加味升陽益胃湯組方對荷瘤小鼠化療后骨髓抑制及免疫功能的影響

張潤蓮　岳斌　李維　王寶琴　溫麗英　劉冬彥　連平　何曉華　趙冬梅

075000　張家口，河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科(張潤蓮、岳斌、溫麗英、連平、何曉華、趙冬梅)；河北省張家口市崇禮縣中醫(yī)院內(nèi)科(李維)；河北省張家口市崇禮縣婦幼保健院婦產(chǎn)科(王寶琴)；河北省張家口市沽源縣醫(yī)院內(nèi)科(劉冬彥)

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加味升陽益胃湯組方對荷瘤小鼠化療后骨髓抑制及免疫功能的影響

張潤蓮岳斌李維王寶琴溫麗英劉冬彥連平何曉華趙冬梅

075000張家口，河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科(張潤蓮、岳斌、溫麗英、連平、何曉華、趙冬梅)；河北省張家口市崇禮縣中醫(yī)院內(nèi)科(李維)；河北省張家口市崇禮縣婦幼保健院婦產(chǎn)科(王寶琴)；河北省張家口市沽源縣醫(yī)院內(nèi)科(劉冬彥)

【摘要】目的重點(diǎn)探究加味升陽益胃湯組方對荷瘤小鼠化療的骨髓抑制及免疫功能的影響。 方法建立小鼠肉瘤 S180移植性腫瘤模型，并將小鼠分成五組，荷瘤細(xì)胞對照組腹腔注射生理鹽水0.2 mL，環(huán)磷酰胺組注射環(huán)磷酰胺(cyclophosvnamide，CTX)20 mg/kg，三組治療組分別給予注射同等劑量CTX化療，同時(shí)給予不同劑量的加味升陽益胃湯組方，其中小劑量組每只中藥灌胃0.1 mL，中劑量組每只中藥灌胃0.2 mL，大劑量組每只中藥灌胃0.3 mL，1 mL大約含有70 g生藥量。結(jié)果環(huán)磷酰胺組小鼠的白細(xì)胞、血紅蛋白及血小板均降低，荷瘤對照組和環(huán)磷酰胺組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大劑量組、中劑量組、小劑量組的白細(xì)胞、血紅蛋白及血小板均正常，大劑量組、中劑量組升高程度相對明顯。三個(gè)劑量組和環(huán)磷酰胺組對比差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論加味升陽益胃湯組方能拮抗荷瘤小鼠化療后引起的骨髓抑制及免疫功能的下降。

【關(guān)鍵詞】加味升陽益胃湯組方；荷瘤小鼠；化療；骨髓抑制；免疫功能

惡性腫瘤的發(fā)病率正呈逐年上升的趨勢，嚴(yán)重威脅著人民的身體健康及生命。對于惡性腫瘤公認(rèn)的治療方法有化療、放療、介入、熱療、中醫(yī)中藥等，中醫(yī)中藥貫穿于腫瘤治療的各個(gè)環(huán)節(jié)?；煔颊邭埓婺[瘤細(xì)胞，但殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，對正常細(xì)胞也有一定的損害，同時(shí)也抑制機(jī)體免疫功能[1]，故骨髓抑制及免疫功能下降是化療常見的并發(fā)癥[2]，在治療上一直困擾著臨床大夫，選擇有效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、療效較好的藥物治療骨髓抑制，提高機(jī)體免疫力，是保證順利化療的重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)觀察加味升陽益胃湯組方對荷瘤小鼠化療后骨髓抑制及免疫功能的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物61只(其中1只用于接種小鼠肉瘤S180細(xì)胞株，其余60只進(jìn)行實(shí)驗(yàn))清潔級昆明雄性小鼠，7~8周齡，體質(zhì)量約為24 g，購自北京實(shí)驗(yàn)動物繁殖中心；小鼠在實(shí)驗(yàn)前正常飼養(yǎng)環(huán)境，空調(diào)恒溫室內(nèi)22 ℃，自由飲水，每天光照2小時(shí)，訓(xùn)養(yǎng)1周。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物 (1)加味升陽益胃湯組方(購自河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院中藥房)藥物組成：黃芪30 g、陳皮10 g、清半夏10 g、人參15 g、茯苓15 g、炒白術(shù)12 g、炙甘草6 g、羌活10 g、獨(dú)活10 g、柴胡10 g、防風(fēng)10 g、澤瀉15 g、黃連6 g、當(dāng)歸10 g、花生內(nèi)衣10 g、生姜3片、大棗6個(gè)，將這些中藥浸泡大約半個(gè)小時(shí)，并煎煮及過濾至少三次，每次的時(shí)間大約是半個(gè)小時(shí)。接著取出汁液300 mL，使用80℃的水進(jìn)行水浴濃縮，1 mL大約含有1 g生藥量，使用80 ℃進(jìn)行煎煮濃縮為30 mL，1 mL大約含有70 g生藥量，4℃中保存。(2) 環(huán)磷酰胺(cyclophosvnamide，CTX)購自山西振東泰盛制藥有限公司，批號：H20143566。

1.2方法

1.2.1建立小鼠肉瘤S180移植性腫瘤模型將小鼠肉瘤S180細(xì)胞株接種于其中一只小鼠腹腔，7天后予頸椎脫臼處死，腹部皮膚消毒后抽取腹水，按1∶6生理鹽水稀釋，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×107個(gè)/mL。

1.2.2分組及給藥方法60只昆明種小鼠的右腋皮下接種，每只大約0.2 mL。將小鼠隨機(jī)分成五組，荷瘤細(xì)胞對照組每只灌胃生理鹽水0.4 mL，腹腔注射生理鹽水0.2 mL。磷酰胺組每只灌胃生理鹽水0.4 mL，注射CTX 20 mg/kg。三組治療組分別給予不同劑量的加味升陽益胃湯組方，小劑量組每只中藥灌胃0.1mL，注射CTX 20 mg/kg；中劑量組每只中藥灌胃0.2 mL，注射CTX 20 mg/kg；大劑量組每只中藥灌胃0.3 mL，注射CTX 20 mg/kg。每只小鼠用藥時(shí)間是接種瘤細(xì)胞24小時(shí)后，每天用藥一次，持續(xù)用藥10天。

1.2.3標(biāo)本的收集與處理10天后小鼠頸椎脫臼處死，取血，EDTAK2抗凝，用全自動模塊血液體液分析儀(型號XN-2000)；流式法化驗(yàn)血常規(guī)，摘取胸腺及脾稱重，胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/ 小鼠重量(g) 脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/小鼠重量(g)。

1.2.4自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)活性的測定[3]無菌摘取脾臟，按常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成1×107個(gè)/mL的細(xì)胞濃度作為效應(yīng)細(xì)胞。取傳代培養(yǎng)的L929細(xì)胞，用0.25%胰酶消化液消化2分鐘加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/mL作為靶細(xì)胞，在96孔平底板上每孔加入靶細(xì)胞懸液100 μL， 37℃、5%CO2培養(yǎng)90分鐘，使其貼壁成單層細(xì)胞，然后實(shí)驗(yàn)孔加入100 μL效應(yīng)細(xì)胞懸液，做4個(gè)復(fù)孔，靶細(xì)胞對照孔加完全RPMI-1640培養(yǎng)液100 μL，然后將96孔板放在孵箱中孵育20小時(shí)，去上清，用生理鹽水輕輕注滿各孔，反復(fù)3次，以除去效應(yīng)細(xì)胞和被殺傷脫落的靶細(xì)胞，在濾紙上吸干孔內(nèi)水分；每孔加入0.1%的中性紅染液100 μL孵育30分鐘，棄去染液，用生理鹽水洗3遍，每孔加100 μL細(xì)胞裂解液，使含有中性紅的靶細(xì)胞溶解，搖勻，用酶標(biāo)儀在450 nm測光密度值(optical density,OD)，用以下公式計(jì)算殺傷率。

殺傷率(%)=(靶細(xì)胞OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/靶細(xì)胞OD值×100%

1.2.5T淋巴細(xì)胞增值能力的測定[4]無菌摘取脾臟，常規(guī)制作脾細(xì)胞懸液，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/mL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板100 μL/孔，再分別加入ConA 100 μL/孔使其終濃度為6 μg/mL，將上述加好的培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱68小時(shí)后取出，每孔吸出10 μL，加入0.5 g/L的MTT 10 μg，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時(shí)后取出，加10% SDS-HCl溶液100 μL/孔，振蕩過夜，酶標(biāo)儀測570 nm波長處OD值。以各樣本A值代表其T淋巴細(xì)胞增值能力。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1不同組別的化療荷瘤小鼠白細(xì)胞、血紅蛋白及血小板的對比

結(jié)果表明環(huán)磷酰胺組小鼠的白細(xì)胞、血紅蛋白及血小板均降低，荷瘤對照組和環(huán)磷酰胺組對比差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大劑量組、中劑量組、小劑量組的白細(xì)胞、血紅蛋白及血小板均正常，大劑量組、中劑量組升高程度相對明顯。三個(gè)治療組和環(huán)磷酰胺組對比差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　不同組別對荷瘤小鼠白細(xì)胞、血紅蛋白及

注： 與荷瘤對照組比較，aP<0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，bP<0.05，

cP<0.01。

2.2不同組別的化療荷瘤小鼠臟器指數(shù)的對比

結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均降低，荷瘤對照組和環(huán)磷酰胺組對比差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大劑量組、中劑量組、小劑量組的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均上升，大劑量組、中劑量組升高程度相對明顯。三個(gè)治療組和環(huán)磷酰胺組對比差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　不同組別的化療荷瘤小鼠臟器指數(shù)的對比±s)

注： 與荷瘤對照組比較，aP<0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，bP<0.05，

cP<0.01。

2.3不同組別的化療荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞活性對比

結(jié)果表明環(huán)磷酰胺組的NK細(xì)胞活性顯著降低，荷瘤對照組和環(huán)磷酰胺組對比差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大劑量組、中劑量組、小劑量組的NK細(xì)胞活性均上升，大劑量組、中劑量組升高程度相對明顯，三個(gè)治療組和環(huán)磷酰胺組對比差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3　不同組別的化療荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞增殖

注： 與荷瘤對照組比較，aP<0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，bP<0.05，cP<0.01。

3討論

化療藥物均是細(xì)胞毒性藥物，中醫(yī)視為邪氣，而這種邪氣不同于一般的六淫之邪，它傷人快，肺先受邪，正氣受損嚴(yán)重，故其病機(jī)是肺脾氣虛，兼有濕熱阻滯，治療就應(yīng)該采用健脾補(bǔ)肺、清熱化濕的方法。加味升陽益胃湯組方正符合此要求，人參、茯苓、炒白術(shù)、陳皮、清半夏、炙甘草健脾益氣；黃芪、防風(fēng)、炒白術(shù)補(bǔ)益肺氣；柴胡、羌活、獨(dú)活風(fēng)藥勝濕；茯苓、澤瀉健脾滲濕；黃連清熱燥濕；當(dāng)歸、花生內(nèi)衣、生姜、大棗和胃補(bǔ)血，諸藥合用共奏健脾補(bǔ)肺、清熱化濕、益氣和胃、補(bǔ)氣養(yǎng)血之功效[5]，具有增強(qiáng)免疫，防治骨髓抑制的綜合治療作用[6-11]。

本研究中，環(huán)磷酰胺組小鼠出現(xiàn)骨髓抑制，紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板均有不同程度的降低。大劑量組、中劑量組、小劑量組的小鼠無骨髓抑制癥狀。通過這些數(shù)據(jù)對比，有理由相信加味升陽益胃湯能夠升高紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板。環(huán)磷酰胺組的NK細(xì)胞活性顯著降低，而大劑量組、中劑量組、小劑量組的NK細(xì)胞活性均上升，大劑量組、中劑量組升高程度相對明顯，說明加味升陽益胃湯能提高NK細(xì)胞的活性。環(huán)磷酰胺組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均降低，大劑量組、中劑量組、小劑量組的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均上升，大劑量組、中劑量組升高程度相對明顯。進(jìn)一步表明加味升陽益胃湯能提高脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。由此可見，加味升陽益胃湯組方能拮抗化療引起的荷瘤小鼠骨髓抑制、提高免疫功能。

本實(shí)驗(yàn)針對中藥全方位、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)[12]，進(jìn)一步了解加味升陽益胃湯的組方療效，驗(yàn)證了該組方對腫瘤化療時(shí)出現(xiàn)的骨髓抑制不良反應(yīng)的治療作用，并有提高免疫功能的作用，在一定程度上擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍，使其為更好地指導(dǎo)臨床用藥提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是，其詳細(xì)的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)也存在著樣本量偏少的不足，期待今后有更大樣本、更精密的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，使中醫(yī)藥更好地服務(wù)于臨床。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Effects ofJiaweiShengyangYiweidecoction on bone marrow and immune function after chemotherapy in tumor-bearing mice

ZHANGRun-lian，YUEBin，LIWei，etal.TheFirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of Jiawei Shengyang Yiwei decoction on on bone marrow and immune function after chemotherapy in tumor-bearing mice. MethodsTransplanted tumor in mice Sarcoma S180 model was established and mice were divided into five groups. Tumor cells control group was injected with 0.2 ml saline, CTX group was injected with cyclophosphamide, and three treatment groups were injected with CTX and were gavage with different dose of Jiawei Shengyang Yiwei decoction (0.1, 0.2, 0.3 ml). ResultsWhite cells, hemoglobin and blood platelet level decreased in mice in CTX group. There was significant difference between tumor cells control group and CTX group (P<0.05=. The white cells, hemoglobin, and blood platelet level of the three treatment group was normal, and much more obvious improvement appeared in high and medium dose group. There was significant difference between the three treatment groups and CTX group(P<0.05). ConclusionJiawei Shengyang Yiwei decoction could be antagonistic to the bone marrow suppression and immune function decline caused by chemotherapy in tumor-bearing mice.

【Key words】Jiawei Shengyang Yiwei decoction formula；Tumor-bearing mice；Chemotherapy；Bone marrow suppression；Immune function influence

(收稿日期：2018-08-10)

Corresponding author：ZHANG Run-lian， E-mail： 109798530@qq.com

【中圖分類號】R273

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.03.009

作者簡介：張潤蓮(1974- )，女，本科，副主任醫(yī)師。研究方向：中醫(yī)腫瘤臨床和針灸教學(xué)工作。E-mail： 109798530@qq.com