兩種石斛的水溶性多糖和堿溶性多糖體外抗氧化活性的研究

嚴(yán)慕賢，周雅亮，藍(lán)義琨，李子鴻，雷凱君，李文瑋，黃凱偉

(1.佛山市中醫(yī)院 藥劑科，廣東 佛山 528100； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 新藥中心，廣東 廣州510006)

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兩種石斛的水溶性多糖和堿溶性多糖體外抗氧化活性的研究

嚴(yán)慕賢1，周雅亮1，藍(lán)義琨1，李子鴻1，雷凱君1，李文瑋1，黃凱偉2

(1.佛山市中醫(yī)院 藥劑科，廣東 佛山 528100； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 新藥中心，廣東 廣州510006)

摘要:目的 比較金釵石斛、鐵皮石斛的水溶性多糖和堿溶性多糖的抗氧化活性。方法 紫外分光光度法測定兩種石斛多糖抗氧化自由基的清除率。 結(jié)果 金釵石斛水溶性多糖和堿溶性多糖、鐵皮石斛水溶性多糖和堿溶性多糖對羥自由基的清除率分別是112.69%、52.24%、69.40%、113.43%，對H2O2的清除率分別是38.87%、17.51%、18.69%、37.09%，對DPPH·的清除率分別是54.74%、48.59%、84.04%、78.02%。結(jié)論 金釵石斛和鐵皮石斛具有一定的體外抗氧化能力。其中，金釵石斛的水溶性多糖的抗氧化能力強(qiáng)于堿溶性多糖。而鐵皮石斛的堿溶性多糖的抗氧化能力較強(qiáng)于水溶性多糖。

關(guān)鍵詞:石斛； 多糖； 抗氧化； 活性

金釵石斛和鐵皮石斛皆屬于2010年版《中華人民共和國藥典》收載的藥用石斛品種?，F(xiàn)代研究已發(fā)現(xiàn)金釵石斛和鐵皮石斛多糖具有一定的抗氧化活性。王建明等[1]研究表明鐵皮石斛多糖對DPPH和ABTS自由基的半數(shù)清除率分別是1.20%和3.65%，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。王再花等[2]研究表明鐵皮、大苞鞘石斛和金釵石斛3種石斛莖段村多糖、精多糖具有不同程度的抗氧化活性。余麗麗等[3]研究表明鐵皮石斛多糖含量達(dá)84.45%，其清除O2-·自由基和·OH自由基的能力均較強(qiáng)。然而，目前對鐵皮石斛和金釵石斛多糖的研究多局限于水溶性多糖，往往忽視了堿溶性多糖的研究價(jià)值，而現(xiàn)代研究已發(fā)現(xiàn)金釵石斛堿溶性多糖具有顯著的抗疲勞作用。本研究將鐵皮石斛和金釵石斛的堿溶性多糖和水溶性多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行比較，為石斛堿溶性多糖的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1材料與儀器

1.1藥材與試藥

鐵皮石斛(批號20140107，廣東丹霞)和金釵石斛(批號20140228，貴州赤水)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院主任藥師黃月純鑒定為鐵皮石斛、金釵石斛的莖；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，批號201308，購自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2主要儀器

CP225D型分析天平(德國Sartorius公司)；DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)；Agilent 8453紫外可見分光光度計(jì)(安捷倫科技有限公司)。

2方法

2.1多糖的提取

取石斛粉末10 g，精密稱定，100 mL 80%(φ)乙醇60 ℃超聲處理1 h，取出，濾過，重復(fù)數(shù)次，至溶液基本無色，烘干。稱質(zhì)量，50倍體積水熱回流提取(90 ℃)2 h，殘?jiān)盀V瓶用熱水洗滌4次，每次10 mL，重復(fù)提取數(shù)次，至濾液苯酚濃硫酸法測定無顯色。合并濾液(殘?jiān)Ａ?，60 ℃真空濃縮至100 mL，為水溶性粗多糖。

殘?jiān)栏?，稱質(zhì)量，10倍體積0.5 mol/L的NaOH溶液于90 ℃熱回流提取2 h，取出，趁熱抽濾，加HCl調(diào)pH至中性，重復(fù)3次，合并濾液，60 ℃真空濃縮至100 mL，為堿溶性粗多糖。

粗多糖加4倍體積無水乙醇沉淀(慢加快攪)，置4 ℃冰箱中放置過夜，取出，5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀分別加80%乙醇、無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌2次，每次10 mL，5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，揮干溶劑。水溶，上清液透析3 d。取出，60 ℃烘干。取1 mg于10 mL容量瓶中，加水補(bǔ)足至刻度，搖勻，得水溶性多糖供試品和堿溶性多糖供試品。

2.2體外抗氧化活性的比較

2.2.1對H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基(·OH)清除率的測定取0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液1 mL，加50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7．4)1.5 mL，加0．75 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，加0.01%的H2O21 mL或多糖溶液2 mL，每加一管立即混勻，最后以純凈水補(bǔ)充總體積至10 mL，反應(yīng)液37 ℃反應(yīng)1 h，于536 nm處測吸光度A。

依上法分別加入不同品種石斛的多糖溶液2 mL后再加入0．01%的H2O2記為A樣品。只加H2O2溶液不加多糖溶液的記為A損傷。只加多糖溶液不加H2O2溶液的記為A未損傷。按照以下公式計(jì)算對羥自由基(·OH)的清除率。

清除率=(A未損傷-A樣品)/A損傷×100%

2.2.2對H2O2清除率的測定加入由50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配制的5 mmol/L的H2O2溶液2.8 mL，再加入不同品種石斛的多糖溶液1.0 mL，用純凈水補(bǔ)齊至10.0mL，室溫放置10 min后，于波長230 nm處測定吸光度值，記為A樣品。依上法不加多糖溶液的記為A損失。只加多糖溶液不加H2O2溶液的記為A未損傷。按照以下公式計(jì)算H2O2的清除率。

清除率=(A未損傷-A樣品)/A損傷×100%

2.2.3對DPPH·清除率的測定取2×10-4moL/L的DPPH(70%乙醇)溶液5 mL，加入0.5 mL不同品種石斛樣品溶液，搖勻，室溫(25 ℃)反應(yīng)30 min；用70%乙醇溶液5 mL代替DPPH溶液，同上述步驟操作配制空白溶液，于波長517 nm處測定吸光度，記為Ai。

取2×10-4moL/L的DPPH(70%乙醇)溶液5 mL，加入0.5 mL蒸餾水，搖勻，室溫反應(yīng)30 min；用70%乙醇溶液5 mL代替DPPH溶液，同上述步驟操作配制空白溶液，于波長517 nm處測定吸光度，記為As。按照以下公式計(jì)算對DPPH·的清除率。

清除率=(As-Ai)/As×100%

3結(jié)果

3.1金釵石斛、鐵皮石斛多糖對H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基(·OH)的清除率

結(jié)果見表1，清除率由強(qiáng)到弱為：鐵皮堿溶性多糖>金釵水溶性多糖>鐵皮水溶性多糖>金釵堿溶性多糖。鐵皮石斛堿溶性多糖和金釵石斛水溶性多糖清除H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基(·OH)的能力較強(qiáng)，達(dá)90%以上。金釵石斛堿溶性多糖清除H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基(·OH)的能力最弱，但仍能達(dá)52.24%。

3.2金釵石斛、鐵皮石斛多糖對H2O2的清除率

結(jié)果見表2，對H2O2的清除率由強(qiáng)到弱為：金釵水溶性多糖>鐵皮堿溶性多糖>鐵皮水溶性多糖>金釵堿溶性多糖。金釵石斛水溶性多糖和鐵皮石斛堿溶性多糖清除H2O2的能力較強(qiáng)，其堿溶性多糖可達(dá)38%左右。

表1　金釵石斛、鐵皮石斛多糖對H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基(·OH)的清除作用

表2　金釵石斛、鐵皮石斛多糖對H2O2的清除作用

3.3金釵石斛、鐵皮石斛多糖對DPPH·清除率

結(jié)果見表3,對DPPH·的清除率由強(qiáng)到弱為：鐵皮水溶性多糖>鐵皮堿溶性多糖>金釵水溶性多糖>金釵堿溶性多糖。兩種石斛的水溶性多糖溶液清除DPPH·的能力普遍強(qiáng)于堿溶性多糖溶液。

表3金釵石斛、鐵皮石斛多糖對DPPH·的清除作用

Table 3Effect of polysaccharides from two kinds of dendrobiums on clearance of DPPH·

多糖類別As均值A(chǔ)i均值清除率/%金釵石斛水溶性多糖0.1370.06254.74堿溶性多糖0.1420.07348.59鐵皮石斛水溶性多糖0.1940.03184.04堿溶性多糖0.1910.04278.02

4討論

現(xiàn)代研究已發(fā)現(xiàn)金釵石斛和鐵皮石斛多糖具有一定的抗氧化活性。王爽等[4]對石斛多糖的抗氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)石斛多糖具有清除羥基自由基和超氧陰離子自由基的作用,可顯著提高小鼠血清和肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)的活性，具有明顯的抗氧化活性。羅建平等[5]研究表明鐵皮石斛多糖除了在清除活性氧O2-自由基體系中無抗氧化作用外，在其他體系(包括DPPH自由基體系,金屬離子螯合體系、還原力體系、Fe2+-VC誘導(dǎo)的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化體系等)均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。其抗氧化活性大小與其相對分子質(zhì)量有關(guān)，還可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。賓宇波等[6]也對鐵皮石斛多糖的抗氧化活性進(jìn)行了研究，在3項(xiàng)抗氧化能力(DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率以及在p-胡蘿卜素-亞油酸體系中的抗氧化作用)測定中,均超過了50%以上的抗氧化能力,說明鐵皮石斛多糖具有較強(qiáng)的生理活性。

現(xiàn)代研究包括中國藥典對石斛多糖的提取都采用水提醇沉法，而忽視了酸溶性多糖(堿性多糖)或堿溶性多糖(酸性多糖)。由于H+的存在抑制了酸性雜質(zhì)的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖產(chǎn)品純度相對較高，但可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂，除弱酸外，一般不宜采用[7]。而多糖在堿性溶液中穩(wěn)定，例如黏多糖的提取多采用堿提取法[8]。堿有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，縮短提取時(shí)間，但提取液中含有其他雜質(zhì)，使黏度過大，過濾困難[9]。近年來，部分多糖類成分較多的植物中藥已經(jīng)開展了對堿溶性多糖的相關(guān)研究。其中有學(xué)者對金釵石斛的水溶性、堿溶性和酸溶性多糖進(jìn)行了小鼠抗疲勞作用的比較，結(jié)果其堿溶性多糖的抗疲勞作用最為明顯，可顯著延長小鼠游泳時(shí)間,提高血糖和三酰甘油含量并降低血乳酸和血氨含量,降低游泳后肝糖原及肌糖原的消耗[10]。

本研究對兩種石斛的水溶性多糖和堿溶性多糖的抗氧化能力進(jìn)行了比較，結(jié)果表明金釵石斛和鐵皮石斛具有一定的體外抗氧化能力。其中，金釵石斛的水溶性多糖的抗氧化能力強(qiáng)于堿溶性多糖。而鐵皮石斛相反，其堿溶性多糖的抗氧化能力普遍強(qiáng)于水溶性多糖。鐵皮石斛清除·OH和H2O2的抗氧化活性，與文獻(xiàn)報(bào)道[2-4]相比活性稍弱。究其原因可能為文獻(xiàn)多采用某一純化多糖單糖作為研究對象，其某種多糖單體的抗氧化活性高于總多糖的抗氧化活性所導(dǎo)致。

總體而言，金釵石斛在開發(fā)抗氧化活性這方面研究時(shí)應(yīng)優(yōu)先選擇水溶性多糖，而鐵皮石斛可能更偏向于堿溶性多糖，下一步將對石斛堿溶性多糖的其他生物活性進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Antioxidant activities of water-soluble and alkali-soluble polysaccharides derived from two kinds of dendrobiums

YAN Muxian1,ZHOU Yaliang1,LAN Yikun1,LI Zihong1,LEI Kaijun1,LI Wenwein1,HUANG Kaiwei2

(1.DepartmentofPharmacy,TraditionalChineseMedicalHospitalofFoshan,Foshan528000,China;2.GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou511400,China)

Abstract:Objective To compare the antioxidant activity of water-soluble and alkali-soluble polysaccharides in Dendrobium nobile Lindl and Dendrobium officinale Kimura et Migo. Methods The antioxidant activity was determined by ultraviolet spectrophotometric method. Results The scavenging rates of hydroxyl radical on the water-soluble and alkali-soluble polysaccharides derived from Dendrobium nobile and Dendrobium officinale were 112.69%,52.24%,69.40% and 113.43%,respectively. The scavenging rates of H2O2 were 38.87%,17.51%,18.69% and 37.09%. The scavenging rates of DPPH· were 54.74%,48.59%,84.04% and 78.02%. Conclusion Two kinds of dendrobiums display a certain degree of antioxidant activities in vitro. Antioxidation of water-soluble polysaccharide is better than alkali-soluble polysaccharide in Dendrobium nobile. By contrast,antioxidation of alkali-soluble polysaccharide is better in Dendrobium officinale.

Key words:dendrobium; polysaccharide; antioxidant; activity

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015112901

中圖分類號:R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1006-8783(2016)01-0088-04

作者簡介：嚴(yán)慕賢(1990—)，女，碩士，藥師，主要從事中藥新藥制劑與指紋圖譜研究，Email：414263621@qq.com。

收稿日期：2015-11-29

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-19 15:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160119.1537.001.html