe genotypes in patients with gastric cancer in different nationalities(%)

續(xù)表：

基因型胃癌患者回族撒拉族χ2PERβ-RsalRR7(8.75) 6(7.50) Rr40(50.00)39(48.75)0.1480.928rr33(41.25)35(43.75)Erβ-AluIAA3(3.75) 5(6.25) Aa22(27.50)24(30.00)0.7560.703aa55(68.75)51(63.75)

3 討論

雌激素受體(ER)屬于核受體超家族成員之一，通過與雌激素結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[2]。ER包括α和β兩種亞型。目前國內(nèi)外許多研究均已證明ERα基因和ERβ基因SNPs與乳腺癌、原發(fā)性肝癌、子宮內(nèi)膜癌、骨質(zhì)疏松癥和多發(fā)性硬化病等多種疾病相關(guān)[3-10]。本研究通過對青海地區(qū)回族、撒拉族胃癌組和對照組ERα基因PvuⅡ和XbaⅠ，ERβ基因RsaⅠ和AluⅠ單核苷酸多態(tài)性(SNPs)分布情況進行對比，分析等位基因型、各基因型及單倍體型特征，揭示ERα基因和ERβ基因SNPs與胃癌的關(guān)系。

在回族胃癌組與健康組對比、撒拉族胃癌組與健康組對比均提示胃癌組和對照組ERα-XbaⅠ基因XX、Xx、xx分布存在顯著性差異；不同民族胃癌組和對照組ERα-PvuⅡ、ERβ-RsaⅠ、ERβ-AluⅠ基因型分布均無顯著性差異。既往有很多研究探討了ER基因多態(tài)和胃癌相關(guān)性，但結(jié)果不盡相同[11-16]。本研究結(jié)果顯示，ERα基因XbaⅠ的多態(tài)性分布與胃癌易感性有顯著相關(guān)性，且ERα-XbaⅠ基因分布可能增加了罹患胃癌的危險度；在胃癌組中檢測到較對照組多的XX基因型比例，此研究結(jié)果與先前研究基本類似。目前有關(guān)ERβ基因多態(tài)性與胃癌相關(guān)的研究報道較少。有研究發(fā)現(xiàn)，胃腺癌組織中ERβ的表達水平較癌旁正常胃黏膜下降[17]。但本研究結(jié)果顯示胃癌組和對照組Erα-PvuⅡ、ERβ-RsaⅠ、Erβ-AluⅠ基因型分布均無顯著性差異。

胃癌組中回族和撒拉族ERα-XbaⅠ、ERα-PvuⅡ、ERβ-RsaⅠ、Erβ-AluⅠ基因型分布沒有顯著性差異。在所研究區(qū)域不同民族之間胃癌發(fā)病率的研究仍無明確的流行病學(xué)調(diào)查資料，且該研究資料無大樣本的隨機人群抽樣，尚不能說明民族因素與胃癌發(fā)病率之間的關(guān)系；本研究表明青海地區(qū)不同民族胃癌患者之間ER基因多態(tài)性無顯著差異，但民族是否是影響胃癌發(fā)生的獨立影響因素尚不足以證明。

以上研究結(jié)果提示，ERα-XbaⅠ基因分布可能增加了罹患胃癌的危險性，但在胃癌人群中不同民族之間基因型分布無顯著性差異。因此，該基因型可作為胃癌高發(fā)地區(qū)人群胃癌發(fā)生危險因素的篩選指標(biāo)。但仍需大樣本、多中心研究。

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Research on the gene polymorphism of estrogen receptor of Hui and Salar patients with gastric cancer in Qinghai area

Wang Cheng，Zhao Yanfang，Wang Hu，Xie Yanchao

(Department of Gastrointestinal Surgery，QinghaiUniversityAffiliated Hospital，Xining，Qinghai 810001，China)

Objective This article aims to study the distribution situation of ERα-PvuⅡ and XbaⅠ，ERβ-RsaⅠand AluⅠsingle nucleotide polymorphism(SNPs)；and the relationship between the SNPs of ERα gene and ERβ gene in the patients with gastric carcinoma among Hui and Salar people in Qinghai area.Methods 80 cases of Hui patients and 80 cases of Salar patients with gastric adenocarcinoma as case group and 80 cases of health group with matched age，gender and nationality were collected from QinghaiUniversityAffiliatedHospital.2～3 mL venous blood in fast state was collected from each patient to extract DNA.PCR-RFLP method was applied to identify PvuⅡ and XbaⅠ of ERα gene，RsaⅠand AluⅠSNPs of ERβ.Statistics method was adopted to analyze the relations between PvuⅡ and XbaⅠof ERα gene，RsaⅠ and AluⅠ SNPs of ERβ gene with the risk of having gastric cancer.Results In terms of in Hui gastric cancer group and control group，significant difference exists in ERα-XbaⅠgene XX，Xx and xx distribution；in terms of Salar gastric cancer group and control group，significant difference exists in ERα-XbaⅠ gene XX，Xx and xx distribution；in terms of gastric cancer group and control group of Hui people and Salar people，no significant difference was found in ERα-PvuⅡ，ERβ-RsaⅠ，and Erβ-AluⅠ gene distribution.Among the research subjects，no significant difference was found between the gene distribution of gastric cancer group and Salar ERα-XbaⅠ，ERα-PvuⅡ，ERβ-RsaⅠ，and Erβ-AluⅠ.Conclusions Correlation exists in the ERα-XbaⅠpolymorphism and the susceptibility of gastric cancer in Qinghai area；the ERα-XbaⅠgene distribution may has increased risk of gastric cancer，but no significant difference was found on the gene distribution of people with gastric cancer among different nationalities.The ERα-PvuⅡ，ERβ-AluⅠ，and RsaⅠpolymorphism were not correlated to the susceptibility of gastric cancer in Qinghai area.

Gastric cancer Estrogen receptor Susceptibility Gene Polymorphism

*：青海省科技廳自然科學(xué)基金項目(2012-Z-726) 王 成(1971～)男，漢族，甘肅籍，副主任醫(yī)師

R735.2

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.005

2015-11-12