托珠單抗對全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎CD4、CD8+T/CD19+ B細(xì)胞及免疫球蛋白表達的調(diào)控

李洪偉，曾華松

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心過敏免疫風(fēng)濕病科， 廣州 528000)

ChinJAllergyClinImmunol，2016，10(4)：357- 364

全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎是一組具有全身癥狀(弛張高熱、皮疹、肝脾淋巴結(jié)腫大等)以及多種炎癥指標(biāo)(C反應(yīng)蛋白、鐵蛋白等)升高的慢性關(guān)節(jié)炎癥，可并發(fā)巨噬細(xì)胞活化綜合征導(dǎo)致死亡[1]。全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的傳統(tǒng)治療包括口服糖皮質(zhì)激素、甲氨蝶呤、硫酸羥氯喹等，但療效較差，大劑量激素使用可以控制病情進展，但激素不良反應(yīng)在治療后期卻不斷顯現(xiàn)[2]。

目前認(rèn)為，全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病主要由于細(xì)胞免疫功能紊亂，引起多種炎癥因子[腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 6、IL- 1β等]的異常分泌[3]。而大量研究數(shù)據(jù)表明，IL- 6及其受體在全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中起著重要的作用[4]。托珠單抗[5]是一種重組人源化抗人IL- 6受體單克隆抗體，由中國倉鼠卵巢(Cricetulus griseus，hamster，Chinese，CHO)細(xì)胞通過DNA重組技術(shù)制得。通過特異性的阻斷IL- 6受體，降低Janus激酶(Janus kinase，JAK)/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)3激活，可下調(diào)輔助性T 細(xì)胞17(T helper cell 17, Th17)細(xì)胞的生成，有利于緩解關(guān)節(jié)癥狀以及下調(diào)炎癥因子(TNF-α、IL- 17等)的表達，從而控制病情進展。目前歐洲等發(fā)達國家已經(jīng)有關(guān)于托珠單抗治療全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的大樣本的臨床研究[6- 8]，而中國的研究主要關(guān)注成人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[9]，兒童方面資料十分匱乏，大部分地區(qū)的醫(yī)院缺乏這類藥物的使用數(shù)據(jù)。本項目旨在從免疫學(xué)角度，研究托珠單抗聯(lián)合緩解病情抗風(fēng)濕藥(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)如何調(diào)控機體的細(xì)胞、體液免疫功能，從而降低炎癥指標(biāo)，緩解病情，為中國廣大兒科醫(yī)師提供一些指導(dǎo)建議。

對象和方法

研究對象

復(fù)發(fā)和排除標(biāo)準(zhǔn)：病程中再次發(fā)熱或發(fā)熱時間≥4 d(體溫>37.5 ℃)，C反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率、鐵蛋白升高，無明顯感染或感染控制后可認(rèn)為復(fù)發(fā)。需排除有復(fù)發(fā)性的細(xì)菌性、支原體、病毒性、真菌性、分枝桿菌性或其他感染的病史或入選本研究時有活動性感染，骨髓細(xì)胞學(xué)檢測血液性疾病，影像學(xué)發(fā)現(xiàn)腫瘤，TNF-α抑制劑治療失敗者或曾經(jīng)接受過細(xì)胞消除療法的患者。

研究方案獲得本單位倫理委員會批準(zhǔn)，受試對象均簽署了書面知情同意書。

方法及觀察指標(biāo)

托珠單抗組給予甲氨蝶呤+糖皮質(zhì)激素+托珠單抗，托珠單抗按體質(zhì)量>30 kg、8 mg/kg，<30 kg、12 mg/kg，每兩周一次返院注射，而對照組則給予甲氨蝶呤+糖皮質(zhì)激素+安慰劑(維生素C)，兩組均觀察癥狀緩解情況。

觀察指標(biāo)：對比治療12周前后紅細(xì)胞沉降率、C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、鐵蛋白、血脂、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgE和CD3+、CD4+、CD8+T、CD19+B、CD16+56-自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞的變化。

統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)　　果

受試者的基線資料

強大的整機設(shè)計開發(fā)能力體現(xiàn)在對數(shù)控機床進行模塊化設(shè)計和研發(fā)上，使得公司有效縮短了涉及和試制周期，提高了產(chǎn)品更新?lián)Q代的速度，能更好地把握市場機遇。一流的數(shù)控技術(shù)開發(fā)能力則給了公司通過合理、綜合運用多種技術(shù)的手段去不斷提升產(chǎn)品的系統(tǒng)性、自動化程度、加工精度、響應(yīng)速度及智能化程度。先進的核心精密部件制造技術(shù)則是指公司自主加工工作移動結(jié)構(gòu)、砂輪架主軸等核心部件時，選用質(zhì)優(yōu)材料，使用高精度機床配合合理的工藝進行精密加工或超精密加工。

托珠單抗組及對照組基本資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可以進行對照試驗，期間未有患者脫落(表1)。

表1　兩組患兒基線資料Table 1　Baseline data between two groups

療效分析

托珠單抗對美國風(fēng)濕病學(xué)會(American College of Rheumatology,ACR)評分影響：托珠單抗組12周治療后，達到ACR20、ACR50、ACR70比例均大于對照組(表2)。

托珠單抗對炎癥指標(biāo)影響：見圖1。托珠單抗組炎癥指標(biāo)C反應(yīng)蛋白、鐵蛋白、紅細(xì)胞沉降率下降較對照組明顯(圖1A～C)，并且從第2次用藥后，炎癥指標(biāo)均可降至正?；虻椭?，下降速度較對照組快，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時，12周治療中，托珠單抗組每兩周減激素4 mg至最低劑量隔天維持，期間未發(fā)現(xiàn)病情復(fù)發(fā)。對照組12周內(nèi)，激素減量出現(xiàn)復(fù)發(fā)共6例，感染誘發(fā)2例。治療12周內(nèi)，托珠單抗組血紅蛋白上升幅度明顯高于對照組(圖1E)；托珠單抗組血小板濃度隨著治療時間呈上升趨趨勢，其中2例甚至高出正常2～3倍，對照組則變化不大(圖1F)。1例全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)巨噬細(xì)胞活化綜合征使用阿達木單抗+激素+緩解病情抗風(fēng)濕藥后，紅細(xì)胞沉降率、C反應(yīng)蛋白在初始降低后，一直呈現(xiàn)上升趨勢，而使用托珠單抗+激素+緩解病情抗風(fēng)濕藥后，則逐漸降至正常，激素逐漸減量無出現(xiàn)反跳(圖2)Kruskal-Wallis檢驗示P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；白細(xì)胞計數(shù)Kruskal-Wallis檢驗P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2　兩組全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎患兒治療12周后達到ACR20、ACR50、ACR70比例Table 2　The proportion of ACR30, ACR50, ACR70 was higher in the Tocilizumab group than the control group after 12 weeks treatment　[例(%)]

ACR：美國風(fēng)濕病學(xué)會

圖1兩組全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎患兒治療12周前后炎癥指標(biāo)變化情況

Fig1Change of inflammation index between two groups of systemic juvenile idiopathic arthritis before and after 12 weeks of treatment

A：C反應(yīng)蛋白(CRP)；B：紅細(xì)胞沉降率(ESR)；C：鐵蛋白(FER)；D：白細(xì)胞(WBC)；E：血紅蛋白(HB)；F：血小板(PLT)

托珠單抗對免疫指標(biāo)影響：托珠單抗組治療12周后IgG、IgM、IgA、IgE及CD19+B細(xì)胞較對照組下降明顯(表3)，并低于基線水平(P<0.05)；CD3+、CD8+比例較基線上升，CD4+T、CD19+B降低，K-W檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，對照組則無明顯改變(P>0.05)。CD16+56-NK細(xì)胞兩組均無明顯變化(P<0.05)。

圖2托珠單抗治療1例全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎并發(fā)巨噬細(xì)胞活化綜合征

Fig2A case of systemic juvenile idiopathic arthritis with macrophage activation syndrome (MAS) treated with tocilizumab

CRP:C反應(yīng)蛋白； ESR:紅細(xì)胞沉降率； Ada:阿達木單抗； TCZ:托珠單抗

分組CD3+T(%)CD4+T(%)CD8+T(%)CD19+B(%)CD16+56-NK(%)對照組治療前68.50±11.8033.00±8.1031.75±9.6715.70±8.9314.00±9.34 治療后66.10±11.5933.16±9.3828.50±9.7422.66±8.5811.72±7.15托珠單抗組治療前68.19±18.7731.75±12.3332.00±19.1218.77±12.1711.56±10.26 治療后75.62±13.3331.13±8.5036.34±19.3615.85±12.506.99±3.28分組IgG(g/L)IgM(g/L)IgA(g/L)IgE(g/L)對照組治療前12.55±2.131.77±0.621.86±0.79251.60±166.81 治療后11.64±3.441.66±0.671.69±0.82223.60±271.00托珠單抗組治療前11.56±2.991.37±0.381.50±0.90241.87±113.36 治療后8.35±2.321.18±0.391.19±0.6285.75±82.54

不良事件評價

托珠單抗組(n=8)使用12周，6例(75%)出現(xiàn)較基線轉(zhuǎn)氨酶輕度升高，2例(25%)出現(xiàn)上呼吸道感染，托珠單抗組1例注射2周后出現(xiàn)一過性轉(zhuǎn)氨酶升高，轉(zhuǎn)氨酶升高至正常2～3倍，加強護肝、托珠單抗減半量治療后，恢復(fù)正常。對照組(n=10)2例(20%)出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高，4例(40%)出現(xiàn)上呼吸道感染。兩組均未見嚴(yán)重并發(fā)癥(三系減少、嚴(yán)重感染、惡性腫瘤等)發(fā)生。

血脂濃度升高：第12周時，與基線比較，托珠單抗組8例均出現(xiàn)血脂(包括空腹總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、三酰甘油)水平升高，高于正常值；對照組未出現(xiàn)明顯的血脂變化。同時，托珠單抗組血小板濃度呈上升趨勢，10～12周達到高峰，為基線值的2～3倍；對照組未見明顯的上升峰。12周內(nèi)均未觀察到心血管事件、血栓形成的增加。

過敏和耐藥：托珠單抗組治療期間均未出現(xiàn)過敏(皮疹、腹瀉、發(fā)熱等)或耐藥情況。

討　　論

全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎治療一直是醫(yī)學(xué)界的難點，傳統(tǒng)的DMARDs及TNF-α拮抗劑對改善病情效果不佳，長期使用激素帶來的毒副作用遠(yuǎn)大于其治療效果。大量的論據(jù)表明，IL- 6在活動期全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎患兒的外周血中高表達，同時IL- 6相關(guān)的炎癥蛋白如血清淀粉樣蛋白A、C反應(yīng)蛋白等，也明顯升高，提示IL- 6在全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中起著重要作用。IL- 6作為一個炎癥因子，能調(diào)控內(nèi)環(huán)境功能，包括糖代謝和下丘腦垂體腎上腺素軸的調(diào)節(jié)?？梢砸鸢l(fā)熱，誘導(dǎo)急性期蛋白和提高外周血白細(xì)胞計數(shù)[11]。托珠單抗可有效的拮抗IL- 6的游離型或膜型受體，阻斷炎癥信號的傳遞，從而控制病情，早在幾年前該藥在日本、美國已經(jīng)批準(zhǔn)用于全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的治療[12]。本研究顯示IL- 6受體拮抗劑-托珠單抗對于全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的治療有效性、安全性及對免疫細(xì)胞異常激活具有調(diào)理作用。

研究結(jié)果顯示，托珠單抗組ACR評分較對照組有明顯的改善，治療12周后，C反應(yīng)蛋白(圖1A)、紅細(xì)胞沉降率(圖1B)、鐵蛋白(圖1C)下降明顯(P<0.05),并且在托珠單抗組治療后(100%)第2周基本降至正常，發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛等癥狀迅速緩解；對照組炎癥指標(biāo)下降相對緩慢，12周后仍有部分未能降至正常。同時，12周治療中，托珠單抗組激素每2周減量1次，降至最低劑量隔天維持，期間未發(fā)現(xiàn)再燃、復(fù)發(fā)等情況。對照組12周內(nèi)激素減量出現(xiàn)復(fù)發(fā)共6例(60%)，感染誘發(fā)2例(20%)。已有不少研究表明，托珠單抗對聯(lián)合DMARDs藥物療效不佳的全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、TNF-α拮抗劑或抑制劑治療無效的幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，仍有效果,并具有良好的安全性[13]。關(guān)于成人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎研究，托珠單抗單藥治療早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的療效優(yōu)于甲氨蝶呤單藥治療[14- 15]。

本研究顯示，托珠單抗組對轉(zhuǎn)氨酶的升高有一定的影響，其中有1例(12.5%)出現(xiàn)一過性的轉(zhuǎn)氨酶升高，為正常值2～3倍，特別是同時服用甲氨蝶呤時更應(yīng)注意，應(yīng)定期檢測肝功能情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶異常時，應(yīng)及時調(diào)整劑量，甚至停藥。托珠單抗最主要的不良反應(yīng)為感染，國內(nèi)外均有不少研究顯示，托珠單抗可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞降低，但未表明與感染相關(guān)[16- 17]。本研究也發(fā)現(xiàn)托珠單抗組均存在血脂代謝異常，表現(xiàn)為三酰甘油、低密度脂蛋白等升高；同時，隨著治療時間的延長，血小板呈現(xiàn)上升的趨勢，需密切觀察血栓形成、心血管事件的發(fā)生。治療必要時，給予降脂、抗凝藥物。

托珠單抗不僅可以改善全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的病情，同時還具有免疫調(diào)理作用。IL- 6參與B細(xì)胞的終末分化以及維持漿細(xì)胞的存活。記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞均高表達IL- 6受體，因此阻斷IL- 6可抑制漿細(xì)胞的分化和存活以及免疫球蛋白的分泌。托珠單抗組治療12周后免疫球蛋白IgA、IgG、IgM、CD19+B細(xì)胞計數(shù)均較基線明顯降低(P<0.05)，而對照組則無明顯變化(P>0.05)，提示阻斷IL- 6可調(diào)節(jié)亢進的體液免疫，這與國外報道[18]一致。本研究尚未對托珠單抗組進行治療后的關(guān)節(jié)MRI檢測，但從患兒癥狀以及疼痛評分、關(guān)節(jié)腫脹的消退，可判斷關(guān)節(jié)炎癥較用藥前有明顯好轉(zhuǎn)。

不少研究表明，IL- 6可促進T細(xì)胞分化，IL- 6受體拮抗后，降低抗CD3/CD28抗體生產(chǎn)，抑制抗CD3/CD28抗體誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞分化[19]。托珠單抗組CD4+T、CD19+B細(xì)胞的比例較基線降低(P<0.05)，CD8、CD3+T細(xì)胞比例較基線升高，提示托珠單抗對T細(xì)胞有一定的調(diào)節(jié)作用。同時IL- 6參與Th17細(xì)胞的分化，在 IL- 6、IL- 23 等炎癥因子的刺激下，促進CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，分泌大量IL- 17，從而誘導(dǎo)滑膜成纖維細(xì)胞表達大量核因子-κB受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κ B ligand，RANKL)蛋白導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞[20]。托珠單抗可通過阻斷IL- 6下調(diào)T細(xì)胞表達，從而減輕關(guān)節(jié)破壞，這也有助于解釋患兒關(guān)節(jié)癥狀緩解的原因。

目前認(rèn)為全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎與固有免疫功能障礙有密切關(guān)系，主要為CD16+56-NK細(xì)胞吞噬功能障礙，刺激T淋巴細(xì)胞大量激活，分泌大量炎癥因子。研究表明嚴(yán)重類型的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，托珠單抗的療效可能與外周血中的CD16+56-NK細(xì)胞濃度有關(guān)[21],這是因為NK細(xì)胞表面存在IL- 6的受體, IL- 6刺激可通過調(diào)節(jié)CD16+56-NK細(xì)胞Src 同源區(qū) 2(Src-homology domain 2，SH2)蛋白酪氨酸磷酸酶(SH2-containing protein tyrosine phos-phatase，SHP)2的表達，降低其活性以及下調(diào)顆粒酶B、穿孔素分泌(P<0.05)。而加入抗IL- 6抗體后，可有利于CD16+56-NK細(xì)胞功能的恢復(fù)[22]。本研究1例全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)巨噬細(xì)胞活化綜合征患兒，使用多種TNF-α拮抗劑(阿達木單抗、依那西普等)、激素及DMARDs藥物后，紅細(xì)胞沉降率、C反應(yīng)蛋白仍不能降至正常水平，并有持續(xù)左踝關(guān)節(jié)腫脹，多次激素減量時出現(xiàn)再燃，而第2次托珠單抗注射后紅細(xì)胞沉降率、C反應(yīng)蛋白逐漸降低、關(guān)節(jié)腫脹緩解，較使用阿達木單抗時，有明顯差異(P<0.05)。兩組CD16+56-NK細(xì)胞較基線變化不明顯(P>0.05)，推測可能由于托珠單抗主要改善CD16+56-NK細(xì)胞功能，恢復(fù)其自然殺傷的識別能力。

綜上所述，托珠單抗能有效的緩解活動期全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的癥狀，迅速的降低炎癥指標(biāo)，對于DMARDs療效不佳者同樣有效，同時，通過阻斷IL- 6的信號傳導(dǎo)，托珠單抗可以調(diào)節(jié)CD4+/CD8+T細(xì)胞的比例，降低CD19+B細(xì)胞，從根本上調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，從而延緩關(guān)節(jié)破壞。但需權(quán)衡感染風(fēng)險、肝功能異常、血脂紊亂等的利弊關(guān)系。

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