腺病毒介導(dǎo)TGF－β1轉(zhuǎn)基因聯(lián)合FTY720對(duì)大鼠同種異體肺移植缺血－再灌注損傷的保護(hù)作用

崔廣暉 李瑋浩 劉東雷 李宇航 梁有光 趙 松

腺病毒介導(dǎo)TGF－β1轉(zhuǎn)基因聯(lián)合FTY720對(duì)大鼠同種異體肺移植缺血－再灌注損傷的保護(hù)作用

崔廣暉 李瑋浩 劉東雷 李宇航 梁有光 趙 松

目的觀察腺病毒介導(dǎo)TGF－β1轉(zhuǎn)基因聯(lián)合FTY720對(duì)大鼠同種異體肺移植缺血－再灌注損傷（IRI）的影響。方法 采用改良的三袖套法吻合技術(shù)建立大鼠左肺原位移植模型。以SD大鼠為供受體，隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組、空白對(duì)照組、空載體對(duì)照組、TGF－β1組、FTY720組和TGF－β1＋FTY720組，每組6只。移植肺再灌注后4h，檢測各項(xiàng)生理指標(biāo)。結(jié)果 腺病毒介導(dǎo)TGF－β1轉(zhuǎn)基因組熒光現(xiàn)象顯著，并確定1×1010PFU TGF－β1基因腺病毒載體為較優(yōu)轉(zhuǎn)染濃度。肺移植再灌注后4h，與假手術(shù)對(duì)照組比較，空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組出現(xiàn)典型的移植肺IRI癥狀，肺動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）明顯降低，二氧化碳分壓（PaCO2）和濕／干重（W／D）比值明顯升高，超氧化物歧化酶（SOD）活性明顯降低，丙二醛（MDA）含量、髓過氧化物酶（MPO）活性和腫瘤壞死因子－α（TNF－α）含量明顯升高。與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組比較，TGF－β1組、FTY720組和TGF－β1＋FTY720組移植肺組織水腫和間質(zhì)炎癥等病理組織學(xué)現(xiàn)象明顯減輕，PaO2明顯上升，PaCO2和W／D比值明顯下降，SOD活性明顯增加，MDA含量、MPO活性和TNF－α含量明顯降低。其中，聯(lián)合處理組病理癥狀表現(xiàn)出更為明顯的減輕趨勢。結(jié)論腺病毒介導(dǎo)TGF－β1轉(zhuǎn)基因聯(lián)合FTY720能有效減輕大鼠同種異體肺移植IRI。

轉(zhuǎn)化生長因子－β1； FTY720； 肺移植； 缺血－再灌注； 大鼠

隨著肺移植作為一種成熟的治療方法廣泛應(yīng)用于臨床，肺移植已成為當(dāng)前公認(rèn)的治療許多終末期肺疾病的唯一有效手段。但器官移植必定伴隨著缺血－再灌注損傷（ischemia－reperfusion injury，IRI）現(xiàn)象。IRI是指移植器官在較長時(shí)間缺血造成一定損傷后，恢復(fù)血供不但不減輕或逆轉(zhuǎn)損傷，反而會(huì)加重?fù)p傷。肺移植后IRI的病理癥狀涉及肺泡－毛細(xì)血管屏障通透性增高、中性粒細(xì)胞滲出、間質(zhì)和肺泡水腫、組織炎癥和細(xì)胞死亡等。因此，開展移植肺IRI的研究仍然是肺移植領(lǐng)域中的重大課題。隨著經(jīng)驗(yàn)的積累和研究的深入，基因治療技術(shù)的發(fā)展亦為防治IRI提供了新的方法。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor beta1，TGF－β1）屬于TGF家族的一個(gè)亞家族，是一種強(qiáng)效細(xì)胞生長增殖調(diào)節(jié)蛋白，在免疫移植反應(yīng)中扮演著重要角色，已成為近年細(xì)胞、組織和器官移植的研究熱點(diǎn)［1］。FTY720是一種新型強(qiáng)效的抗移植物排斥藥物，是子囊菌（冬蟲夏草）的有效成分經(jīng)結(jié)構(gòu)改造而成［2］；作為一種人工合成的鞘氨醇結(jié)構(gòu)類似物，在鼠科模型肺損傷中有著潛在的治療性作用［3］。本實(shí)驗(yàn)通過大鼠肺移植模型，觀察TGF－β1基因療法聯(lián)合FTY720對(duì)大鼠同種異體肺移植的影響，著重于探討其在移植肺IRI中的保護(hù)作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)試劑

HEK293細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞）購自美國ATCC公司；5型腺病毒和編碼小鼠TGF－β1基因的腺病毒重組體（AdenoVec－mTGF－β1）購自美國Invivogen公司；FTY720粉劑購自瑞士Novartis藥物制劑有限公司；mTGF－β1和β－actin引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；大鼠TNF－α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自北京欣博盛生物科技有限公司。其他均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

二、腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞及滴度擴(kuò)增

接種HEK293細(xì)胞到6孔板，轉(zhuǎn)染腺病毒質(zhì)粒，鏡下熒光觀察后，用干冰甲醇浴和37℃水浴4次凍融溶解細(xì)胞。離心后獲得病毒原液，－80℃保存，可用于感染新的細(xì)胞，擴(kuò)增重組腺病毒顆粒。病毒滴度用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量法測定。

三、動(dòng)物分組及處理

供、受體均為純種Sprague－Dawley（SD）大鼠，雄性，清潔級(jí)，體重250～300g，中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用改良的三袖套法吻合技術(shù)建立大鼠左肺原位移植模型［4］，隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組、空白對(duì)照組、空載體對(duì)照組、TGF－β1組、FTY720組、TGF－β1＋FTY720組，每組6只。假手術(shù)對(duì)照組：受鼠開胸后游離左肺動(dòng)靜脈及支氣管，不行任何其他操作關(guān)胸?？瞻讓?duì)照組：左供肺離體經(jīng)肺靜脈逆行灌注4℃低鉀右旋糖酐糖液（low postassium dextran and glucose solution，LPDG）?？蛰d體對(duì)照組：左供肺離體經(jīng)肺靜脈逆行灌注含空腺病毒載體的4℃LPDG。TGF－β1基因轉(zhuǎn)染組：左供肺離體經(jīng)肺靜脈逆行灌注含TGF－β1基因重組腺病毒載體的4℃LPDG。FTY720組：受體鼠自術(shù)前3天開始至手術(shù)當(dāng)日飼喂FTY720，劑量為3mg／kg，左供肺離體經(jīng)肺靜脈逆行灌注4℃LPDG。TGF－β1基因轉(zhuǎn)染＋FTY720組：受體鼠自術(shù)前3天開始至手術(shù)當(dāng)日管飼FTY720，劑量為3mg／kg；左供肺離體經(jīng)肺靜脈逆行灌注含TGF－β1基因重組腺病毒載體的4℃LPDG。處理后置入4℃LPDG，保存3h后移入受鼠。移植肺再灌注后4h，檢測各生理指標(biāo)。

四、選取TGF－β1腺病毒重組體最適使用濃度

獲取左供肺后，TGF－β1基因轉(zhuǎn)染組離體經(jīng)肺靜脈逆行灌注含0、5×109、1×1010或3×1010PFU腺病毒載體的4℃LPDG，4℃LPDG保存3h。制作冰凍切片，使用熒光倒置顯微鏡觀察各組綠色熒光的攜帶率。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)觀察視野，重復(fù)3次，計(jì)算各組熒光強(qiáng)度的平均值，比較各組間的轉(zhuǎn)染效果。

五、檢測移植肺功能

移植肺再灌注后4h，穿刺抽取腹主動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治?，檢測移植肺動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）和二氧化碳分壓（PaCO2）。隨后處死受體鼠取樣，移植肺組織標(biāo)本分成三等分，上1／3組織備測定濕／干重（W／D）比值；中1／3組織用4%多聚甲醛內(nèi)浸泡固定，石蠟包埋，備Hematoxylin－Eosin（HE）染色；下1／3液氮固定3min后置入－80℃凍存，備ELISA和Western blot分析。

六、檢測移植肺組織W／D比值

分別取部分左肺組織，肺上沾染的血液在取標(biāo)本前用鹽水沖洗除去。用濾紙吸凈表面液體，以分析天平稱取濕重。再置入80℃的烤箱中，48h后稱取干重，計(jì)算移植肺W／D比值。

七、移植肺組織中TGF－β1mRNA水平檢測

分別取部分左肺組織，加入1mL TRIzol液，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。小鼠mTGF－β1基因上游引物：5’－CCAGATCCTG TCCAAACTAAGG－3’，下游引物：5’－CATGTTG CTCCACACTTGATTT－3’；大鼠β－actin基因上游引物：5’－ACCACAGTCCATGCCATCAC－3’，下游引物：5’－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3’。以β－actin為內(nèi)參，進(jìn)行mTGF－β1mRNA表達(dá)水平的半定量分析。

八、移植肺組織的病理組織學(xué)檢查

分別取部分左肺組織，4%多聚甲醛浸泡固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，低溫石蠟包埋、切片、HE染色后，顯微鏡下觀察并攝片。

九、測定移植肺組織中SOD活性、MDA含量和MPO活性

分別取部分移植肺組織，按1：10（W／V）的比例加入4℃KCL溶液，冰上制取10%的組織勻漿。用黃嘌呤氧化酶比色定量法檢測SOD活性，用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，化學(xué)比色法測定MPO活性，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

十、ELISA法測定移植肺組織中TNF－α的表達(dá)水平

分別取部分移植肺組織，加入粗提液（275 mmol／L氯化鈉，75mmol／L氯化鉀，l0mmol／L EDTA，100mmol／L L－精氨酸，2．5g／L吐溫－80，冰醋酸調(diào)至pH值4．0），制取組織勻漿，冰上放置1h。以12 000r／min×10min離心，上清液分裝，液氮快速冷凍后，－80℃凍存待用。采用ELSIA檢測試劑盒測定各組TNF－α的表達(dá)量。

十一、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TGF－β1基因轉(zhuǎn)染腺病毒載體濃度選擇

與對(duì)照組相比，腺病毒載體轉(zhuǎn)染組相對(duì)熒光值呈濃度依賴性增加（F＝8．325，P＝0．002），而1× 1010PFU或3×1010PFU濃度組相對(duì)熒光值差異不顯著（F＝0．626，P＝0．078）（圖1），因此本實(shí)驗(yàn)以1×1010PFU為使用濃度。

圖1 各病毒滴度組的相對(duì)熒光值比較。與PFU濃度為0組比較，①P＜0．05。

二、移植肺功能和移植肺組織W／D比值檢測結(jié)果

與假手術(shù)對(duì)照組比較，空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組PaO2明顯下降，PaCO2和W／D比值明顯上升（F＝9．627，P＝0．002）；與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組比較，TGF－β1組、FTY720組和TGF－β1＋FTY720組PaO2明顯上升，PaCO2和W／D比值明顯下降（F＝5．526，P＝0．008）（圖1、2）；而且聯(lián)合處理組表現(xiàn)出更為明顯的作用趨勢。

圖2 各組移植肺血?dú)夥治鲋笜?biāo)比較。與假手術(shù)對(duì)照組比較，①P＜0．05；與空白對(duì)照組比較，②P＜0．05。

圖3 各組移植肺W／D比值比較。1：假手術(shù)對(duì)照組；2：空白對(duì)照組；3：空載體對(duì)照組；4：TGF－β1組；5：FTY720組；6：TGF－β1＋FTY720組與假手術(shù)對(duì)照組比較，①P＜0．05；與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組比較，②P＜0．05。

三、移植肺組織中TGF－β1mRNA表達(dá)水平

與預(yù)期結(jié)果相符，以大鼠特異性β－actin（452bp）為內(nèi)參，TGF－β1組和TGF－β1＋FTY720組出現(xiàn)了小鼠特異性的mTGF－β1RNA擴(kuò)增條帶（350bp），而假手術(shù)對(duì)照組、空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組基本不表達(dá)（圖4）。此外，與單獨(dú)腺病毒介導(dǎo)TGF－β1轉(zhuǎn)基因組相比，聯(lián)合作用組TGF－β1mRNA水平有所增加（F＝12．828，P＝0．001）。

圖4 各組移植肺組織TGF－β1mRNA的表達(dá)水平比較。1：假手術(shù)對(duì)照組；2：空白對(duì)照組；3：空載體對(duì)照組；4：TGF－β1組；5：FTY720組；6：TGF－β1＋FTY720組。與假手術(shù)對(duì)照組比較，①P＜0．05

四、移植肺組織的病理組織學(xué)檢測結(jié)果

病理切片觀察顯示，移植再灌注4h后，與假手術(shù)對(duì)照組比較，空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組肉眼見移植肺彈性差，肺泡間隔明顯增厚、水腫，呈較為嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間質(zhì)淤血腫脹明顯，部分肺泡腔內(nèi)有較明顯的滲出；與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組比較，TGF－β1組、FTY720組和TGF－β1＋FTY720組病變程度較輕微，肺泡間質(zhì)水腫明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少，肺泡腔內(nèi)滲出減少；而且聯(lián)合處理組病理癥狀的減輕效果更為顯著（圖5）。

五、移植肺組織中SOD、MPO、MDA和TNF－α檢測結(jié)果

與假手術(shù)對(duì)照組比較，空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組SOD活性明顯降低（F＝2．436，P＝0．022），MDA含量、MPO活性和TNF－α含量明顯增加（F＝4．421，P＝0．011）；與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組比較，TGF－β1組、FTY720組和TGF－β1＋FTY720組SOD活性明顯增加（F＝6．895，P＝0．006），MDA含量、MPO活性和TNF－α含量則明顯降低（F＝4．228，P＝0．025）（圖5）；而且聯(lián)合處理組表現(xiàn)出一定更為明顯的作用趨勢（圖6）。

圖5 各組移植肺組織HE染色（×200）。A：假手術(shù)對(duì)照組；B：空白對(duì)照組；C：空載體對(duì)照組；D：TGF－β1組；E：FTY720組；F：TGF－β1＋FTY720組

圖6 各組移植肺組織MDA、SOD、MPO和TNF－α水平比較。與假手術(shù)對(duì)照組比較，①P＜0．05；與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組比較，②P＜0．05

討 論

在臨床上，肺移植的進(jìn)展大大落后于其他器官，其中一個(gè)重要制約因素是肺移植后IRI。移植肺IRI一直是導(dǎo)致術(shù)后早期死亡、肺移植失敗的主要原因之一，致死率達(dá)16%～25%［5］。因此，對(duì)移植肺IRI機(jī)制進(jìn)行研究，尋找有效方法預(yù)防和減輕移植肺IRI，有著重要的臨床意義。

肺組織所特有的肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞具有較高的ATP代謝系統(tǒng)，對(duì)缺血、缺氧較為敏感［6］。肺移植過程中，缺血、缺氧激活巨噬細(xì)胞，分泌炎癥細(xì)胞因子，損傷肺血管內(nèi)皮，導(dǎo)致肺水腫，并引起肺組織RI的病理改變；而TNF－α是肺IR過程中引起肺組織細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)的一種重要細(xì)胞因子［7］。移植肺IRI程度常用以下指標(biāo)來反映：（1）W／D比值反映肺功能損傷的程度，是由肺缺血引起肺毛細(xì)血管通透性增加和肺泡毛細(xì)血管膜破壞而導(dǎo)致的肺水潴留情況；（2）MPO活性間接反映肺內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤程度；（3）MDA含量是判定氧自由基造成膜脂質(zhì)過氧化損傷的指標(biāo)之一。肺移植過程產(chǎn)生大量的氧自由基，觸發(fā)脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生許多中間產(chǎn)物及其終產(chǎn)物MDA。該過程引起一系列毒性細(xì)胞內(nèi)連鎖反應(yīng)，如脂膜氧化、細(xì)胞器破壞、核酸破壞、細(xì)胞內(nèi)各種酶失活，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和肺組織損傷；④SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。移植肺IRI過程中產(chǎn)生大量自由基，SOD消耗增加，更加重脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生更多中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物MDA［8］。因此，降低移植肺IRI主要從這幾個(gè)方面入手，也是促進(jìn)臨床肺移植研究進(jìn)展的必然策略。

TGF－β1是一種強(qiáng)大的多功能免疫抑制因子，在器官移植免疫中起重要作用。TGF－β1表達(dá)可減輕腎臟移植IRI［9］，抑制IRI引發(fā)的心臟成纖維細(xì)胞凋亡［10］。目前，普遍認(rèn)為TGF－β1與移植肺IRI亦有密切關(guān)系［11，12］。FTY720能特異性作用于胸腺細(xì)胞和淋巴細(xì)胞細(xì)胞膜受體，具有抑制炎癥作用［13］；作為一種新型強(qiáng)效移植免疫抑制劑［14］，具有減輕大鼠肝、腎、心臟IRI的作用［15－17］。本課題進(jìn)一步采用腺病毒介導(dǎo)TGF－β1轉(zhuǎn)基因和FTY720聯(lián)合作用的方法對(duì)移植肺IRI保護(hù)作用進(jìn)行相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植肺再灌注4h后出現(xiàn)典型的肺IRI的病理改變，導(dǎo)致低氧血癥等。而單獨(dú)腺病毒介導(dǎo)TGF－β1轉(zhuǎn)基因方法和單獨(dú)FTY720作用，以及兩者聯(lián)合處理，均能減輕大鼠同種異體肺移植IRI，升高PaO2，降低PaCO2和W／D比值，減輕移植肺組織學(xué)病理癥狀，增加SOD活性，降低MDA含量、MPO活性和TNF－α含量；雖然聯(lián)合處理組沒有表現(xiàn)出更為顯著的差異，但是在減輕移植肺IRI損傷上表現(xiàn)出一定更為明顯的作用趨勢。

有報(bào)道稱在大鼠肺移植中，腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法和FTY720聯(lián)合使用會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，使前者的表達(dá)持續(xù)時(shí)間和移植物存活時(shí)間顯著延長［18］。本研究亦發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720作用使TGF－β1mRNA水平有所增加。這些數(shù)據(jù)均提示提高移植肺TGF－β1表達(dá)水平和術(shù)前移植受體大鼠飼喂FTY720均能降低移植肺IRI，并且二者可能具有協(xié)同作用，該機(jī)制可能與增加SOD活性，降低MDA含量、MPO活性和TNF－α含量等有關(guān)，這無疑為今后提高肺移植療效提供了一條更為高效的可能途徑。

綜上所述，本研究以大鼠同種異體左肺原位移植為動(dòng)物模型，以復(fù)制缺陷的5型重組腺病毒載體為介導(dǎo)，對(duì)移植供肺進(jìn)行基因修飾，發(fā)現(xiàn)離體經(jīng)肺靜脈法轉(zhuǎn)染目的基因是可行的。而且TGF－β1和FTY720預(yù)處理均能降低移植肺IRI，提高移植術(shù)后早期肺功能，兩者聯(lián)合處理具有更優(yōu)的協(xié)同作用趨勢，期望為今后減輕移植肺IRI和改善移植術(shù)后早期肺功能提供一種有效的治療策略。但有關(guān)TGF－β1和FTY720在移植肺IRI中的協(xié)同保護(hù)機(jī)制仍需我們更深入地研究。

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Effects of adenovirus－mediated TGF－β1gene transfection combined with FTY720 administration on ischemia－reperfusion injury of rat lung allografts

Cui Guanghui，Li Weihao，Liu Donglei，Li Yuhang，Liang Youguang，Zhao Song．Department of Thoracic Surgery，The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China
Correspongding auther；Zhao Song，Email：13673665008＠163．com

ObjectiveTo investigate the effects of adenovirus－mediated transforming growth factor beta1（TGF－β1）gene transfection combined with FTY20administration on ischemia－reperfusion injury（IRI）of rat lung allografts．Methods By using improvedcuff－like＂vessel anastomosis technique，rat orthotopic left pulmonary allograft transplantation was successfully established．SD rats were chosen as both recipients and donors，and were randomly divided into sham operation control group，blank control group，empty adenovirus control group，TGF－β1group，F(xiàn)TY720group and TGF－β1＋FTY720 group，with 6rats in each group．Physiological indexes of each group were assessed 4hafter reperfusion．Results The fluorescence phenomenon accompanied with TGF－β1adenovirus－mediated gene transfection was remarkable，and 1×1010PFU was chosen as the optimal transfection concentration．Four hours after reperfusion of lung transplantation，compared with sham operation control group，the typical pathological change of IRI was found in blank control group and empty adenovirus control group，the partial pressure of oxygen（PaO2）levels were significantly reduced，partial pressure of carbon dioxide（PaCO2）levels and weight／dry（W／D）ratios were significantly increased，superoxide dismutase（SOD）activity was significantly decreased，and malondialdehyde（MDA）contents，myeloperoxidase（MOP）activity and tumor necrosis factor－α（TNF－α）contents were significantly increased．Compared with blank control group and empty adenovirus control group，the histopathological manifestations such as tissue edema and interstitial inflammation were much milder in TGF－β1group，F(xiàn)TY720group and TGF－β1＋FTY720group，PaO2levels were significantly higher，PaCO2levels and W／D ratios were significantly lower，SOD activity was significantly higher，and MDA contents，MPO activity and TNF－αcontents were significantly lower．The effect in combined treatment group exhibited a certain more remarkable alleviating tendency．Conclusions Adenovirus－mediated TGF－β1gene transfection combined with FTY20 administration could effectively ameliorate the IRI of rat lung allografts．

transforming growth factor beta1； FTY720； lung transplantation； ischemia reperfusion； rat

2016－02－05）

（本文編輯：周珠鳳）

10．3877／cma．j．issn．2095－8773．2016．03．09

450052 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科

趙松，Email：13673665008＠163．com

崔廣暉，李瑋浩，劉東雷，等．腺病毒介導(dǎo)TGF－β1轉(zhuǎn)基因聯(lián)合FTY720對(duì)大鼠同種異體肺移植缺血－再灌注損傷的保護(hù)作用［J／CD］．中華胸部外科電子雜志，2016，3（3）：170－176．