p-JNK/p-c-Jun通路參與大鼠杏仁核點(diǎn)燃癲癇模型

李巷，潘建青，康慧聰，楊志剛，韓金玲，聶荔，肖小華，張玲玲，朱遂強(qiáng)

p-JNK/p-c-Jun通路參與大鼠杏仁核點(diǎn)燃癲癇模型

李巷1，潘建青1，康慧聰2，楊志剛1，韓金玲1，聶荔1，肖小華3，張玲玲1，朱遂強(qiáng)2

目的：研究杏仁核點(diǎn)燃癲癇模型中c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路的活化。方法：雄性Wistar大鼠20只，隨機(jī)分為對(duì)照組10只和模型組10只。將電極植入大鼠右側(cè)杏仁核，對(duì)照組不給予電刺激，模型組每天給予500 μA的電流刺激，大鼠連續(xù)10 d在刺激后達(dá)到5級(jí)發(fā)作視為點(diǎn)燃成功。成功點(diǎn)燃的大鼠，在最后1次5級(jí)發(fā)作后2 h處死。Western blot檢測(cè)2組海馬JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun的表達(dá)。結(jié)果：模型組刺激側(cè)海馬p-JNK、p-c-Jun表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論：p-JNK/p-c-Jun通路可能參與杏仁核癲癇模型點(diǎn)燃。

杏仁核點(diǎn)燃；磷酸化JNK；磷酸化c-Jun

顳葉癲癇及其動(dòng)物模型主要的病理變化是海馬硬化，包括神經(jīng)元缺失及膠質(zhì)細(xì)胞增生[1]。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）又被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase,SAPK），是絲裂原活化蛋白激酶系統(tǒng)成員之一，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等的調(diào)控。JNK激活參與多種癲癇動(dòng)物模型，與神經(jīng)元凋亡相關(guān)。JNK可通過(guò)一系列磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活?；罨腏NK可調(diào)控細(xì)胞核底物如c-jun等，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[2]。杏仁核點(diǎn)燃模型是目前國(guó)際公認(rèn)的一種更為接近人類(lèi)、應(yīng)用廣泛的復(fù)雜部分性發(fā)作模型。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)，杏仁核點(diǎn)燃模型中刺激側(cè)海馬免疫組化染色有p-JNK表達(dá)，并與神經(jīng)元損害部位一致。本研究定量檢測(cè)刺激側(cè)海馬JNK/p-JNK及其下游信號(hào)c-jun/p-c-jun的表達(dá)，進(jìn)一步闡述點(diǎn)燃模型海馬損傷的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠20只，體質(zhì)量250～300 g。標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件飼養(yǎng)。1.1.2主要試劑 兔抗JNK多克隆抗體及兔抗p-JNK多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signal公司，小鼠抗p-c-Jun多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG及羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，小鼠抗β-actin單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及分組6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，固定于立體定位儀上，將自制五芯電極中的刺激電極植入右側(cè)杏仁核基底外側(cè)核（前囟后2.2 mm,旁開(kāi)右側(cè)4.8 mm，顱骨表面下8.5 mm）[4]。其他3個(gè)電極分別接上微型螺絲，置于前囟點(diǎn)左右及人字縫后方作為記錄電極和參考電極。牙托粉固定。將所有大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，各10只。2組均手術(shù)植入電極，術(shù)后1周，對(duì)照組每天抓取，但不予電刺激；模型組每天同一時(shí)間予電刺激：細(xì)電流，連續(xù)串刺激，延時(shí)100 ms，波寬1 ms，波間隔19 ms，頻率50 Hz，串長(zhǎng)100，方波，刺激強(qiáng)度500 μA，1次/d。刺激后記錄大鼠行為學(xué)變化。發(fā)作強(qiáng)度參照國(guó)際通用的Racine分級(jí)，并參考以往研究[3]。連續(xù)10天達(dá)到5級(jí)發(fā)作視為模型點(diǎn)燃。最后1次5級(jí)發(fā)作2 h取標(biāo)本。

1.2.2 Western blot檢測(cè) 提取海馬組織蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗、二抗孵育，DAB顯色，掃描膠片，使用美國(guó)Gene Genius公司凝膠成像分析系統(tǒng)分析JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun及β-actin光密度值。

1.2.3 組織學(xué)變化 制備腦組織冰凍切片，尼氏染色后中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察電極位置是否正確，有無(wú)異常出血及組織損害。有以上情況出現(xiàn)的大鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)予以剔除。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（χ±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Westernblot結(jié)果顯示，2組p-JNK46/54均有表達(dá)，模型組蛋白表達(dá)量明顯增多；相對(duì)光密度值分析示：對(duì)照組、模型組中p-JNK46/actin分別為（0.24±0.02）、（0.48±0.01），p-JNK54/actin分別為（0.26±0.02）、（0.50± 0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1B；JNK在2組中均有大量表達(dá)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p-c-Jun在2組均有表達(dá)，相對(duì)光密度值分析示：對(duì)照組、模型組中p-c-Jun分別為（0.38±0.03）、（0.88±0.02），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2B；c-Jun在2組中均有大量表達(dá)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

模型組1只大鼠點(diǎn)燃不成功，電極脫落，其他大鼠點(diǎn)燃后均表現(xiàn)出穩(wěn)定的5級(jí)發(fā)作。對(duì)照組大鼠無(wú)電極脫落。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，在成功點(diǎn)燃的模型中，刺激側(cè)海馬p-JNK表達(dá)明顯增多，與前期研究海馬神經(jīng)元損傷部位基本一致；刺激側(cè)海馬p-c-Jun表達(dá)明顯增多；提示杏仁核點(diǎn)燃模型可能是通過(guò)p-JNK激活c-Jun致p-c-Jun表達(dá)增多，參與海馬神經(jīng)元損傷。

圖1 對(duì)照組與模型組JNK與p-JNK變化

圖2 對(duì)照組與模型組c-jun與p-c-jun變化

JNK的編碼基因有3個(gè)，JNK1/2廣泛存在于體內(nèi)各種組織，JNK3主要分布在腦組織[4]，通過(guò)磷酸化絲氨酸/蘇氨酸殘基來(lái)活化。各種促炎反應(yīng)因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β，細(xì)胞應(yīng)激如熱休克、紫外線照射、氧化應(yīng)激都可以激活JNK[5]。JNK激活參與了多種癲癇動(dòng)物模型，在毛果蕓香堿導(dǎo)致的癲癇持續(xù)狀態(tài)早期即有JNK的激活，且廣泛分布于邊緣系統(tǒng)，與神經(jīng)元損傷區(qū)域分布一致[6]；海人酸癲癇大鼠模型中，注射海人酸30 min即開(kāi)始出現(xiàn)JNK激活，持續(xù)2 h恢復(fù)正常，同時(shí)JNK的底物c-jun磷酸化增強(qiáng)，參與神經(jīng)元損傷[7]。JNK1及c-jun活化參與電休克驚厥[8]；戊四氮小鼠癲癇模型中磷酸化JNK、磷酸化c-jun及上游信號(hào)MKK4均表達(dá)增多[9]。海馬快速電點(diǎn)燃模型中，膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)了JNK的活化并參與神經(jīng)元的損傷過(guò)程[10]。上述實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與了急性癲癇發(fā)作及神經(jīng)元損傷，但對(duì)于長(zhǎng)期癲癇發(fā)作JNK通路是否參與研究較少。本實(shí)驗(yàn)中，杏仁核低強(qiáng)度電流刺激點(diǎn)燃模型是一個(gè)長(zhǎng)期慢性的過(guò)程，大鼠完全點(diǎn)燃持續(xù)15～20 d，與對(duì)照組相比，模型組刺激側(cè)海馬p-JNK及p-c-Jun表達(dá)明顯增多，與其他癲癇模型報(bào)道一致。

JNK活化后主要通過(guò)2個(gè)途徑參與細(xì)胞損傷：一方面，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄因子c-jun，進(jìn)而增加AP-1轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞凋亡；另一方面，一部分激活的JNK留在胞質(zhì)中，參與Bcl-2家族成員的活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中刺激側(cè)海馬p-JNK及p-c-Jun表達(dá)明顯增多，說(shuō)明活化的JNK可進(jìn)一步激活c-jun參與模型點(diǎn)燃。實(shí)驗(yàn)還需進(jìn)一步研究其他可能的途徑（如Bcl-2家族成員），進(jìn)一步闡明杏仁核點(diǎn)燃的分子機(jī)制。

[1]L?scher W.Animal models of intractable epilepsy[J].Prog Neurobiol, 1997,53:239-258.

[2]Takeda K,Matsuzawa A,Nishitoh H,et al.Roles of MAPKKK ASK1 in stress-induced cell death[J].Cell Struct Funct,2003,28:23-29.

[3]李建英,李巷,康慧聰,等.左乙拉西坦對(duì)海人酸大鼠點(diǎn)燃癲癇模型的保護(hù)作用[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2013,8:247-249.

[4]Gupta S,Barrett T,Whitmarsh AJ,et al.Selective interaction of JNK protein kinase isoforms with transcription factors[J].EMBO J,1996,15: 2760-2770.

[5]Bruckner SR,Tammariello SP,Kuan CY,et al.JNK3 contributes to c-Jun activation and apoptosis but not oxidative stress in nerve growth factor-deprived sympathetic neurons[J].J Neurochem,2001,78:298-303.

[6]Garrido YC,Sanabria ER,Funke MG,et al.Mitogen-activated protein kinase is increased in the limbic structures of the rat brain during the early stages of status epilepticus[J].Brain Res Bull,1998,47:223-229.

[7]Jeon SH,Kim YS,Bae CD,et al.Activation of JNK and p38 in rat hippocampus after kainic acid induced seizure[J].Exp Mol Med,2000,32: 227-230.

[8]Brecht S,Simler S,Vergnes M,et al.Repetitive electroconvulsive seizures induce activity of c-Jun N-terminal kinase and compartment-specific desensitization of c-Jun phosphorylation in the rat brain[J].Brain Res Mol Brain Res,1999,68:101-108.

[9]Morgan L,Neame SJ,Child H,et al.Development of a pentylenetetrazole-induced seizure model to evaluate kinase inhibitor efficacy in the central nervous system[J].Neurosci Lett,2006,395:143-148.

[10]Cole-Edwards KK,Musto AE,Bazan NG.c-Jun N-terminal kinase activation responses induced by hippocampal kindling are mediated by reactive astrocytes[J].J Neurosci,2006,26:8295-8304.

（本文編輯：唐穎馨）

Involvement of p-JNK/p-c-Jun signalingin Amygdala-kindled Seizures

LIXiang1,PANJi-an-qing1,KANGHui-cong2,YANGZhi-gang1,HANJin-ling1,NIELi1,XIAOXiao-hua3,ZHANGLing-ling1, ZHUSui-qiang2

1.Departmentofneurology,NanshanHospital，Shenzhen,Guangdong,518052,China;2.Department ofNeurology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,430030,China;3.DepartmentofNeurology,SecondPeople’sHospital,Shenzhen,Guangdong, 518052,China

Objective:To evaluate the involement of JNK mitogen-activated protein kinase signaling pathway in amygdala-kindled models.Methods:Twenty Wistar rats were randomly divided into control group(n=10) and kindling group(n=10).Electrodes were implanted into the right amygdala of all the rats.Kindling was accomplished using stimulus strength of 500 μA applied daily to the amygdala until stage 5 were induced in rats for consecutive 10 days.All kindled rats were decapitated 2 h after the tenth stage 5 seizures.Rats in the control group did not receive stimulus.Western blot were performed to test the expression of JNK,p-JNK,c-Jun，p-c-Jun in hippocampus.Results:Kindling increased the expression of p-JNK and p-c-Jun in amygdala-kindled models. The difference is statistical significant between control group and kildling group.Conclusion:p-JNK/p-c-Jun signaling may be involved in amygdala-kindled seizures.

amygdala-kindled;p-JNK;p-c-Jun

R741;R742.1

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.06.002

1.深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科廣東 深圳518052

2.華中科技大學(xué)統(tǒng)計(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢 430030

3.深圳市第二人民醫(yī)院廣東 深圳518052

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（No.81201006）湖北省自然科學(xué)基金（No.2011CDB201）深圳市南山區(qū)技術(shù)研發(fā)和創(chuàng)意設(shè)計(jì)項(xiàng)目分項(xiàng)基金（No.南 科 研 衛(wèi)2012002）深圳市南山區(qū)技術(shù)研發(fā)和創(chuàng)意設(shè)計(jì)項(xiàng)目分項(xiàng)基金（No.南 科 研 衛(wèi)2014015）深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.JCYJ20140414 170821276）

2016-01-26

朱遂強(qiáng)zhusuiqiang@163. com