紅棗貯藏期間主要病原真菌的分離、鑒定與ITS序列分析

郝莉花++董彩文+++陳春生++縱偉

摘要：為了解紅棗貯藏期間主要病原真菌的污染情況，首先對紅棗表面的真菌進(jìn)行分離，然后經(jīng)過形態(tài)觀察，并結(jié)合 ITS 序列擴(kuò)增、測序和序列比對，對分離的相關(guān)病原菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，有8種真菌菌系在紅棗表面上出現(xiàn)。其中，鏈格孢菌（Alternaria spp.）和青霉（Penicillium spp.） 是主要的菌株，而鏈孢霉屬（Neurospora spp.）、紙葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）是在紅棗貯藏期間新發(fā)現(xiàn)的2種真菌。本研究結(jié)果為控制紅棗采后病害提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紅棗；貯藏期；病原真菌；ITS 序列分析

中圖分類號： TS207.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0304-04

收稿日期：2015-02-14

基金項(xiàng)目：國家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目（編號：2013QK232）。

作者簡介：郝莉花（1979—），女，碩士，工程師，從事食品安全檢測工作。E-mail：zzulispx@126.com。棗屬于鼠李科棗屬植物。棗樹品種多、適應(yīng)性強(qiáng)，其果實(shí)具有豐富的營養(yǎng)，受到消費(fèi)者的青睞，但鮮棗在自然條件下不耐貯藏。目前，由于對貯藏期間棗中病原菌種類及侵染原因缺乏了解，不能采取有效的控制措施，導(dǎo)致病害現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，因真菌病害侵染而導(dǎo)致的腐爛率達(dá)到30%以上，引起紅棗品質(zhì)變差，難以食用，造成嚴(yán)重的損失[1-4]。因此，研究引起紅棗病害的病原菌，從而控制其采后病害，具有重要的意義。近年來，已有研究從貯藏的紅棗鮮果中分離并采用形態(tài)學(xué)的方法鑒定出貯藏過程中引起腐爛病害的一些主要病原真菌[5-8]，但采用ITS序列分析紅棗表面真菌的研究還少見報(bào)道。因此，本研究對紅棗表面的真菌進(jìn)行分離，通過 ITS 序列擴(kuò)增、測序和序列比對，對分離的相關(guān)病原菌進(jìn)行鑒定。為針對性地采取措施對致腐病原菌進(jìn)行控制提供依據(jù)[9-10]。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料干紅棗產(chǎn)自河南省新鄭市，放在無菌樣品袋中，室溫放置1個(gè)月。Taq 酶和dNTP購于TaKaRa 公司。真菌DNA提取試劑盒購于Omega 公司。

1.1.2培養(yǎng)基孟加拉紅培養(yǎng)基（蛋白胨 5 g/L、 葡萄糖10 g/L、 磷酸二氫鉀 1 g/L、 MgSO4·7H2O 0.5 g/L、 孟加拉紅 0.033 g/L、 氯霉素 0.1 g/L、 瓊脂 20 g/L），用蒸餾水溶解以上成分，然后及時(shí)加入孟加拉紅溶液。氯霉素先用少量乙醇溶解后再加入到培養(yǎng)基中，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：先稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水1 000 mL 煮沸30 min，紗布過濾后再加 2% 葡萄糖和 2%瓊脂，121 ℃滅菌15 min。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器PCR 儀產(chǎn)自德國 Eppendorf 公司，電泳儀和電泳槽產(chǎn)自北京六一生物科技有限公司，微量移液器產(chǎn)自德國Eppendorf 公司，潔凈工作臺產(chǎn)自江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司，立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器產(chǎn)自合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司，恒溫培養(yǎng)箱產(chǎn)自上海鴻都電子科技有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1干棗貯藏期間病原菌的分離、純化分別從3批樣品袋中各隨機(jī)選取20顆干棗。將每個(gè)干棗放入盛有100 mL無菌水的250 mL三角瓶中，置搖床上振蕩30 min。從每瓶混合液中取 1 mL溶液加入滅菌平皿中，倒入適量的孟加拉紅培養(yǎng)基混勻制成平板，每瓶混合液做3個(gè)平行平板，凝固后的平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天進(jìn)行觀察。當(dāng)培養(yǎng)出的菌落直徑達(dá)到約1 cm 時(shí)，用接種針挑取少量菌絲接入另一個(gè)含PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；重復(fù)以上操作2～3次后可以得到純化的菌種，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病原真菌總 DNA 的提取將試驗(yàn)菌株的菌絲接種到 PDA 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)2 d。過濾收集菌絲體，經(jīng)過洗滌和干燥倒入液氮進(jìn)行研磨，將勻漿液吸到1.5 mL 滅菌離心管中，按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行基因組 DNA的提取，0.8%瓊脂糖凝膠電泳法檢測 DNA。提取的DNA定量后稀釋，作為PCR 反應(yīng)的模板。

1.2.3rDNA-ITS 序列的擴(kuò)增真菌ITS 區(qū)擴(kuò)增通用引物為ITS-5 （5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS-4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR 反應(yīng)體系為50 μL（10×緩沖液 5 μL），dNTP （2.5 mmol/L） 2 μL，引物（10 μmol/L）各 2 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，用無菌水補(bǔ)足至總體積50 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取 5 μL PCR 產(chǎn)物加 1 μL 6×上樣緩沖液，在2%瓊脂糖凝膠上 120 V 電泳 35 min，用凝膠成像儀進(jìn)行拍照。引物合成、PCR 產(chǎn)物純化及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.4主要病原真菌的形態(tài)顯微鏡觀察真菌形態(tài)。

1.2.5序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建將測序結(jié)果輸入NCBI 基因數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行同源序列搜索，比較未知菌株與已知菌株相應(yīng)序列的同源性。同時(shí)，提取相關(guān)菌株的ITS 區(qū)基因序列，與試驗(yàn)菌株序列一起用Clustal X 軟件進(jìn)行排列，用MEGA 6.0 軟件按照相關(guān)參數(shù)和模型構(gòu)建進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的分離純化

干棗表面分離的病原菌樣品在PDA 培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)4 d后生成的菌落，在顏色大小和菌落形態(tài)特征上都存在差異。28 ℃培養(yǎng)條件下XZJ2、XZJ3、XZJ4、XZJ7、XZJ10菌株在PDA 培養(yǎng)基上生長較好，在5 d內(nèi)大量生長，可以看到較為密集的菌絲薄層，其中XZJ3和XZJ7開始分泌色素。而XZJ9在PDA 培養(yǎng)基上生長緩慢，5 d內(nèi)仍然沒有大量生長（圖1）。

2.2基因組DNA 的提取

采用試劑盒提取真菌基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析（圖2）。

利用DNA 試劑盒提取的真菌基因組DNA 條帶比較清晰，能夠用于下一步的PCR。

2.3rDNA-ITS PCR 擴(kuò)增

以ITS5、ITS4 為引物，經(jīng)PCR 得到的產(chǎn)物條帶特異性好，約600 bp （圖3）。

2.4紅棗貯藏期真菌菌系

將擴(kuò)增的各個(gè)分離菌株的ITS PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和測序，得到的序列與GenBank 上的已知序列進(jìn)行比對（表1）。試驗(yàn)結(jié)果表明，在紅棗干果表面出現(xiàn)的真菌菌系主要有鏈格孢菌（Alternariaspp.）、青霉（Penicillium spp.）、木霉菌（Trichoderma spp.） 鏈孢霉屬（Neurospora spp.）、毛殼屬（Chaetomium spp.）、棱孢殼屬（Thielavia spp.）。其中，鏈格孢菌（Alternaria spp.）和青霉（Penicillium spp.）是紅棗干果貯藏期的優(yōu)勢菌株，平均每個(gè)

紅棗表面上檢出的菌落數(shù)分別是22、1.5個(gè)。

2.5ITS 區(qū)rDNA 同源性比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

由于鏈格孢菌是主要的優(yōu)勢菌株，將分離得到的菌株XZJ1 和XZJ2 的ITS 區(qū) rDNA 基因部分序列與NCBI 基因數(shù)據(jù)庫內(nèi)登錄的已知菌株（表2）的相應(yīng)序列進(jìn)行比對，序列通過Clustal X 軟件進(jìn)行排列，然后利用MEGA 6.0 軟件以NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstraps=1 000）（圖4）。從鏈格孢菌的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果可以看出菌株XZJ1 和XZJ2 與Alternaria sp.、Alternaria brassicae、Alternaria alternata、Alternaria tenuissima 等處于同一分枝。

3結(jié)論

通過形態(tài)學(xué)并結(jié)合rDNA ITS 序列分析，從干棗中分離出7種真菌，分別是鏈格孢菌（Alternaria spp.）、青霉（Penicillium spp.）、木霉菌（Trichoderma spp.） 鏈孢霉屬（Neurospora spp.）、毛殼屬（Chaetomium spp.）、棱孢殼屬（Thielavia spp.）、紙葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）、構(gòu)巢裸孢殼（Emericella nidulans）。其中，鏈格孢菌（Alternaria spp.）和青霉（Penicillium spp.）是紅棗干果貯藏期的優(yōu)勢病原菌，也是引起紅棗鮮果病害的主要病原菌。同時(shí)，通過構(gòu)建鏈格孢菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)本研究鑒定出的2個(gè)菌株XZJ1 和XZJ2 與Alternaria sp.、Alternaria brassicae、Alternaria alternata、Alternaria tenuissima 處于同一分枝，而這些鏈格孢菌菌株也在別的品種的紅棗中發(fā)現(xiàn)[1，5，7-8，11-13]。除已經(jīng)報(bào)道的真菌以外，本研究從紅棗中還鑒定出2種新的真菌，即鏈孢霉屬（Neurospora spp.）和紙葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）， 這在以

前的紅棗貯藏期真菌研究中未見報(bào)道。關(guān)于這2種真菌的作用還需進(jìn)一步研究。同時(shí)，根據(jù)已經(jīng)鑒定的引起紅棗病害的真菌種類，對它們的ITS 序列進(jìn)行比對、分析，從而設(shè)計(jì)特異性引物，對不同的病原菌種類進(jìn)行PCR鑒定，從而建立紅棗病原菌的快速檢測方法[14-15]。

參考文獻(xiàn)：

[1]甘瑾，唐文林，潘祿，等. 靈武長棗采后病原菌的分離及天然抗菌物質(zhì)的篩選[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，35（10）：81-86.

[2]劉炳仁. 冬棗高效栽培技術(shù)[M]. 北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2007.

[3]王緒芬. 提高冬棗產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)[J]. 北方園藝，2008（9）：91-92.

[4]刁小琴，張有林，關(guān)海寧. 冬棗采后病害及其防治技術(shù)[J]. 中國果樹，2006（1）：42-45.

[5]沙月霞，邢敏，唐文林，等. 紅棗貯藏期病原菌系的多樣性[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（2）：287-292.

[6]吳興梅，孫蕾，劉元鉛，等. 冬棗貯藏期主要病害的研究[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，2003，21（2）：19-22.

[7]任玉鋒，馬愛瑛，劉雅琴，等. 靈武長棗采后主要病原真菌的鑒定[J]. Food Researchs & sdevelopment，2012，3（9）：128-130.

[8]夏宏，夏青，王春生，等. 鮮棗貯藏期致腐病原菌種類研究[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，15（3）：117-119.

[9]Ippolito A，Nigro F. Impact of preharvest application of biological control agents on postharvest diseases of fresh fruit and vegetables [J]. Crop Protection，2000，19：715-723.

[10]Janisiewicz W J，Tworkoski T J，Sharer C. Characterizing the mechanism of biological control of postharvest diseases on fruit with a simple method to study competition for nutrients [J]. Phytopathology，2000，90（11）：1196-1200.

[11]劉萬臣，關(guān)文強(qiáng)，劉興華，等. 3種鮮棗貯藏期致病真菌的檢測及定性研究[J]. 食品科技，2007（8）：237-240.

[12]田蘊(yùn)慧，薛夢林，趙國柱，等. 冬棗貯藏期病害病原菌的鑒定[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2010，27（3）：422-426.

[13]李靜琴，陳亮，岳貴龍，等. 冬棗儲藏期致腐真菌分離鑒定及廣譜拮抗菌株的篩選[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，34（2）：62-66.

[14]Suanthie Y，Cousin M A，Woloshuk C P. Multiplex real-time PCR for detection and quantification of mycotoxigenic Aspergillus，Penicillium and Fusarium[J]. Journal of Stored Products Research，2009，45（2）：139-145.

[15] Pedersen LH，Skouboe P，Boysen M，et al. Detection of Penicillium species in complex food samples using the polymerase chain reaction[J]. International Journal of Food Microbiology，1997，35（2）：169-177.張瑤，蒙麗君，官菊芳，等. 基于生物條形碼信號放大的電化學(xué)方法檢測hIgG[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：308-311.