延邊黃牛胚胎移植技術(shù)研究

金貞愛,姚雪瑞,高青山,許永男,李英花

（1.琿春市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,吉林延邊133000；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林延邊133000）

延邊黃牛胚胎移植技術(shù)研究

金貞愛1,姚雪瑞2,高青山2,許永男2,李英花2

（1.琿春市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,吉林延邊133000；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林延邊133000）

試驗以延邊黃牛作為受體母牛,通過胚胎移植技術(shù)改善肉牛繁殖效率,增加母牛產(chǎn)仔率.延邊黃牛體外生產(chǎn)胚胎移植時分為同期發(fā)情組1、同期發(fā)情組2和自然發(fā)情組,同期發(fā)情組1的受胎率最高,為29.63%,自然發(fā)情組的受胎率最低,為21.43%.首次獲得了地方特色品種延邊黃牛的體外受精胚胎移植牛.

延邊黃牛；同期發(fā)情；胚胎移植

2013年我國肉牛業(yè)繼續(xù)推進(jìn)戰(zhàn)略轉(zhuǎn)型,散養(yǎng)戶加速退出,規(guī)模化養(yǎng)殖比重逐步擴(kuò)大,商品牛源持續(xù)緊張,導(dǎo)致肉牛價格不斷飆升,因此,提高肉?；A(chǔ)數(shù)量是目前尚待解決的首要問題.2014年我國規(guī)?；概ｐB(yǎng)殖比重的擴(kuò)大將成為肉牛業(yè)轉(zhuǎn)型發(fā)展的主要表現(xiàn)形式,保證母牛存欄頭數(shù)、縮短產(chǎn)犢間隔和提高繁殖效率是一個行之有效的解決辦法[1].胚胎移植作為一門新興技術(shù)能夠有效減少疾病傳播機(jī)率,是提高母牛產(chǎn)仔效率的重要手段之一.目前,胚胎移植技術(shù)主要在奶牛業(yè)應(yīng)用廣泛,但還未推廣到肉牛業(yè).因此,通過研究,可以試用飼養(yǎng)量較大的奶牛作為受體母牛,實(shí)施奶牛產(chǎn)肉牛的生產(chǎn)方試,不僅可以緩解肉牛來源等問題,還能夠有效改善奶牛飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)效益.

延邊黃牛作為中國黃牛五大優(yōu)良品種之一,在優(yōu)質(zhì)牛肉生產(chǎn)上占有一席之地,是不可或缺的優(yōu)秀品種[2-3],但也同樣面臨著“牛源緊張”的問題.經(jīng)過調(diào)查,延邊黃牛存欄數(shù)由2007年的85萬頭左右,下降到2014年的55萬頭左右,下降了35%,可謂形式非常嚴(yán)峻,2015年國家出臺良種可繁母牛補(bǔ)貼政策,但國內(nèi)肉牛存欄增速緩慢；國家大力推進(jìn)戰(zhàn)略轉(zhuǎn)型,散養(yǎng)戶加速退出,但散養(yǎng)戶及小規(guī)模養(yǎng)牛戶仍是目前國內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)的主體.因此,通過先進(jìn)技術(shù)手段改善肉牛繁殖效率,增加母牛產(chǎn)仔率等,是解決目前牛源問題的有效方法.同期發(fā)情技術(shù)、胚胎移植技術(shù)等生物技術(shù)的研究、改良及推廣,能夠加速規(guī)?；B(yǎng)殖進(jìn)程,在地方特色品種的保護(hù)和擴(kuò)繁上發(fā)揮關(guān)鍵作用.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胚胎來源于動物胚胎工程實(shí)驗室生產(chǎn)的延邊黃牛體外受精胚胎.受體牛為本地延邊黃牛,吉林瑞甸源生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司50頭,延邊大學(xué)動物科學(xué)系教學(xué)牧場20頭.

GnRh、PGF2a、CDIR、維生素ADE均購自韓國L&H生命工學(xué)研究所；移植槍、塑料硬外套、無菌軟外套、細(xì)管、細(xì)管剪、陰道埋植器等均購自韓國.

1.2 試驗方法

1.2.1 受體牛的選擇考慮到胚胎不能長時間運(yùn)輸?shù)脑?從牛來源處運(yùn)輸至本地飼養(yǎng),實(shí)驗室到教學(xué)牧場路程僅30 min.為了減少交通運(yùn)輸應(yīng)激對試驗結(jié)果的影響,提前2個月在吉林瑞甸源生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司挑選3～5歲經(jīng)產(chǎn)受體牛50頭[4],首先通過血液檢查排除有病的牛；再通過直腸檢查淘汰有生殖疾病的牛,如子宮內(nèi)膜炎,卵巢囊腫,子宮頸畸形等；另淘汰營養(yǎng)水平過高或過低的牛；最后考慮體型外貌適中的牛運(yùn)回教學(xué)牧場,科學(xué)飼養(yǎng)管理,減少運(yùn)輸應(yīng)激,做好移植準(zhǔn)備.

1.2.2 同期發(fā)情處理同期發(fā)情組1：隨機(jī)選擇一天注射3 mL維生素ADE,過14 d注射GnRh 2 mL/頭、同時將CIDR植入陰道記為第1天,第8天注射PGF2a2 mL/頭并去除CIRD,第10天注射GnRh 2 mL/頭, 12～16 h內(nèi)觀察發(fā)情情況并準(zhǔn)確記錄,第17天進(jìn)行胚胎移植,移植時檢查黃體發(fā)育情況[5],發(fā)育不完全的不移植.

同期發(fā)情組2：不肌注維生素ADE,第1天注射GnRh 2 mL/頭、同時將CIDR植入陰道,第8天注射PGF2a 2 mL/頭,第10天去除CIRD并注射GnRh 2 mL/頭,12～16 h內(nèi)觀察發(fā)情情況并準(zhǔn)確記錄,第17天進(jìn)行胚胎移植,移植時檢查黃體發(fā)育情況[4],發(fā)育不完全的不移植.

1.2.3 胚胎移植在體視顯微鏡下觀察受精卵的形態(tài)、色調(diào)、分裂球的大小、均勻度、細(xì)胞的密度、與透明帶的間隙以及變性情況等.選擇內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層界線清晰、胚泡腔明顯、細(xì)胞充滿透明帶內(nèi)腔、形態(tài)完整、輪廓清晰、呈球形、分裂球大小均勻、結(jié)構(gòu)緊湊、色調(diào)和透明帶適中、無附著的細(xì)胞和液泡的胚胎裝胚.

胚胎移植時可用0.25 mL細(xì)管分3段吸入IVCⅡ培養(yǎng)液,中間由兩個氣泡隔開,中段含有兩枚胚胎.裝胚后要在體視顯微鏡下檢查確認(rèn)胚胎是否在細(xì)管里.

移植時先用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精棉球消毒裝有胚胎的塑料吸管,然后剪掉封口一端,裝入移植槍內(nèi),套上保護(hù)外套.采用直腸把握法進(jìn)行移植,先將受體牛在保定架上保定好,在尾椎注射體積分?jǐn)?shù)2%的鹽酸利多卡10 mL,等尾部變軟無力后開始移植,麻醉不完全子宮頸發(fā)硬、操作時不靈活且延長移植時間對胚胎生存不利.因移植槍外有無菌軟外套移植前不必嚴(yán)格消毒受體牛外陰,只做一般清洗即可,然后直腸檢查受體牛黃體發(fā)育情況,受體牛黃體要光滑、有彈性且質(zhì)地充實(shí),直徑在10 mm以上,黃體狀態(tài)不好不移植.移植時用左手扒開外陰,右手持移植器插入陰道,然后左手伸進(jìn)直腸握住子宮頸,移植器到達(dá)子宮頸口時,助手將軟外套扯破,左手從下方握住子宮頸也就是手背向下子宮頸在手掌上方,慢慢將子宮頸套入移植槍,也就是右手不用任何力量,只掌握方向,左手在直腸內(nèi)誘導(dǎo)使槍頭穩(wěn)穩(wěn)地送入黃體發(fā)育側(cè)子宮角至大彎處緩緩?fù)迫肱咛?而非傳統(tǒng)的用右手將移植槍插入子宮頸.本研究的方法熟練掌握后移植時間大大減少,而且對受體牛的生殖系統(tǒng)損傷非常小.出槍時也要注意不要損傷子宮內(nèi)膜,出槍后馬上消毒待用（見圖1）.

圖1 體外受精胚胎移植操作過程Tab.1 Effects of different treatments on transfer rate and pregnancy rate in Yanbian yellow cattle

2 結(jié)果與分析

不同處理組對延邊黃牛受胎率和產(chǎn)犢率的影響結(jié)果見表1.

表1 不同處理組對延邊黃牛受胎率和產(chǎn)犢率的影響Tab.1 Effects of different treatments on transfer rate and pregnancy rate in Yanbian yellow cattle

由表1可知,同期發(fā)情組1（添加維生素ADE）、同期發(fā)情組2和自然法各組之間無顯著差異（P＜0.05）,其中受胎率最高組為同期發(fā)情組1,共同期發(fā)情43頭,胚胎移植27頭,妊娠8頭,產(chǎn)犢7頭,其受胎率和產(chǎn)犢率分別是29.63%和16.28%；受胎率最低組為自然發(fā)情組,共胚胎移植19頭,妊娠4頭,產(chǎn)犢2頭（雙胎）見圖2,其受胎率和產(chǎn)犢率分別是21.43%和10.53%；同期發(fā)情組2共同期發(fā)情49頭,胚胎移植38頭,妊娠10頭,產(chǎn)犢8頭,其受胎率和產(chǎn)犢率分別是26.28%和21.05%.

圖2 延邊黃牛體外受精胚胎移植產(chǎn)雙胎牛Fig.2 The twins cattle by in vitro fertilization and embryo transfer

3 討論與結(jié)論

受體牛的綜合體況是實(shí)施胚胎移植工作的首要條件[6],在選擇受體母牛時,應(yīng)按程序要求嚴(yán)格進(jìn)行直腸檢查,以確保受體牛空懷,沒有卵巢、子宮等功能性疾病[7].這里要注意的是交通運(yùn)輸應(yīng)激可能對受體牛有持續(xù)較長時間的影響,建議受體牛在移植前3個月不要長距離移動.

自然發(fā)情與同期發(fā)情比較,自然發(fā)情比同期發(fā)情經(jīng)濟(jì)成本底,但發(fā)情率遠(yuǎn)不如同期發(fā)情的發(fā)情率,這在放牧飼養(yǎng)中采用自然交配時比較合理,但如果采用人工受精和胚胎移植就會有發(fā)情鑒定出現(xiàn)誤差[8],在人工受精或胚胎移植時容易錯過最佳時機(jī)的可能,且自然交配易出現(xiàn)交叉感染現(xiàn)象.今后肉牛產(chǎn)業(yè)的走向是母牛向規(guī)模化、工廠化發(fā)展,此時采用同期發(fā)情雖然成本上有一定增長,但從提高母牛繁殖力角度出發(fā)是節(jié)省經(jīng)濟(jì)成本的；而且通過同期發(fā)情還可以調(diào)節(jié)勞動強(qiáng)度和節(jié)省勞動力,如可以在有著上千頭母牛的大規(guī)模繁殖場有計劃的安排發(fā)情,這樣也可以避開惡劣的環(huán)境產(chǎn)仔,如北方的冬季,提高犢牛成活率,間接降低生產(chǎn)成本.

維生素ADE能有效改善受體牛的營養(yǎng)狀況從而提高胚胎移植受胎率,但本研究試驗結(jié)果與其它兩組沒有顯著性差異,可能與肌注的量和時間有關(guān),本研究選擇肌注時間為同期發(fā)情開始之前.與韋英明等2000年的研究結(jié)果相同,可能是試驗牛數(shù)量過少,不能在統(tǒng)計上顯示差異,需要進(jìn)一步研究[9].發(fā)情鑒定是否準(zhǔn)確是提高胚胎移植受胎率的關(guān)鍵基礎(chǔ),體外胚胎生產(chǎn)就是高度模擬體內(nèi)發(fā)育的環(huán)境.只有準(zhǔn)確的發(fā)情鑒定才能使胚胎從體外移植到體內(nèi)后對接其發(fā)育的連續(xù)性,鑒定的發(fā)情時間誤差過大就會導(dǎo)致胚胎與體內(nèi)環(huán)境不能同期化,影響胚胎正常桌床發(fā)育成胎兒.本研究胚胎移植采用2枚胚胎,結(jié)果出現(xiàn)了一對雙胎,其中一頭牛1周后死亡.誘發(fā)雙胎和死亡一頭可能屬偶發(fā)現(xiàn)象,沒有統(tǒng)計學(xué)意義,但值得進(jìn)一步研究的是雙胎中死亡一頭,是否是雙胎牛在胎兒期因營養(yǎng)競爭不利于存活.

研究妊娠檢查是在胚胎移植30 d后經(jīng)B超檢查一次,120 d直腸檢查一次,4月齡、5月齡、6月齡各流產(chǎn)一頭.分析流產(chǎn)原因,可去除營養(yǎng)不良因素,因受體牛全期飼喂妊娠期全價飼料,胚胎質(zhì)量問題導(dǎo)致流產(chǎn)的可能性最高,值得注意的是后期流產(chǎn)3頭牛均為公犢,有待進(jìn)一步深入研究.

延邊黃牛體外生產(chǎn)胚胎移植時同期發(fā)情組1、同期發(fā)情組2、自然發(fā)情組三組數(shù)據(jù)沒有顯著性差異,三者的最高值為同期發(fā)情組1,三者最低組為自然發(fā)情組.首次獲得了地方特色品種延邊黃牛的體外受精胚胎移植牛.

[1]趙航,程瑪麗,劉強(qiáng)德,等.2013年中國肉牛產(chǎn)業(yè)形勢分析及2014年發(fā)展預(yù)測[C].第九屆中國牛業(yè)發(fā)展大會論文集,2014.

[2]姜成國,毛元廷,李香子,等.延邊黃牛公牛與閹牛產(chǎn)肉性能的比較[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報,2011,33（3）：157-162.

[3]王士勇,李鐘淑,金慶國,等.共培養(yǎng)對延邊黃牛重組胚體外發(fā)育的影響[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報,2008,30（3）：192-196.

[4]李玉軒,劉秋霞.青年牛不適宜做胚胎移植[J].中國奶牛,2005（2）：38-39.

[5]李曉鋒,陳明新,蔡銘運(yùn),等.三峽庫區(qū)奶牛胚胎移植試驗初報[J].湖北畜牧獸醫(yī),2004（4）：16-17.

[6]梁坤,王洪寶,韓永勝,等.牛胚胎移植受體的選擇方法[J].黑龍江動物繁殖,2002（2）：15-17.

[7]賀奮義,桑國俊,邱忠玉.牛胚胎移植技術(shù)研究與應(yīng)用[J].中國牛業(yè)科學(xué),2009（3）：25-26.

[8]尹世東,米占鋒,孔偉,等.母牛自然發(fā)情與同期發(fā)情受胎率的對比分析[J].甘肅畜牧獸醫(yī),2013（7）：38-39.

[9]韋英明,盧晟盛,蔣如明,等.維生素ADE和孕馬血清促性腺激素分別結(jié)合前列腺素對母黃牛同期發(fā)情和受胎效果的試驗[J].中國畜牧雜志,2000（1）：31-32.

（責(zé)任編輯：盧奇）

Study on embryo transfer technology of Yanbian yellow cattle

JIN Zhenai1,YAO Xuerui2,GAO Qingshan2,XU Yongnan2,LI Yinghua2
（1.Hunchun City Animal Health Supervision,Yanbian 133000,China；2.Agricultural College of Yanbian University,Yanbian 133000,China）

Yanbian cattle with larger local feeding was used as the recipient cows to improve the breeding efficiency and increase the calving rate of the cow by embryo transfer.The in vitro produced Yanbian yellow cattle embryos were transfer to estrus synchronization group 1,estrus synchronization group 2 and natural estrus group of the recipient cattle.The pregnancy rate was highest value in the estrus synchronization group 1（29.63%）,and lowest in the natural estrus group（21.43%）.Yanbian yellow cattle was first produced by transfer of the in vitro fertilized embryos.

Yanbian yellow cattle；embryo transfer；estrus synchronization

S823.3

A

1008-7516（2016）06-0038-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.06.010

2016-11-03

吉林省科技廳“雙十工程”重大科技攻關(guān)項目（20140201004NY）

金貞愛（1967—）,女,朝鮮族,吉林蛟河人,畜牧獸醫(yī)師.主要從事畜牧學(xué)研究.

李英花（1981—）,女,朝鮮族,吉林汪清人,博士,實(shí)驗師.主要從事胚胎工程研究.