海洋微藻保存方法的研究進(jìn)展

張文慧，高金偉，姜智飛，范耘碩，周文禮

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

海洋微藻保存方法的研究進(jìn)展

張文慧，高金偉，姜智飛，范耘碩，周文禮通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

本文綜述了海洋微藻保存常用方法，主要有繼代保存法、低溫冷凍保存技術(shù)、超低溫保存技術(shù)、斜面保存法及脫水包埋法。繼代保存法操作簡(jiǎn)單，保存時(shí)間短；斜面保存易攜帶，但瓊脂收縮后藻細(xì)胞容易變形；低溫冷凍保存操作簡(jiǎn)便，相對(duì)保存時(shí)間較短；超低溫保存法適合藻類的長(zhǎng)期保存；包埋脫水保存技術(shù)操作簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的設(shè)備，不使用抗凍保護(hù)劑，但是，目前仍需要解決預(yù)培養(yǎng)條件、脫水速率、膠球含水量等關(guān)鍵技術(shù)問題。此外，本文概述了當(dāng)前海洋微藻保存研究的進(jìn)展及其保存的意義，為藻種的保存研究提供一定的基礎(chǔ)。

保存技術(shù)；研究進(jìn)展；保存意義

海洋微藻中所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)十分豐富，除了含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、色素等，還富含EPA和DHA[1]。在育苗方面，海洋微藻是魚、蝦、貝等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良好的餌料，且具有良好的分散性和保型性[2]，這是人工餌料所不具備的。除此之外，有些微藻還可以作為優(yōu)良的飼料添加劑和環(huán)境改良劑[3]。但是，在微藻的培育過程中，由于藻類的生長(zhǎng)周期較短，容易被其他藻種、細(xì)菌等污染。因此，在保存過程中，減少接種次數(shù)，防止微藻被染，找到一種既能長(zhǎng)期保存藻種，又能維持藻種活性的方法十分必要。目前，我國(guó)微藻保存技術(shù)比較薄弱，現(xiàn)有的微藻種類有限，沒有適當(dāng)?shù)谋４娣椒ǘ鴹壷迷宸N，使微藻資源浪費(fèi)，在不同程度上限制微藻生物技術(shù)的發(fā)展[4]。近幾年，我國(guó)在海洋微藻藻種的保存方面取得了一定的進(jìn)展[5-8]。本文綜述了藻種保存的幾種方法及展望，旨在為科研工作者提供參考。

1 藻種保存研究進(jìn)展及其意義

海洋微藻的培養(yǎng)周期比較短，在培育海洋微藻過程中，容易被其他藻種、細(xì)菌所污染。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，由于藻類繁殖迅速，需要頻繁接種，導(dǎo)致剩余藻種浪費(fèi)，因此，急需找到合適的方法長(zhǎng)期保存微藻。盡管國(guó)內(nèi)外很早開始研究海洋微藻，但是，海洋微藻的保存工作從20世紀(jì)初期才開始，目前，國(guó)際著名的海洋微藻保存機(jī)構(gòu)有CCAP、SAG、UTEX、COBRA，已保存海洋微藻2 000多種[9]。但是，每種藻類都有其各自特殊的生態(tài)條件，保存藻類的方法也各有不同，需要在具體的研究、工作中更詳細(xì)的探究。

2 藻種保存常用技術(shù)

2.1 繼代保存法

繼代保存法是目前采用的最普遍的藻種保存方法，是在常溫或低常溫條件下保存，常溫指15～25 ℃，常低溫指0～15 ℃，光照為6 μmol/（m2· s）。將海洋微藻接種在液體培養(yǎng)基中，先在適宜的溫度、光強(qiáng)下培養(yǎng)，待微藻生長(zhǎng)到一定密度后，將其轉(zhuǎn)移到低溫、弱光條件下保存。繼代保存法操作簡(jiǎn)單，但是保存時(shí)間短，繼代頻繁，藻種容易被污染。

2.2 低溫冷凍與超低溫保存

在4 ℃的低溫條件下，微藻細(xì)胞的細(xì)胞活力和生化活力均會(huì)下降，在此條件下保存微藻，可保存半年左右，可減少藻種的接種次數(shù)。一般情況下，將藻液移至離心管內(nèi)，封口膜封好，置于4～5 ℃冰箱中保存。保存前，還可以將藻液離心，得到高密度的藻濃縮液后保存。利用低溫冷凍方式保存的藻種，在更新接種時(shí)，需要15～20 d方才能正常生長(zhǎng)。研究表明，4 ℃保存小球藻不宜超過6周[10]；三角褐指藻保存的最佳溫度為0～10 ℃[11]；有低溫保存前后藻中高度不飽和脂肪酸（HUFA）的含量變化不明顯[12]；三角褐指藻在-20 ℃下保存20 d后，重新培養(yǎng)2 d即能恢復(fù)正常生長(zhǎng)、繁殖[13]；海鏈藻在4、-4及-20 ℃保存時(shí)，蛋白質(zhì)和糖的含量均會(huì)下降，且下降幅度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，脂肪含量下降不明顯[14]。冷凍保存可保存細(xì)胞活力，在一定程度上抑制生物細(xì)胞的生化活性，能有效解決藻種保存過程中污染、混雜及變異，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存。

超低溫保存，又稱冰凍保存，通常用液態(tài)氮作為冷媒[15]。在此溫度下，藻類的物質(zhì)代謝和生長(zhǎng)活動(dòng)幾乎完全停止，但仍處于可逆的成活狀態(tài)。超低溫保存最開始使用一步法，即在濃縮的藻液中加入甘油或DMSO（二甲基亞砜）后，直接投入液氮中保存。此方法只適用于少數(shù)微藻的保存，對(duì)含水量較高的藻類不適用。

之后，在一步法的基礎(chǔ)上，研究出兩步法的保存方法，先對(duì)保存的藻種進(jìn)行預(yù)處理，加入抗凍保護(hù)劑，一般用二甲基亞砜（DMSO）、甘油和甲醇，濃度5％～15％。處理后的藻液放到凍存管里，按照0.5～4 ℃/min的降溫速度，在-30～-60 ℃的溫度下欲凍0～60 min后，迅速轉(zhuǎn)移到液氮中保存。

超低溫保存可以長(zhǎng)期保持生物遺傳穩(wěn)定性，不僅可以對(duì)藻種進(jìn)行優(yōu)勝劣汰的選擇，還能最大限度地減少藻種的污染，是當(dāng)前長(zhǎng)期保存藻種最為有效的方法。有研究表明[16]，超低溫冷凍保存可以使7屬9種微藻的22個(gè)品系的微藻存活5～8年。但是，目前藻類種類繁多，生理狀態(tài)不同，因此，每種微藻保存的方法不一樣，加入的抗凍劑的種類和濃度也不盡相同[17]。超低溫保存研究目前只取得了初步的成果，許多問題尚需解決，例如，超低溫保存條件沒有一套標(biāo)準(zhǔn)的方法，一般建立在經(jīng)驗(yàn)之上，增加實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，浪費(fèi)人力物力，增加保存成本等，需要更多進(jìn)一步的研究。

2.3 斜面保存

在微藻的培養(yǎng)液中加入0.7％～1％的瓊脂，制成瓊脂斜面固體培養(yǎng)基，制作固體培養(yǎng)基時(shí)，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度應(yīng)該在正常配方的基礎(chǔ)上增加一倍。用平板劃線的方法將藻種接種在固體培養(yǎng)基上，接種后的藻種，先置于適宜的環(huán)境下培養(yǎng)，待藻細(xì)胞達(dá)到一定密度后，在固體培養(yǎng)基上會(huì)形成藻種群落，肉眼可看到明顯的條狀或塊狀的藻細(xì)胞群，而后，將固體培養(yǎng)基移至低溫、弱光條件下或置于冰箱中保存。一般情況下，斜面保存可保存1年左右，如果每天讓藻種接受短時(shí)間弱光照射，可保存2～3年。

斜面保存方法操作簡(jiǎn)便，體積小，便于攜帶，是目前比較常用的保存方法，但瓊脂斜面放置時(shí)間過長(zhǎng)后，容易干燥收縮，造成藻細(xì)胞變形，因此，在重新接種的時(shí)候需要較長(zhǎng)的時(shí)間。

2.4 包埋脫水保存

包埋保存主要是對(duì)微藻進(jìn)行蔗糖預(yù)培養(yǎng)，運(yùn)用細(xì)胞固定化方法的原理，將海洋微藻包埋在褐藻膠基質(zhì)中，使其固定化，之后適度脫水，進(jìn)行超低溫保存[18]。

包埋脫水法將海洋微藻包埋在褐藻酸鈣中，然后，置于高濃度的蔗糖培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，繼而用無菌空氣流或硅膠進(jìn)行脫水，最后置于液氮中保存。膠囊化可以較大限度的保護(hù)海洋微藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，使之不會(huì)因試驗(yàn)過程中溫度的急劇變化而遭受破壞。脫水是將膠囊化材料的含水量降到一定程度，之后再投入液氮中保存，脫水方法有多種，常用的有直接干燥脫水、高濃度蔗糖預(yù)處理、硅膠吸附脫水等方法。

使用蔗糖處理是為了提高細(xì)胞質(zhì)的濃度，增加其抗凍力和脫水力，以促進(jìn)降溫過程中玻璃化的形成。在蔗糖的使用過程中，既可以先將藻類包埋再進(jìn)行高濃度的蔗糖培養(yǎng)，也可以先用高濃度的蔗糖培養(yǎng)再進(jìn)行包埋，大部分研究會(huì)使用前者。使用蔗糖培養(yǎng)的時(shí)間與海洋微藻的種類、蔗糖的濃度有關(guān)，基本上遵循既使樣品獲得高的抗凍力和脫水力、又不能引起微藻細(xì)胞太多的高滲損傷的原則。包埋脫水保存法減少了低溫冷藏過程中冰晶的產(chǎn)生量，快速升溫融解時(shí)阻止了冰晶的再生，從而減少對(duì)微藻細(xì)胞的傷害。

包埋脫水法在低溫冷藏過程中可減少冰晶的產(chǎn)生，在快速升溫溶解過程中可阻止冰晶再生[19]，使海洋微藻細(xì)胞獲得了較高的抗凍力，提高了保存效果，降低遺傳變異的可能性。此技術(shù)操作簡(jiǎn)單，無需復(fù)雜的設(shè)備，不使用抗凍保護(hù)劑。但目前仍需要解決預(yù)培養(yǎng)條件、脫水速率、膠球含水量等關(guān)鍵技術(shù)問題。

3 展望

單細(xì)胞藻類保存在實(shí)際研究與生產(chǎn)中具有重要的實(shí)際意義，但是，保存技術(shù)尚未成熟與穩(wěn)定。目前，對(duì)微藻的研究集中在生理生態(tài)水平和分子水平，基礎(chǔ)的研究有待加強(qiáng)，許多問題有待進(jìn)一步研究，例如，藻種是否可以保存更長(zhǎng)的時(shí)間；大多數(shù)微藻保存均需要抗凍保護(hù)劑，傳統(tǒng)的抗凍保護(hù)劑有一定的毒性，目前新的抗凍保護(hù)劑有抗凍蛋白（AFP）和冰結(jié)合蛋白（IBF），抗凍蛋白的性質(zhì)與冰晶結(jié)構(gòu)相似，可降低冰晶的生長(zhǎng)速度，冰結(jié)合蛋白可抑制再結(jié)晶，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜的作用[20]，但抗凍劑的用量仍需進(jìn)一步的研究。

[1] 劉杰，崔建升，田程，等. 微藻保存技術(shù)[J]. 中國(guó)水產(chǎn)，2010（5）：52-53.

[2] 張帆，韓笑天，李巋然，等. 微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)及應(yīng)用[J].海洋科學(xué)，2012，36（1）：117-124.

[3] 項(xiàng)文鈺，吳玉梁，沈頌東. 微藻冷凍保藏的研究[J]. 水利漁業(yè)，2004，24（3）：23-24.

[4] 蔡卓平，李燕璇，段舜山，等. 微藻種質(zhì)資源的采集及保存現(xiàn)狀[J]. 生態(tài)科學(xué)，2014，33（2）：396-400.

[5] 胡蓓娟，王雪青，吳晶晶，等. 8種微藻的保存方法研究[J]. 海洋湖沼通報(bào)，2008（1）：58-65.

[6] 董光宇. 包埋——脫水法常溫和低溫保存兩種綠藻的研究[D]. 大連：遼寧師范大學(xué)，2009.

[7] 王歡. 包埋——脫水法常溫和低溫保存兩種等鞭金藻的研究[D]. 大連：遼寧師范大學(xué)，2009.

[8] 張躍群，石斌，陸德祥，等. 3種優(yōu)質(zhì)海洋微藻的低溫保存研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（6）：314-317.

[9] 張玉榮，李大鵬，于子山. 大型海藻種質(zhì)保存的原理和方法[J]. 海洋科學(xué)，2009，33（7）：107-112.

[10] 陳煒，王秀芬，白永安，等. 濃縮方法及保存條件對(duì)小球藻藻膏脂肪酸的影響[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27（1）：1-5.

[11] 朱明，閻斌倫，滕亞娟，等. 三角褐指藻濃縮液長(zhǎng)期保存技術(shù)研究[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào)，2003，30（6）：246-249.

[12] 王培磊，宮慶禮，麥康森，等. 兩種海洋單胞藻濃縮與保存效果的研究[J]. 海洋湖沼通報(bào)，2001（4）：12-19.

[13] 孫建華，王如才，趙強(qiáng). 高濃度小新月菱形藻保存方法的研究[J]. 海洋學(xué)報(bào)（中文版），1998，20（2）：108-112.

[14] 岳偉萍. 不同絮凝劑和保存溫度對(duì)海鏈藻營(yíng)養(yǎng)成分的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2013，32（1）：46-49.

[15] 王起華，張恩棟，周春影. 藻類種質(zhì)超低溫保存研究概況[J]. 植物學(xué)通報(bào)，2002，19（1）：21-29.

[16] 馬志珍，武振彬. 建立微藻超低溫保存種質(zhì)庫(kù)的技術(shù)及意義[J]. 國(guó)外水產(chǎn)，1993（1）：1-5.

[17] 王伯春. 幾種低溫保護(hù)劑溶液玻璃化特性的分子模擬及機(jī)理分析[D]. 上海：上海理工大學(xué)，2011.

[18] 薄巖. 包埋——脫水法常溫和低溫保存兩種餌料硅藻的研究[D]. 大連：遼寧師范大學(xué)，2009.

[19] 周衛(wèi)征，霍書豪，朱順妮，等. 微藻固定化技術(shù)及其在資源化中應(yīng)用[J]. 可再生能源，2011，29（4）：90-94.

[20] Christner B C. Bioprospecting for microbial products that affect ice crystal formation and growths[J].Appl Microbiol Biotechnol，2010，85（3）：481-489.

The Preservation Technology of Marine Microalgae

ZHANG Wen-hui, GAO Jin-wei, JIANG Zhi-fei, FAN Yun-shuo, ZHOU Wen-liCorrespondingAuthor
（Tianjin Key Laboratory of Aqua-ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

The paper summarizes several methods to preserve the marine microalgae, including succeeding preservation, cryopreservation technology at low temperature, the cryopreservation technique, save method and the embedding method of dehydration. Succeeding preservation is simple to operate, but the time is not long; agar slant is convenient to carry, but the aglae cells is out of shape easily after the agar shrink; cryopreservation technology at low temperature is also simple but the time is not long; the cryopreservation technique is suit to preservation for a long time; the embedding method of dehydration do not need the Complicated equipment and Cryoprotectant, but we should solve the key technical problems of culture conditions, dehydration rate and rubber ball water content. And provides an overview of the progress and significance of the research.

the preservation technology; the progress of the research; the significance

S931.1

A

1008-5394（2016）04-0055-03

2015-12-22

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目“海水魚工廠化健康養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)示范與推廣”（2013GA610002）；農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金“蛋白核小球藻CGF對(duì)環(huán)境因子脅迫響應(yīng)及分子機(jī)理研究”（NYJG201508）

張文慧（1991-），女，河北保定人，碩士在讀，主要從事漁業(yè)資源保護(hù)與環(huán)境修復(fù)研究。E-mail：773765349@qq.com。

周文禮（1969-），男，山東濟(jì)寧人，研究員，博士，主要從事水域生態(tài)學(xué)和微藻資源化利用研究。E-mail：saz0908@126.com。