一個Chip-seq的生物信息分析流程

陳作舟張俊芳

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306）

一個Chip-seq的生物信息分析流程

陳作舟*張俊芳

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306）

本文簡單的介紹了一個Chip-seq 的生物信息分析流程的設(shè)計和實現(xiàn)。

生物信息 Chip-seq 基因組

1 引言

隨著二代測序技術(shù)的持續(xù)優(yōu)化,測序成本大幅度降低,生命科學(xué)的各個領(lǐng)域發(fā)展了針對二代測序的各種應(yīng)用,其中有一類就是通過免疫沉淀富集基因組的片段,使研究者得以研究基因組的不同狀態(tài)之間的差異,例如不同組織基因表達的差異是如何實現(xiàn)的,癌癥和正常細胞的基因組狀態(tài)有何差別,細胞的基因組是如何適應(yīng)環(huán)境溫度變化的。Chip-seq是通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段,繼而對富集得到的DNA片段進行高通量測序。目前已經(jīng)有很多工具能夠?qū)@類數(shù)據(jù)進行分析,各有優(yōu)缺點,并沒有形成統(tǒng)一的模式,例如有的僅僅提供在線分析,有的僅僅提供某些核心環(huán)節(jié)的分析,為此,我們建立了一個Chip-seq的分析流程,該流程整合了若干生物信息工具以及若干R語言包,現(xiàn)簡述如下,以供生命科學(xué)的研究人員參考。

2 結(jié)果與方法

2.1 測序數(shù)據(jù)與基因組比對

假定我們已經(jīng)得到斑馬魚的兩組轉(zhuǎn)錄組因子的Chip-seq測序數(shù)據(jù),A和B,以及它們的未進行免疫沉淀測序的對照結(jié)果序列文件（control）inputAB。 A和B可以預(yù)先通過FastQC或FastX等工具來控制數(shù)據(jù)質(zhì)量。然后我們將A和B對斑馬魚的基因組進行比對,比對工具有Bowtie/Bowtie2, BWA和STAR等。這里我們用Bowtie2舉例說明：

bowtie2 -p 4 -x dr.genome -U A.fatsq S A.sam

bowtie2 -p 4 -x dr.genome -U B.fatsq S B.sam

bowtie2 -p 4 -x dr.genome -U inputAB.fatsq S inputAB.sam

其中-p 代表使用的CPU核心數(shù)量, -x代表對應(yīng)的基因組, -U代表輸入的fastq序列文件, -S代表輸出的比對結(jié)果,該結(jié)果為SAM格式。SAM格式可通過Samtools和Bedtools等工具轉(zhuǎn)化成Bed格式。

2.2 得到免疫沉淀的峰文件（Peak Calling）

有多個工具可以執(zhí)行Peak Calling工作,比較常用的有MACS/MACS2、SICER等,在這里我們以MACS舉例說明。

macs14 -t A.bed -c inputAB.bed -f BED -g dr -n A --keep-dup=1

macs14 -t B.bed -c inputAB.bed -f BED -g dr -n A --keep-dup=1

其中-t 代表前一步得到的基因組比對（alignment）文件,-c代表免疫沉淀的control文件,-f BED表示輸入文件的格式為BED,-g代表基因組的類型,這里用的是斑馬魚,-n代表輸出文件名,--keep-dup代表重復(fù)的測序計算的次數(shù)。

2.3 合成峰（Peak Merging）

Bedtools merge -i AB_peaks ＞AB_peaks.merged

利用Bedtools軟件包中的merge功能,將A和B的兩組峰合成一組。以合成的峰組作為一個公共的可比較的對象（Reference）來進行后續(xù)分析。

2.4 分析1：覆蓋情況分析及文氏圖

Bedtools coverage -a AB_peaks.merged -b A_peaks.bed＞A_coverage

Bedtools coverage -a AB_peaks.merged -b B_peaks.bed＞B_coverage

利用Bedtools軟件包中的coverage功能,計算A和B對Reference的覆蓋情況。可以將得到的結(jié)果利用R語言自帶的或者第三方的文氏圖相關(guān)軟件包進行作圖,例如“VennDiagram”,“Vennerable”等。

該分析適用于以下幾種情形：

（1）兩個或多個具有潛在相關(guān)性的DNA結(jié)合蛋白,例如轉(zhuǎn)錄因子,我們需要研究它們的相關(guān)性情況,為相互作用提供證據(jù)（此為Chip-seq分析）。（2）一個DNA結(jié)合蛋白在細胞不同狀態(tài)的結(jié)合情況（此為Chip-seq分析）（3）以上兩種情況的結(jié)合（此為Chip-seq分析）（4）以上的DNA結(jié)合蛋白更換為組蛋白修飾（此為Chip-seq分析）

2.5 分析2：差異分析

以上覆蓋情況分析的著重點在于不同庫（library）的峰在的基因組位置上的異同,從而為尋找出基因組的不同狀態(tài)之間的生物學(xué)差異提供線索,而差異分析目的是進一步得到不同庫的公共的峰的相對表達量的差異。先利用第4步得到的合成峰作為參考區(qū)域,然后計算參考區(qū)域的Reads覆蓋情況,均一化（Normalize）以后進行統(tǒng)計分析,一般如果沒有重復(fù)（Replica）的話,使用Fishers' Exact test或Chi-square test,如果有重復(fù),則使用專用的R語言軟件包如edgeR等。

2.6 分析3：差異分析后的Gene Ontology（GO）富集分析

我們利用GO.db這一R語言模塊檢索GO的上下級關(guān)系。富集檢測利用Fishers' Exact test。

2.7 分析4：通過多Peak的聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)整體上調(diào)或下調(diào)的通路

先將斑馬魚的基因注釋到KEGG通路上,然后利用Wilcoxin Rank test檢測出差異分布的通路。

2.8 分析5：峰的注釋及分析

利用UCSC的斑馬魚基因組對峰進行注釋,一般根據(jù)峰和基因組元件（如啟動子區(qū)域）的重疊情況進行注釋。然后得到峰在不同基因組元件上的分布情況。

2.9 分析6：免疫沉淀峰（Chip-seq）與基因表達譜（RNA-seq）的聯(lián)合分析

免疫沉淀峰和基因表達譜的聯(lián)合分析有多種類型,我們主要對不同組織的峰的組合所對應(yīng)的基因表達情況進行分析,例如兩種轉(zhuǎn)錄因子組合所在區(qū)域的基因表達是否提高。

［1］Park PJ. Chip-seq： advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet.2009（10）：669-680.

［2］Anders S， Huber W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 2010（10）：106.

Q753

A

1674-2060（2016）03-0333-01

感謝：本文受上海市青年教師資助計劃（項目編號：ZZHY13001，陳作舟）、上海市人才發(fā)展資金（項目編號：201457，張俊芳）和上海市上海高校高峰高原學(xué)科建設(shè)計劃資助。

張俊芳，（1976—），女，山西太原人，博士，教授，基因組學(xué)與表觀遺傳學(xué)。

陳作舟（1979—），男，浙江杭州人，博士，高級工程師，主要從事生物信息分析工作。