基于特異性生物識(shí)別分子的黃曲霉毒素快速分析方法研究進(jìn)展

曾昆 杜道林 薛永來

（江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院 江蘇大學(xué)環(huán)境生態(tài)研究所，鎮(zhèn)江 212013）

基于特異性生物識(shí)別分子的黃曲霉毒素快速分析方法研究進(jìn)展

曾昆 杜道林 薛永來

（江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院 江蘇大學(xué)環(huán)境生態(tài)研究所，鎮(zhèn)江 212013）

黃曲霉毒素是黃曲霉菌和寄生曲霉菌分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，容易污染糧食作物及其制品，主要存在于發(fā)霉的糧食、豆類、堅(jiān)果及與其相關(guān)食品中。黃曲霉毒素，具有極強(qiáng)的毒性和致癌性，尤其是黃曲霉毒素B1，是目前已發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的天然致癌物質(zhì)，嚴(yán)重威脅人類健康。目前食品中黃曲霉毒素的檢測(cè)以高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用等儀器分析方法為主，然而儀器分析方法具有設(shè)備昂貴、操作繁瑣、需要專業(yè)人員等不足。近年來以特異性生物分子（抗體、重組抗體、適配體等）識(shí)別黃曲霉毒素，并結(jié)合不同的信號(hào)報(bào)告分子，建立了一系列黃曲霉毒素分析方法，檢測(cè)快速、靈敏并易于操作，在食品安全領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。著重從黃曲霉毒素的生物識(shí)別分子和信號(hào)報(bào)告分子兩方面介紹目前黃曲霉毒素的快速檢測(cè)手段，并對(duì)其進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)，同時(shí)對(duì)黃曲霉毒素快速檢測(cè)方法的發(fā)展方向進(jìn)行展望。

黃曲霉毒素；抗體；適配體；快速分析

黃曲霉毒素是一類由黃曲霉菌（Aspergiuus flavus）和寄生曲霉菌（Aspergiuus parasiticus）產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的總稱［1］，主要存在于發(fā)霉的糧食、豆類和堅(jiān)果等中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有20多種。由于黃曲霉毒素在紫外燈照射下可以發(fā)出熒光，根據(jù)熒光顏色的不同，分為B（blue）和G（green）兩大類［2］。常見的污染農(nóng)產(chǎn)品的黃曲霉毒素主要有黃曲霉毒素B1（aflatoxinB1，AFB1）、黃曲霉毒素B2 （aflatoxinB2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxinG1，AFG1）、黃曲霉毒素G2（aflatoxinG2，AFG2），以及代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素M1（aflatoxinM1，AFM1）、黃曲霉毒素M2（aflatoxinM2，AFM2），其中飼料中污染的黃曲霉毒素是AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，而AFM1和AFM2是哺乳動(dòng)物食用了黃曲霉毒素污染的飼料所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，因此常見于牛奶中［3］。

黃曲霉毒素，尤其是AFB1，毒性極強(qiáng)，其毒性是氰化鉀的10倍，是砒霜的68倍［4］。同時(shí)，黃曲霉毒素還是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)致癌物質(zhì)，其致癌力是奶油黃的900倍，是3，4-苯并芘誘發(fā)肝癌能力的4 000倍［5］，1993年，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為已知最強(qiáng)致癌化學(xué)物質(zhì)之一，即Ⅰ類致癌物質(zhì)［6，7］。世界上已有100多個(gè)國(guó)家制定了食品中黃曲霉毒素的檢測(cè)［8］。目前黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)主要有3大類，分別針對(duì)AFB1、AFM1以及黃曲霉毒素總（AFB1+AFB2+AFG1+AFG2）。對(duì)于AFB1，歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)為2 μg/kg，我國(guó)國(guó)標(biāo)（GB 2761-2011）規(guī)定AFB1的殘留限量為0.5 μg/kg（嬰幼兒食品）和5-20 μg/kg（糧食、豆類、堅(jiān)果等）；對(duì)于AFM1，歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.05 μg/kg，我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為0.5 μg/kg；歐盟規(guī)定黃曲霉毒素總量的標(biāo)準(zhǔn)為4 μg/kg，我國(guó)并沒有對(duì)黃曲霉總量作出規(guī)定。

黃曲霉毒素的分析方法主要有化學(xué)分析方法、儀器分析方法、免疫分析方法等。其中化學(xué)方法，如薄層層析法，盡管操作簡(jiǎn)便，但由于其特異性差、靈敏度低等不足，近年來已較少應(yīng)用；以高效液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)為主的儀器分析方法，靈敏度高、特異性強(qiáng)，被列為我國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T18979-2003），然而該方法需要對(duì)樣本進(jìn)行凈化，并且操作繁瑣，需要專業(yè)的人員，并不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。以抗原抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的免疫分析方法，因其操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全快速檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，具有與傳統(tǒng)抗體類似功能的其他特異性生物識(shí)別分子，如重組抗體、適配體等已被報(bào)道，并且借助免疫分析方法的模式，建立了一系列的快速、靈敏的分析方法，用于黃曲霉毒素快速檢測(cè)。為更加系統(tǒng)和全面地了解目前黃曲霉毒素快速分析方法的發(fā)展現(xiàn)狀，本文對(duì)目前報(bào)道的黃曲霉毒素特異性識(shí)別分子以及各種分析方法在黃曲霉毒素檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)該領(lǐng)域的發(fā)展方向提出展望。

1　黃曲霉毒素生物識(shí)別分子

生物識(shí)別分子是快速生物檢測(cè)方法建立的核心，特異性的抗體是目前快速分析方法中最為常用的識(shí)別分子。常規(guī)的抗體制備方法需要大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并且免疫周期長(zhǎng)，能夠較好識(shí)別小分子的抗體并不容易獲得。隨著分子生物學(xué)技術(shù)以及材料科學(xué)的發(fā)展，與抗體具有類似功能的新型識(shí)別分子——重組抗體、核酸適配體、分子印跡等，被制備或合成，并引入到生物檢測(cè)領(lǐng)域。

1.1抗體

以抗原-抗體特異結(jié)合為基礎(chǔ)的免疫分析方法，在快速檢測(cè)領(lǐng)域占據(jù)主導(dǎo)地位?？贵w的特性直接影響分析方法的性狀。當(dāng)前報(bào)道的識(shí)別黃曲霉素抗體包括特異性抗體和廣譜性抗體兩大類，前者僅識(shí)別單一目標(biāo)物，后者則可以結(jié)合結(jié)構(gòu)類似的一類化合物。

1.1.1特異性抗體 張道宏等（Zhang）［9］獲得一株特異識(shí)別AFB1的單克隆抗體3G1，親和力為1.8×10-8L/mol，IC50達(dá)到1.6 ng/mL，與AFB2、AFG1、AFG2的交叉反應(yīng)率分別為6.4％、＜0.02％和＜0.02％。管迪等［10］篩選到一株特異性識(shí)別AFM1的單克隆抗體2C9，親和力為1.74×10-9L/mol，在牛奶中IC50達(dá)到67 ng/L，與AFB1、AFB2、AFG1、AFG2無交叉反應(yīng)。Min等［11］制備了AFB1的單克隆抗體2C12，平衡解離常數(shù)（Equilibrium dissociation constants，Kd）為6.95×10-9mol，IC50達(dá)到8 ng/mL，與AFB2、AFG1、AFG2和AFM1的交叉反應(yīng)率分別為1.5％、4％、0.1％和0.4％，與AFM2、赭曲霉毒素（ochratoxins，OTA）、伏馬毒素（fumon-isins，F(xiàn)MB1）、FMB2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、T-2毒素等的交叉反應(yīng)率均低于0.01％。

1.1.2廣譜性抗體 張道宏等［12］通過兩步法篩選到5株廣泛識(shí)別黃曲霉毒素的單克隆抗體，經(jīng)進(jìn)一步驗(yàn)證，其中1C11具有最高的靈敏度，對(duì)AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1的IC50分別為1.2、1.3、2.2、18.0和13.2 pg/mL。李培武等（Li）［13］以AFG2作為競(jìng)爭(zhēng)物，篩選到3株黃曲霉毒素廣譜性抗體，針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和AFM1，8E11交叉反應(yīng)率分別為100％、20.9％、88.4％、78.1％和87.6％；8F6交叉反應(yīng)率分別為100％、103.8％、100.1％、47.0％和65.0％；10C9交叉反應(yīng)率分別為100％、93.6％、95.4％、65.2％和70.9％。且IC50在1.25-5.99 ng/mL。

Liu等［14］采用EDC法合成抗原AFB1-CMOBSA，制備兩株單克隆抗體3F6G11和9C7C11，對(duì)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2均有較好的識(shí)別能力，采用直接競(jìng)爭(zhēng)法鑒定，3F6G11對(duì)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的IC50分別為0.051、0.050、1.820 和1.270 ng/mL，9C7C11對(duì)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的IC50分別為0.045、0.057、2.530和2.120 ng/mL。Liu等［15］采用EDC法合成抗原AFB1-CMOBSA，免疫兔子，獲得AFB1多克隆抗體，經(jīng)直接ELISA方法鑒定該抗體對(duì)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的IC50分別為0.15、0.55、0.32和3.83 ng/mL。Wang等［16］合成AFM1-CMO-BSA完全抗原，免疫兔子獲得AFM1多克隆抗體，該抗體對(duì)AFM1和AFB1的IC50分別為0.014和0.02 ng/mL。

1.2重組抗體

1994年出現(xiàn)的基因工程抗體，可以根據(jù)研究的需要在基因水平對(duì)免疫球蛋白進(jìn)行切割、拼接或修飾，進(jìn)而通過體外表達(dá)方式產(chǎn)生重組抗體［17］。相對(duì)于傳統(tǒng)抗體，重組抗體具有庫容量大（＞106）、避免使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、增加特異性和親和力等優(yōu)點(diǎn)，在快速診斷領(lǐng)域有較廣泛的應(yīng)用［18］。

Moghaddam等［19］在噬菌體抗體庫中篩選到15株單鏈抗體（single-chain variable fragment，scFv），并對(duì)其中12株進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)其中5株對(duì)AFB1有較好的識(shí)別能力，其中Afla-45對(duì)AFB1的親和力可達(dá)6×10-9L/mol。交叉反應(yīng)結(jié)合顯示，Afla-45對(duì)50 nmol/L AFG1也有較好的識(shí)別能力，但不能有效結(jié)合同樣濃度的AFM1、AFM2以及赭曲霉素。Min等［11］通過克隆其獲得的單克隆抗體2C12的可變區(qū)基因，篩選到識(shí)別AFB1的scFv，經(jīng)表面等離子體共振傳感器（surface plasmon resonance，SPR）檢測(cè)其Kd為1.16×10-7mol，比單克隆抗體2C12高出17倍，即scFv的親和力顯著低于單克隆抗體。作者認(rèn)為導(dǎo)致scFv親和力降低的原因在于scFv僅具有單一結(jié)合位點(diǎn)，而抗體分子具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)［20］。

除單獨(dú)表達(dá)重組抗體外，通過基因手段融合表達(dá)抗體-報(bào)告分子成為一種新興的研究手段。Rangnoi等［21］從人噬菌體抗體庫中篩選到特異性識(shí)別AFB1的scFv，并通過分子手段融合表達(dá)scFv-堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），經(jīng)ELISA鑒定，YM1-C3的融合蛋白scFv-AP的靈敏度要高于scFv（IC50分別為0.04和0.12 μg/mL），與AFB2、AFG1、AFG2和AFM1的交叉反應(yīng)率分別為26.92％、70％、29.17％和0.88％。劉蓉等［22］將抗AFB1-scFv與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）通過linker連接，轉(zhuǎn)入不同的表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建了8種重組質(zhì)粒，其中兩種pET32a-VH-GFP和pET32a-GFP-VH既有抗體活性，又有熒光活性，經(jīng)檢測(cè)，其抗體效價(jià)分別為0.92和0.506，純化后蛋白激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，在495 nm處可發(fā)射出的熒光強(qiáng)度分別為1 554和661.5。

1.3核酸適配體（Aptamers）

核酸適配體是一類能夠以高特異性和靈敏度結(jié)合目標(biāo)分子的寡核苷酸（RNA或單鏈DNA）或短核酸鏈，通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）可以快速的從大容量的隨機(jī)單鏈核酸序列庫（1013-1015）中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適體，靶物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、小分子有機(jī)物、金屬離子等［23］。對(duì)篩選到的適配體測(cè)序后，即可大量合成此識(shí)別分子。

Malhotra等［24］篩選到識(shí)別AFM1的aptamer 36株，Kd在35-1 515 nmol/L；識(shí)別AFB1 的aptamer 5株，Kd在96-221 nmol/L。通過Mfold software預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)，將36株識(shí)別AFM1 的aptamer分為8組，其中有6組具有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，第7組aptamer能夠形成G-四鏈體，還有9株aptamer并沒有相似的結(jié)構(gòu)，被歸為第8組。有意思的是，親和力最高的aptamer AFAS3（Kd = 35 nmol/L）屬于第8組，具有兩個(gè)重疊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。Ma等［25］篩選到9株識(shí)別AFB1的aptamer，Kd在11.39-93.24 nmol/L，其中3株aptamer（編號(hào)1、13和27）與AFB2、AFG1、AFG2、OTA和FB1的交叉反應(yīng)率＜15％。

2　信號(hào)報(bào)告分子

生物檢測(cè)技術(shù)發(fā)展至今，已相繼使用了多種標(biāo)記物，如放射性同位素、酶、熒光素等，這些標(biāo)記物的使用極大改善了分析方法的性狀。由于部分標(biāo)記方法復(fù)雜、標(biāo)記物昂貴等不足，近年來研究者探索了多種無標(biāo)記檢測(cè)方法，其中以傳感器應(yīng)用最為廣泛，通過物理、化學(xué)信號(hào)的改變實(shí)現(xiàn)分析物的定量/半定量檢測(cè)。

2.1酶催化底物

管迪等［10］應(yīng)用單克隆抗體2C9建立了AFM1 的ELISA方法，在牛奶中LOD為3 ng/L。Wang等［16］建立了直接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法，檢測(cè)AFM1的IC50為0.014 ng/mL。Rangnoi等［21］用融合蛋白scFv-AP建立了一步法AFB1檢測(cè)方法，檢測(cè)限為2.3 ng/mL，線性范圍2.3-5 000 ng/mL。

Fang等［26］以抗AFB1單克隆抗體包被微孔板，AFB1標(biāo)準(zhǔn)品或樣品和HRP-AFB1-BSA競(jìng)爭(zhēng)性與抗體結(jié)合，以魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系作為檢測(cè)信號(hào)，AFB1檢測(cè)限為0.01 ng/g，線性范圍0.05-10 ng/g。

2.2熒光物質(zhì)

2.2.1熒光素 Shim等［27］以Cy5標(biāo)記DNA探針，和靶分子AFB1競(jìng)爭(zhēng)性的與aptamer結(jié)合，建立了AFB1的試紙條分析方法，檢測(cè)限可達(dá)0.1 ng/mL，并用于谷物樣品檢測(cè)，靈敏度為0.3 ng/g。Ma等［25］以將AFB1 aptamer 結(jié)合在Fe3O4納米磁性顆粒上，用FAM標(biāo)記aptamer互補(bǔ)序列，建立了AFB1的磁珠分析方法。當(dāng)AFB1存在時(shí)，固化在磁珠上的aptamer優(yōu)先與AFB1結(jié)合，F(xiàn)AM標(biāo)記的互補(bǔ)序列存在于溶液中；當(dāng)AFB1不存在時(shí)，固化在磁珠上的aptamer則與互補(bǔ)序列結(jié)合。因此通過磁性分離，上清中的熒光強(qiáng)度與AFB1的濃度成正比。該方法的LOD為35 ng/L，線性范圍50-1 500 ng/L。Wang等［28］將6種毒素（AFB1、AFM1、嘔吐毒素、赭曲霉毒素A、T-2毒素和玉米赤霉烯酮）的完全抗原固化在瓊脂糖改性的載玻片，與游離抗原競(jìng)爭(zhēng)性與相應(yīng)的抗體結(jié)合，通過Cy3標(biāo)記的二抗作為信號(hào)輸出方式。對(duì)AFB1和AFM1的檢測(cè)限分別為0.01 ng/mL 和0.24 ng/mL，線性范圍在0.04-1.69 ng/mL和0.45-3.9 ng/mL。李軍濤等［29］用FITC標(biāo)記AFB1單克隆抗體，建立了的免疫熒光層析試紙條法檢測(cè)食用油中的AFB1，檢測(cè)限為5 ng/mL。

2.2.2量子點(diǎn) Zhang等［30］用CdTe量子點(diǎn)標(biāo)記AFB1單克隆抗體，建立的競(jìng)爭(zhēng)性的免疫分析方法檢測(cè)限可達(dá)0.016 ng/mL，用于花生樣本檢測(cè)的IC50為0.149 ng/mL。許琳等［31］將碳量子點(diǎn)（Carbon quantum dots，CQD）探針和石墨烯量子點(diǎn)（graphene quantum dots，GQD）熒光免疫探針與AFB1單克隆抗體共價(jià)偶聯(lián)，表征后發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)后量子點(diǎn)均保持了較好的熒光特性，且與抗體偶聯(lián)后的碳量子點(diǎn)的熒光特性優(yōu)于石墨烯量子點(diǎn)，為量子點(diǎn)探針在AFB1檢測(cè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。Xu等［32］以紅色量子點(diǎn)（發(fā)射波長(zhǎng)620 nm）標(biāo)記AFB1單克隆抗體，綠色量子點(diǎn)（發(fā)射波長(zhǎng)620 nm）標(biāo)記半抗原，建立了一種均相熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)方法，對(duì)AFB1的檢測(cè)限為0.04 ng/mL，線性范圍0.06-5 ng/mL。

2.2.3其他熒光顆粒 Wu等［33］在磁珠表面偶聯(lián)AFB1-BSA和OTA-BSA，并以在上轉(zhuǎn)換納米顆粒NaY0.78F4：Yb0.2，Tm0.02 和NaY0.28F4：Yb0.7，Er0.02分別修飾抗AFB1和抗OTA單克隆抗體，建立了多標(biāo)記AFB1和OTA檢測(cè)方法，其中AFB1檢測(cè)限為0.01 ng/mL，線性范圍0.01-10 ng/mL。Liu等［34］用熒光微球標(biāo)記AFB1單克隆抗體，建立了可視化的免疫層析檢測(cè)方法，檢測(cè)限可達(dá)2.5 ng/mL。張兆威等［35］將黃曲霉毒素抗體與乳膠銪進(jìn)行偶聯(lián)標(biāo)記，建立了時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條對(duì)AFB1進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)花生、稻米、植物油等農(nóng)產(chǎn)品的檢測(cè)限均為0.3 ng/g，線性范圍分別為0.8-25、0.8-15和0.8-30 ng/g。

2.3傳感器

傳感器技術(shù)涉及化學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)及電子學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，在臨床醫(yī)藥、食品檢驗(yàn)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域廣為應(yīng)用，其中電化學(xué)傳感器是其中重要的一類。電化學(xué)傳感器價(jià)格低廉，攜帶方便，便于操作，增強(qiáng)了傳統(tǒng)的分析方法的性能。

2.3.1電流型電化學(xué)傳感器 Paniel等［36］將AFM1抗體固化在超順磁性納米粒子上，進(jìn)而通過磁性裝置將包被后的磁性納米顆粒組裝在碳電極表面，AFM1以及AFM1-HRP的競(jìng)爭(zhēng)性與AFM1抗體結(jié)合，構(gòu)建的電化學(xué)傳感器LOD為0.01 ng/mL，線性范圍0.01-0.25 ng/mL。Parker等［37］采用標(biāo)準(zhǔn)的光刻方法將包含有35個(gè)微方電極的金微陣列以及對(duì)照電極和計(jì)數(shù)電極共同組裝在芯片上，AFM1抗體固化在微電極上，建立了AFM1電化學(xué)芯片檢測(cè)方法，在牛奶中檢測(cè)限為8 ng/L，線性范圍10-100 ng/L。Nguyen等［38］在叉指電極上修飾了聚合的四氧化三鐵/聚苯胺薄膜，并通過戊二醛將AFM1 aptamer作為捕獲原件固化在電極上，構(gòu)建了AFM1電化學(xué)檢測(cè)方法，檢測(cè)限為1.98 ng/L，線性范圍6-60 ng/L。

Lin等［39］用具有電活性的硫堇分子修飾中孔碳納米顆粒，進(jìn)而用戊二醛法將AFB1多克隆抗體偶聯(lián)在中孔碳上，在玻璃電極表面修飾全氟磺酸膜。全氟磺酸膜帶負(fù)電荷，偶聯(lián)有抗體分子的納米顆粒帶正電荷，后者通過靜電作用結(jié)合到電極上，隨后納米顆粒上攜帶的硫堇誘發(fā)陰極電流產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，當(dāng)有AFB1存在時(shí)，AFB1與其抗體特異性結(jié)合，誘導(dǎo)中孔碳納米顆粒從電極表面解離，從而減弱了硫堇誘發(fā)的陰極電流，導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)變化。經(jīng)過優(yōu)化后該方法的檢測(cè)限可達(dá)到3.0 pg/mL。Zhang等［40］在玻碳電極表面修飾單壁碳納米管/甲殼素（singlewalled carbon nanotubes/ chitosan，SWNTs/CS），通過EDC法將AFB1-BSA固化在電極表面，AFB1和AFB1-BSA競(jìng)爭(zhēng)性的與抗體結(jié)合，堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗與特異性抗體結(jié)合，堿性磷酸酶催化底物萘磷酸鹽水解獲得電化學(xué)信號(hào)。該方法檢測(cè)限為3.5 pg/mL，線性范圍0.01-100 ng/mL。Singh等［41］在氧化銦錫（indium tin oxide，ITO）玻璃電極表面修飾了羧基化的多壁碳納米管（carboxylated multiwalled carbon nanotubes，c-MWCNTs），通過c-MWCNTs上的羧基將AFB1抗體組裝在電極表面，構(gòu)建了一種新型的電化學(xué)傳感器用于AFB1檢測(cè)。該方法最低檢測(cè)限為0.08 ng/mL，線性范圍0.25-1.375 ng/mL。

2.3.2阻抗型電化學(xué)傳感器 孫蘭秀等［42］采用溶膠凝膠法將AFB1抗體組裝在玻碳電極表面，構(gòu)建了電化學(xué)阻抗傳感器，用于AFB1的檢測(cè)，該方法對(duì)AFB1響應(yīng)的線性范圍為1.0-10 μg/L，檢測(cè)限為0.1 μg/L。Li等［43］在玻碳電極上修飾了硅膠離子液體，為AFB1抗體固化提供了生物相容的微環(huán)境，建立了無標(biāo)記的電化學(xué)阻抗免疫傳感器方法，最低檢測(cè)限為0.01 ng/mL，線性范圍0.1-10 ng/mL。Yu等［44］在玻碳電極表面修飾碳納米管/離子液體/抗體（MWCNTs/ionic liquid/Ab），采用電化學(xué)阻抗法檢測(cè)AFB1，該方法檢測(cè)限為0.03 ng/mL，線性范圍0.1-10 ng/mL。Wang等［45］在電極表面修飾PPy/PPa/rGO （polypyrrole/Pyrrolepropylic acid/ grapheme oxide）膜，并將AFB1抗體組裝在膜上，構(gòu)建了一種新型的阻抗傳感器，該方法檢測(cè)限為10 fg/mL，線性范圍10 fg/mL-10 pg/mL。Castillo等［46］在金電極表面修飾了Poly（amidoamine）dendrimers（PAMAM G4），通過戊二醛定向固化AFB1 aptamer，通過循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗譜采集電化學(xué)信號(hào)，線性范圍0.1-10 nmol/L。

Bacher等［47］在銀線的表面組裝特異性的AFM1單克隆抗體，通過阻抗的變化來監(jiān)測(cè)AFM1與其特異抗體的結(jié)合，最低檢測(cè)限為1 pg/mL，線性范圍6.25-100 pg/mL。

2.3.3其他傳感器 Rameil等［48］采用3-（4-hydroxyphenyl）propionic acid（p-HPPA）作為電子供體，構(gòu)建了一種電位免疫傳感器，其信號(hào)強(qiáng)度顯著高于常規(guī)使用的電子供體（ABTS、OPD、TMB），并用于AFM1的檢測(cè)，檢測(cè)限為40 pg/mL，線性范圍250-2 000 pg/mL。Lv等［49］在玻碳電極表面修飾了中孔碳/Ag納米顆粒，并通過銀離子上的氨基將魯米諾和AFB1抗體組裝在電極上，建立了一種電化學(xué)發(fā)光傳感器，該方法檢測(cè)限為50 fg/mL，線性范圍0.1 pg/mL-50 ng/mL。Chauhan等［50］在金表面組裝一層4-ATP，采用EDC法將AFB1抗體共價(jià)偶聯(lián)在電極上，構(gòu)建了一種無標(biāo)記的電化學(xué)石英晶體微天平傳感器，該方法檢測(cè)限為0.1 ng/mL，線性范圍0.1-4 ng/mL。Park等［51］通過分子生物學(xué)技術(shù)，將特異性與金結(jié)合的金結(jié)合蛋白（gold binding protein，GBP）和特異性與抗體結(jié)合的protein G融合表達(dá)，利用獲得的融合蛋白GBP-ProG將AFB1抗體定向固化在傳感器金膜的表面，采用SPR方法檢測(cè)AFB1，檢測(cè)限為1 μg/mL。Jin等［52］將BSA-AFB1固化在電極表面，游離的AFB1和BSA-AFB1與競(jìng)爭(zhēng)性的與AFB1抗體結(jié)合，通過與偶聯(lián)納米金作為重量標(biāo)簽的二抗結(jié)合，誘發(fā)質(zhì)量變化產(chǎn)生信號(hào)，構(gòu)建了壓電免疫傳感器。該方法檢測(cè)限為0.01 ng/mL，線性范圍0.1-100 ng/mL。

2.4基于金顆粒的檢測(cè)方法

以納米金顆粒為信號(hào)、硝酸纖維素膜為固相載體的側(cè)流層析方法或斑點(diǎn)免疫滲濾法，具有操作簡(jiǎn)便、快速、無需儀器設(shè)備、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，在快速分析領(lǐng)域占有重要位置。以抗體標(biāo)記金顆粒，構(gòu)建免疫層析分析方法，對(duì)AFB1或AFM1檢測(cè)限可達(dá)1.0 ng/mL［9，14-16］；以斑點(diǎn)免疫滲濾法檢測(cè)AFB1，可視化檢測(cè)限可達(dá)2 ng/mL［53］。同時(shí)，在此基礎(chǔ)上引入富集材料，可顯著提高方法的檢測(cè)限。黃艷梅等［54］采用包被有AFM1抗體的磁珠對(duì)樣本中目標(biāo)物進(jìn)行富集，磁分離后的重懸液用于免疫層析試紙條檢測(cè)，對(duì)于原料乳中AFM1的檢測(cè)限可達(dá)0.1 ng/mL。

通過采用廣譜性抗體或是多通道檢測(cè)模式，實(shí)現(xiàn)了黃曲霉毒素多殘留檢測(cè)。張道宏等［55］應(yīng)用廣譜性抗體1C11建立了免疫層析分析方法，對(duì)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的檢測(cè)限可達(dá)0.03、0.06、0.12 和0.25 ng/mL。張道宏等［56］在常規(guī)的測(cè)流層析方法基礎(chǔ)上，建立了一種基于顏色變化的半定量的可視化檢測(cè)方法。在檢測(cè)區(qū)，采用了多條檢測(cè)線，并對(duì)其數(shù)目、間距、包被濃度以及噴射速率進(jìn)行優(yōu)化，最終優(yōu)化后以3條檢測(cè)線的模式實(shí)現(xiàn)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的半定量檢測(cè)，檢測(cè)限分別為0.06、0.25、0.125和0.25 ng/mL。

基于金顆粒的物理性狀變化的新型分析方法，近年來也有所發(fā)展。Xu等［57］將AFB1-BSA偶聯(lián)在金納米棒上（gold nanorods，GNRs），當(dāng)溶液中沒有靶分子AFB1時(shí)，游離的AFB1抗體與AFB1-BSA結(jié)合后，誘發(fā)GNRs聚集，而當(dāng)溶液中存在AFB1時(shí)，AFB1抗體與溶液中的AFB1結(jié)合，無法結(jié)合到GNRs，因此GNRs保持分散狀態(tài)。通過檢測(cè)溶液的吸光度，構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單、快速的AFB1檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)限為0.16 ng/mL，線性范圍0.5-20 ng/mL。Malhotra等［24］以AFM1 aptamer 建立了基于金顆粒的可視分析方法，當(dāng)AFM1含量超過250 nmol/L時(shí)可以觀察到顏色的變化。

2.5其他

Hu等［58］合成了一種蒙脫石-聚丙烯酰胺納米復(fù)合膜，吸附到復(fù)合膜上的AFB1的熒光強(qiáng)度與其在溶液中的濃度成正比，方法線性范圍為50-1000 ng/mL，最低檢測(cè)限9.72 ng/mL。Larou等［59］利用電穿孔儀將AFM1單克隆抗體插入Vero細(xì)胞的細(xì)胞膜中，當(dāng)溶液中的靶物質(zhì)與其抗體結(jié)合后，誘發(fā)細(xì)胞膜電位的變化，從而實(shí)現(xiàn)了AFM1的快速檢測(cè)，該方法檢測(cè)限可達(dá)5 pg/mL。

3　結(jié)語

黃曲霉毒素是一種高毒性的真菌毒素，可以污染許多重要的作物而進(jìn)入到各種食物中，對(duì)人類健康產(chǎn)生重大威脅。以特異性的識(shí)別分子為基礎(chǔ)的生物分析方法在黃曲霉毒素的檢測(cè)中占據(jù)重要地位。特異性抗體是應(yīng)用最為廣泛的識(shí)別分子，近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸適配體、重組抗體等新興的識(shí)別分子被引入到快速分析領(lǐng)域，豐富了檢測(cè)方法的種類，并為檢測(cè)方法性狀的改進(jìn)提供了新的途徑，但是由于穩(wěn)定性不夠、靈敏度不高等不足，以抗體為基礎(chǔ)的分析方法仍然占據(jù)主導(dǎo)地位。在常規(guī)的ELISA方法基礎(chǔ)上，新型標(biāo)記物（熒光素、納米顆粒等）的使用提高了檢測(cè)方法的靈敏度；傳感器技術(shù)，尤其是電化學(xué)傳感器，與一些新型納米材料，如多孔材料、碳納米管、石墨烯等相結(jié)合，發(fā)展出了許多新型的電化學(xué)傳感器，極大地提高了檢測(cè)方法的靈敏度，從ng水平提高到fg水平。但是電化學(xué)傳感器也有一定的局限性，如樣品中存在電活性物質(zhì)的干擾，長(zhǎng)期的穩(wěn)定性較差等。

各國(guó)對(duì)食品安全愈加重視，食品安全標(biāo)準(zhǔn)也會(huì)越來越嚴(yán)格，對(duì)檢測(cè)方法的要求趨向高靈敏度、樣品前處理簡(jiǎn)單、使用方便、穩(wěn)定性好等。探索多種穩(wěn)定性好、靈敏度高的識(shí)別分子、新型納米材料的引入以及加強(qiáng)傳感器技術(shù)的工業(yè)化、規(guī)?；榷喾N手段相結(jié)合，將會(huì)促進(jìn)黃曲霉毒素檢測(cè)向著便攜化、操作簡(jiǎn)便、低成本、產(chǎn)業(yè)化方向發(fā)展。

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［57］ Xu X， Liu X， Li Y， et al. A simple and rapid optical biosensor for detection of aflatoxin B1 based on competitive dispersion of gold nanorods［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2013， 47：361-367.

［58］ Hu H， Garcia-Uribe A， Deng Y， et al. Layer-by-layer assembled smectite-polymer nanocomposite film for rapid fluorometric detection of aflatoxin B 1［J］. Sensors and Actuators B：Chemical， 2012， 166：205-211.

［59］ Larou E， Yiakoumettis I， Kaltsas G， et al. High throughput cellular biosensor for the ultra-sensitive， ultra-rapid detection of aflatoxin M1［J］. Food Control， 2013， 29（1）：208-212.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Advances on Rapid Detection Methods for Aflatoxin Based on Biological Binders

ZENG Kun DU Dao-lin XUE Yong-lai
（1. College of Environmental and Safety Engineering，Institute of Environment and Ecology，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

Aflatoxins are secondary metabolites secreted by Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus，easily pollute the grains and their processed products，and mainly exist in moldy grain，legumes，nuts and associated food products. Aflatoxins are extremely toxic and carcinogenic，especially aflatoxin B1 that has been found to be the strongest natural carcinogen and severely threat to human health. Current detection methods of aflatoxins in the grains are mainly instrumental analysis by combining the high performance liquid chromatography and liquid mass spectrometry，however，instrumental analysis presents the shortcomings such as instruments cost is very high，analysis process is very complex and needs long-time-trained professionals. In recent years，integrating the rapid identification of aflatoxin based on biological binders（antibody，recombinant antibody，and aptamer）and different signal reporters，a series of analysis methods for aflatoxin were established，and they are fast，flexible，and easy to operate，therefore widely applied in food safety. Here we review the rapid detection methods mainly from 2 aspects of specific biological binders for aflatoxins and signal reporters，compare and evaluate them，also prospect the development trend of rapid methods for aflatoxin.

aflatoxin；antibody；aptamer；rapid detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.009

2015-11-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31502118，31170386，31570414），江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20130507，BK2012274），中國(guó)博士后基金項(xiàng)目（2013M541606），江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［CX（13）3093］，江蘇大學(xué)高級(jí)人才啟動(dòng)金（13JDG016），鎮(zhèn)江市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（NY2013006），鎮(zhèn)江市國(guó)際科技合作項(xiàng)目（GJ2014008）

曾昆，女，博士，研究方向：污染物快速分析；E-mail：kjj80116@163.com

杜道林，男，博士，研究方向：環(huán)境污染物生態(tài)效應(yīng)；E-mail：daolindu@163.com