活血化濁方對心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷的干預作用

潘 霞，曹昌霞

(1.青海大學研究生院；2.青海大學附屬醫(yī)院)

活血化濁方對心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷的干預作用

潘 霞1，曹昌霞2*

(1.青海大學研究生院；2.青海大學附屬醫(yī)院)

目的 探討活血化濁方對缺血再灌注大鼠心肌損傷的干預作用及機理。方法 48只Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組、丹參組、活血化濁方高劑量組、活血化濁方中劑量組、活血化濁方低劑量組(各8只)。丹參組大鼠予丹參混懸液[1.5g(藥物含量)/kg(大鼠體重)]，活血化濁方高、中、低劑量組大鼠分別予活血化濁方混懸液5.0、1.5、0.5 g/kg，均用生理鹽水稀釋至2 mL，假手術組及模型組予等量生理鹽水。各組喂養(yǎng)4 W后，麻醉開胸，假手術組不做結扎，其余各組大鼠絲線結扎冠狀動脈左前降支，30 min后，剪開絲線，再灌注60 min，建立實驗性心肌損傷(I/R)模型。測定血清心肌酶譜五項(CK、CK-MB、AST、HBDH、LDH)水平；取大鼠心尖組織測定超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量；觀察各組大鼠心電圖ST段變化情況。結果 造模后大鼠血清心肌酶譜五項，心肌組織SOD、MDA及ST段平均值均有不同程度變化；活血化濁方高、中、低組血清CK、CK-MB、LDH、AST、HBDH水平明顯低于模型組，其高、中劑量組優(yōu)于其他組；活血化濁高、中劑量組大鼠心肌組織SOD水平明顯高于模型組及低劑量組和丹參組；MDA水平明顯低于模型組及低劑量組和丹參組。各組大鼠冠狀動脈結扎再灌注后ST段平均值：活血化濁方高、中劑量組低于模型組、低劑量組和丹參組，活血化濁低劑量組與丹參組比較無顯著性。結論 活血化濁方對心肌缺血再灌注大鼠的心肌損傷有一定的干預作用，其機理可能與活血化濁方能夠改善急性心肌缺血狀態(tài)下的心肌酶譜，增加SOD的活性，減少MDA的產(chǎn)生，以及抑制心電圖中ST段病理性抬高，保護心肌細胞免受損害相關。

缺血再灌注 心肌 損傷 活血化濁方

心肌梗死后的冠脈再通術、冠脈搭橋術及冠脈溶栓等技術可出現(xiàn)心肌缺血[1]，臨床上通常會出現(xiàn)心律失常、血清心肌酶譜改變等?；钛瘽岱接牲S芪、水蛭、紅景天、紅曲四味藥組成，具有益氣降濁，活血化瘀的功效。現(xiàn)代藥理學研究表明，活血化濁方中的黃芪[2][3]、水蛭[4][5]、紅景天[6][7]、紅曲[8]通過多種途徑對心肌缺血再灌注損傷(MI-R)發(fā)揮保護作用。本研究通過觀察活血化濁方對心肌缺血再灌注大鼠血清心肌酶(CK、CK-MB、AST、HBDH、LDH)、心臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量及心電圖ST段改變的影響，進一步探討活血化濁方的應用對心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷的干預作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠48只，雌雄各半，體重(180±10)g，甘肅省中醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(甘)2013-0002，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)學院SPF級動物房。

1.2 藥物、試劑與器材

1.2.1 藥物和試劑

活血化濁方所用藥物、丹參顆粒劑(廣東一方制藥有限公司)，生理鹽水(青海大學附屬醫(yī)院藥房)。MDA、SOD 及CK、CK-MB、LDH、AST、HBDH試劑盒(南京建成生物工程研究所)。將活血化濁方劑及丹參顆粒劑，用生理鹽水配置成混懸液(0.5g/mL)。

1.2.2 實驗器材

HX-300S動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)，BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，DNM-9602酶標分析儀(北京朗新科技有限公司)。

1.3 造模方法

將48只大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為假手術組、模型組、丹參組、活血化濁方高、中、低劑量組。丹參組予丹參混懸液(1.5g/kg)，活血化濁方高、中、低劑量組分別按5.0、1.5、0.5 g/kg劑量進行灌胃，每日1次，每次2 mL，4 W后停止灌胃。參考王勇等[9]方法以30%烏拉坦腹腔注射麻醉動物(2ml/kg)，充分麻醉后將大鼠置于手術臺上，固定大鼠的四肢及頭部，在大鼠四肢皮下及心前區(qū)皮下插入針電極，備用(心電圖機走紙速度為50mm/s，記錄大鼠手術前5min，結扎后10、20、30min，再灌注60min后心電圖)。在頸部和左前胸部備皮，于胸骨上窩上0.6 cm處，向上縱行切開皮膚1 cm，鈍性分離深筋膜及頸闊肌，充分顯露氣管，充分止血后，于第3、4氣管環(huán)間作倒T形切口，清理氣管內(nèi)分泌物，啟動呼吸機(呼吸機的頻率為70次/min，潮氣量為8～12mL，呼吸比為2：1)，進行氣管插管，順利插管后，用絲線將氣管插管的結合部環(huán)扎固定。左胸前備皮、鋪巾，在胸骨左緣行縱行皮膚切口(長度約2cm)，鈍性分離皮下及深淺筋膜，顯露胸大肌，將胸大肌胸骨緣止點切斷游離，靠近胸骨緣0.3 cm處鈍性分離3、4肋間，用鑷子提起第3、4肋軟骨并剪斷，并將胸膜鈍性分離，撐開肋間露出心臟，拉鉤拉開手術切口露出組織。用濕潤的棉簽小心推開心臟周圍的肺組織，擴大手術的視野范圍，鑷子提起心包膜，用眼科剪剪開心包，棉簽向上將胸腺推開，即可以看到明顯的左心耳，以左心耳為標志(冠狀動脈位于左心耳下方2～3mm，并有心大靜脈與之伴行)，在其下方3 mm處，將穿好絲線的小圓針垂直進針(深度為0.5～1mm)，取開縫合針，在進針處以持針器放置約0.3 mm的硅膠小圓管，打結后將其固定，壓迫左前降支造成血流阻斷，以ECGⅡ?qū)?lián)ST段抬高0.5 mv或T波高聳、心肌顏色變?yōu)榘导t色，作為冠脈結扎成功的標志。30 min后剪開結扎扣，再灌注60 min，即可形成大鼠缺血再灌注模型。迅速將大鼠腹腔打開，暴露腹主動脈并采血，取出心臟，用生理鹽水清洗干凈后，以眼科剪剪下適量心尖組織并稱重，將0.2 g放入組織管中，置于-70 ℃冰箱保存。

1.4 指標測定方法

1.4.1 CK、CK-MB、LDH、HBDH、AST檢測方法

將大鼠腹主動脈血靜置2 h后放入離心機離心15 min(5000r/min)，取出上清液。離心后吸取血清，置-70 ℃冰箱保存。按試劑盒說明檢測CK、CK-MB、LDH、HBDH、AST的含量。

1.4.2 SOD活性及MDA含量檢測方法

從組織管中取出大鼠心尖組織0.2 g，用勻漿機將其研磨后裝入離心管中，配制成濃度為0.2 g/mL的勻漿液備用。按試劑盒說明書測定SOD活性及MDA含量。

1.4.3 結扎后ST段抬高的平均數(shù)計算方法

分析所測不同時間點各組大鼠ST段變化值。將大鼠麻醉固定在手術臺上時，測定大鼠正常的Ⅱ?qū)?lián)結扎前5 min及結扎后10、20、30 min的Ⅱ?qū)?lián)ST段的高度。計算結扎后ST段抬高的平均數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠血清心肌酶譜五項的比較結果(表1-2)

組別nAST(U/L)LDH(U/L)HBDH(U/L)假手術組8126.0±21.6500.3±39.9224.3±29.6模型組8422.6±43.0*2801.7±273.4*807.0±89.3*活血化濁高劑量組8251.9±25.6△*1367.5±133.5△*547.5±68.1△*活血化濁中劑量組8171.3±23.7△▽*830.7±75.6△▽*357.8±42.7△▽*活血化濁低劑量組8273.0±39.2△☆*1857.2±140.7△▽☆*596.1±51.5△☆*丹參組8266.9±26.3△☆*1066.1±97.6△▽☆□*469.5±48.6△▽☆□*F 86.91 254.1 95.83P <0.05 <0.05 <0.05

注： *與假手術組比較P<0.05；△與模型組比較P<0.05 ；▽與活血化濁高劑量組比較P<0.05 ；☆與活血化濁中劑量比較P<0.05；□與活血化濁低劑量比較P<0.05.

大鼠血清心肌酶譜中AST含量檢測結果顯示，假手術組均明顯低于其余各組；模型組高于活血化濁方(高、中、低)藥物組及丹參組(P<0.05)；活血化濁方高劑量組高于中劑量組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但與低劑量組和丹參組比較無顯著性差異(P>0.05)；活血化濁方中劑量組低于低劑量組和丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低劑量組和丹參組無顯著性差異(P>0.05)。

大鼠血清心肌酶譜中LDH含量檢測結果顯示，假手術組均明顯低于其余各組；模型組高于活血化濁方(高、中、低)藥物組及丹參組(P<0.05)；活血化濁方高劑量組高于中劑量組及丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；活血化濁方中劑量組低于低劑量組及丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；活血化濁方低劑量組低于丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

大鼠血清心肌酶譜中HBDH含量檢測結果顯示，假手術組均明顯低于其余各組；模型組高于活血化濁方(高、中、低)藥物組及丹參組(P<0.05)；活血化濁方高劑量組高于中劑量組及丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與低劑量組比較無顯著性差異(P>0.05)；活血化濁方中劑量組低于低劑量組及丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；活血化濁方低劑量組高于丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

組別nCK(U/L)CK-MB(U/L)假手術組81439.3±262.6403.3±52.1模型組86954.8±934.2*2350.3±303.2*活血化濁高劑量組84780.3±575.1△*1395.6±134.4△*活血化濁中劑量組82578.5±366.9△▽*784.5±63.6△▽*活血化濁低劑量組85587.5±571.6△▽☆*1624.1±69.8△▽☆*丹參組84259.5±440.3△☆□*1266.3±107.6△☆□*F 99.99 164.91P <0.05 <0.05

注：*與假手術組比較P<0.05；△與模型組比較P<0.05；▽與活血化濁高劑量組比較P<0.05；☆與活血化濁中劑量比較P<0.05；□與活血化濁低劑量比較P<0.05.

大鼠血清心肌酶譜中CK含量檢測結果顯示，假手術組均明顯低于其余各組；模型組高于活血化濁方(高、中、低)藥物組及丹參組(P<0.05)；活血化濁方高劑量組高于中劑量組，低于低劑量組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與丹參組比較無顯著性差異(P>0.05)；活血化濁中劑量組低于低劑量組和丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；活血化濁低劑量組高于丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

大鼠血清心肌酶譜中CK-MB含量檢測結果顯示，假手術組均明顯低于其余各組；模型組高于活血化濁方(高、中、低)藥物組及丹參組(P<0.05)；活血化濁方高劑量組高于中劑量組，低于低劑量組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與丹參量組比較無顯著性差異(P>0.05)；活血化濁中劑量組低于低劑量組和丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；活血化濁低劑量組高于丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 各組大鼠心肌組織中MDA含量及SOD活性比較結果(表3)

組別nSOD(nu/mg)MDA(nmol/mg)假手術組87.44±0.411.24±0.54模型組85.06±0.20*2.41±0.27*活血化濁方高劑量組86.80±0.25△*1.75±0.53△活血化濁方中劑量組86.51±0.35△*1.58±0.79△▽

續(xù)表：

組別nSOD(nu/mg)MDA(nmol/mg)活血化濁方低劑量組85.82±0.30△▽☆*1.78±0.57△☆*丹參組85.91±0.23△▽☆*1.78±0.56△☆*F值 62.73 6.58P值 <0.05 <0.05

注： *與假手術組比較P<0.05；△與模型組比較P<0.05；▽與活血化濁高劑量組比較P<0.05；☆與活血化濁中劑量比較P<0.05.

各組大鼠心肌組織中MDA含量結果比較顯示，假手術組低于模型組、活血化濁低劑量組和丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型組高于其余各組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；活血化濁高劑量組明顯高于中劑量組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與低劑量組、丹參組之間比較無明顯差異(P>0.05)；活血化濁中劑量組低于低劑量組及丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低劑量組及丹參組之間無明顯差異(P>0.05)。

各組大鼠心肌組織中SOD含量結果比較顯示，假手術組均明顯高于其余各組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型組低于活血化濁方(高、中、低)藥物組及丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；活血化濁方高劑量組高于低劑量組和丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與中劑量組比較無顯著性差異(P>0.05)；活血化濁中劑量組高于低劑量組和丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；活血化濁低劑量組與丹參組無顯著性(P>0.05)。

2.3 各組大鼠心電圖ST段變化結果(表4)

Table 4 The rats ECG ST segment changes in different groups

注：*與假手術組比較P<0.05；△與模型組比較P<0.05；▽與活血化濁高劑量組比較P<0.05；☆與活血化濁中劑量比較P<0.05.

各組大鼠結扎前后及各組間結果比較顯示，結扎前所有實驗組之間ST段平均值差異無顯著性(P>0.05)。結扎后：假手術組ST段平均值均明顯低于其余各組；模型組高于活血化濁方(高、中、低)藥物組及丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；活血化濁方高劑量組低于低劑量組和丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與中劑量組比較無顯著性差異(P>0.05)；活血化濁中劑量組低于低劑量組和丹參組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；活血化濁低劑量組與丹參組無顯著性(P>0.05)。

3 討論

MI-R臨床上表現(xiàn)為閉塞的冠狀動脈再通、梗死區(qū)血液灌注重建一段時間內(nèi)，發(fā)生血壓驟降、心功能不全、心律失常甚至猝死的一系列病情反而惡化的現(xiàn)象。中醫(yī)認為心肌缺血(冠心病、心絞痛、心梗等)證屬“胸痹”范疇，胸痹主要病機為心脈痹阻，“活血化瘀，通脈止痛”是其中最重要的一個治療原則。黃芪健脾益氣，水蛭破血逐瘀，紅景天益氣活血、通脈平喘，紅曲活血消食降脂，四藥相合，共湊益氣降濁，活血化瘀之功效。丹參自古是活血化瘀、通經(jīng)止痛的佳品，臨床上使用的復方丹參滴丸能有效及時緩解心絞痛。中醫(yī)講“氣為血之母，血為氣之帥”“氣行則血行”，氣血的運行相輔相成。本方中不僅有活血峻藥，也配伍了益氣藥，現(xiàn)代病癥中高脂血癥亦是影響血流暢通一個重要因素，方中的紅曲能夠有效對抗高脂血癥。所以探討本方對心肌缺血再灌注后的干預作用及其機制有著重要意義。

MI-R發(fā)生后，心肌細胞會受損、壞死，心肌細胞膜通透性增加，由細胞內(nèi)流向細胞外的心肌酶會增多，心肌酶中CK、CK-MB、LDH的升高被認為是心肌損傷時重要的標志酶，用以衡量心肌損傷程度[10]。實驗中發(fā)現(xiàn)活血化濁方能減輕模型大鼠心肌損傷程度，降低血清CK、CK-MB、LDH水平，證實了該方具有抗心肌缺血及再灌注損傷的作用。

SOD是一種催化超氧化物通過歧化反應轉化為氧氣和過氧化氫酶，它可以保護機體細胞，免受氧化反應，保持正常的生理活性。心肌缺血再灌注時，會導致SOD病理性的降低，從而加劇心肌細胞氧化反應，使細胞受到破壞。MDA是膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生能加劇細胞膜的損傷，MDA的含量可以推定細胞膜的受損程度[11]。本實驗中，模型組大鼠心肌組織SOD活性水平降低、MDA含量升高，提示存在明顯心肌組織脂質(zhì)過氧化，活血化濁方高、中劑量組顯著降低了模型大鼠的MDA水平，提高了SOD活性水平，這可能是該方防治心肌缺血再灌注損傷的重要機理。

本實驗顯示，結扎后各組大鼠ST段均有不同程度的抬高，尤其以模型組的抬高最為明顯，活血化濁方藥物組及丹參組均能有效降低ST段抬高水平，但活血化濁高、中劑量組優(yōu)于丹參組。

綜上所述，活血化濁方能夠改善急性心肌缺血狀態(tài)下的心肌酶譜，增加SOD的活性，減少MDA的產(chǎn)生，以及抑制心電圖中ST段病理性抬高，保護心肌細胞免受損害。然而心肌缺血缺氧損害的機制是多方面的，本實驗肯定了活血化濁方對于心肌缺血再灌注時對心肌的保護作用，但具體機制還不夠明確，有待進一步研究。

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Intervention effect of huo xue hua zhuo prescription on myocardial ischemia reperfusion injury in rats

Pan Xia1，Cao Changxia2*

(1.Medical College of Qinghai University；2.Affiliated Hospital of Qinghai University)

Objective To discuss the intervention effect and mechanism of Huo xue hua zhuo prescription on myocardial ischemia reperfusion injury in rats.Method 48 Wistar rats were randomly divided into sham-operated group，model control group，Salviae miltiorrhizaegroup and Huo xue hua zhuo prescription high，medium，low dose groups(8 rats in each group).Rats in Salvia miltiorrhiza group were given salviae miltiorrhizae mixed suspension with dose of 1.5 g/kg；rats in Huoxue hua zhuo prescription high，medium and low dose groups were given Huo xue hua zhuo prescription mixed suspension 5.0，1.5，0.5 g/kg，all medicinal herbs were diluted with saline water to 2 ml；rats in sham-operated group and model group were given equal dose of normal saline.4 weeks after feeding all groups were performed anesthesia and thoracotomy：the sham-operated group without ligation，the rest of the groups were ligatured the left anterior descending coronary arteries by silk suture for 30 minutes，then cut the silk suture，reperfusion For 60 minutes，experimental myocardial injury(I/R)model was established.The levels of serum myocardial enzyme spectrum(CK，CK-MB，AST，HBDH，LDH)were detected.After taking some apex tissue in rats，the levels of Superoxide Dismutase(SOD)and Malondialdehyde(MDA)Were also detected.Meanwhile，the ST segment changes in electrocardiogram in each group were observed as well.Result After successfully modeling，the serum myocardial enzymes，SOD and MDA of myocardial tissue and ST segment average were changed in different degree.The CK，CK-MB，AST，HBDH，LDH levels of Huo xue hua zhuo prescription high，medium，low dose groups were significantly lower than those in the model control group.The indexes mentioned above in High，medium dose group were superior to other groups.The myocardialtissue SOD level in high，medium dose group was obviously higher thanthat of model control group and low dose group.The MDA level in salvia miltiorrhiza group was significantly lower than that of the model control group，low dose group and salvia miltiorrhiza group.The ST segment average in each group with coronary artery ligation after reperfusion showed that：Huo xue hua zhuo prescription high and medium dose group were lower than that of the model control group.But there was no significant differences in low dose group and salvia miltiorrhiza group.Conclusion Huo xue hua zhuo prescription against myocardial ischemia reperfusion rat myocardial injury has certain intervention effect.It may be related to Huo xue hua zhuo prescription can improve the myocardial enzyme spectrum of acute myocardial ischemia condition，increase the activity of SOD，to reduce the production of MDA，inhibiting the ST segment pathologically elevated and protecting the myocardial cells from injury.

ischemia reperfusion myocardium injury Huo xue hua zhuo prescription

R242

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.009

2015-10-10

潘 霞(1989～)，女，漢族，重慶籍，青海大學研究生院中西醫(yī)結合研究生 *：通信作者，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，824443911@qq.com