Jy—Ⅱ脫鈣液在骨髓活檢中的應用

楊紅

[摘要] 目的 探討Jy-Ⅱ脫鈣液在骨髓活檢中的應用。方法 收集200例骨髓活檢穿刺組織，選取其中150例采用Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣，同時選取50例采用5%的硝酸脫鈣液脫鈣做對照觀察，脫鈣后分別做HE染色、特殊染色（Gomori氏網(wǎng)狀纖維染色）和免疫組織化學染色（MaxVisionTM法CD38染色），觀察Jy-Ⅱ脫鈣液對骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)的保存及染色情況。 結(jié)果 經(jīng)Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣后骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)保持完整，完整率達98.67%。鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，組織結(jié)構(gòu)清晰率達100.00%，染色情況良好，脫鈣時間短，為150 min。脫鈣完全，效果好。經(jīng)5%的硝酸脫鈣液脫鈣后的骨髓活檢組織，結(jié)構(gòu)保持不完整，完整率達60.00%，鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)欠清晰，清晰率達52.00%，染色情況欠佳，脫鈣時間長，長達240 min，脫鈣不完全，效果欠佳（P<0.05）。 結(jié)論 Jy-Ⅱ脫鈣液效果明顯優(yōu)于5%的硝酸脫鈣液，骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)保持良好，操作簡便，脫鈣時間短，在脫鈣過程中無需更換脫鈣液，HE染色、特殊染色、免疫組化染色效果也較滿意，實用性強，不失為一種良好的脫鈣液，值得推廣

[關(guān)鍵詞] Jy-Ⅱ脫鈣液；骨髓活檢

[中圖分類號] R361 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）24-0046-03

組織脫鈣過度，破壞組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和細胞成分性質(zhì)，造成細胞核著色很淺或不著色，從而影響了組織的病理診斷[1]。本醫(yī)院病理科實驗室根據(jù)多年的工作經(jīng)驗，將Jy-Ⅱ氏混合脫鈣液應用在骨髓活檢工作中，獲得了良好的效果，現(xiàn)將方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1一般材料

1.1.1 標本 收集我院2010年1月～2013年11月骨髓活檢標本200例。

1.1.2主要儀器及設(shè)備 主要儀器：LeicaASP300型全自動脫水機，英國珊鈍石蠟包埋機，Leica HM2235輪轉(zhuǎn)石蠟切片機，常規(guī)病理制片和免疫組織化學染色所需的試劑及儀器；Gomori氏網(wǎng)狀纖維染色試劑盒，抗體采用鼠抗CD38和DAB試劑盒均為即用型（均購自福州邁新生物有限技術(shù)開發(fā)公司）。

1.1.3 脫鈣液的配制 Jy-Ⅱ脫鈣液的配制：甲醛 30 mL，鹽酸30 mL，甲酸20 mL，蒸餾水20 mL；將甲醛30 mL加入事先放有20 mL蒸餾水的燒杯中，再徐徐加入甲酸20 mL和鹽酸30 mL，加蓋搖勻即可[2]。5%硝酸脫鈣液：將5 mL濃硝酸加入95 mL的蒸餾水中，搖勻即可。

1.1.4脫鈣及脫鈣終點的判斷 以大頭針刺入組織無阻力感，為脫鈣完全。

1.2 方法

將取材好的骨髓穿刺標本（一般均為長0.5～1.0 cm，直徑0.05～1.0 cm），選取其中150例，將組織放入1 mL的塑料離心管內(nèi)，10%的中性福爾馬林液固定2 h，傾去固定液，加入適量的Jy-Ⅱ氏脫鈣液中2～2.5 h后取出，用蒸餾水稍洗。另一組50例采用5%硝酸脫鈣液脫鈣后蒸餾水沖洗，兩組標本同時常規(guī)脫水，包埋，連續(xù)切片3張，厚2 μm，分別行HE染色，特殊染色（Gomori氏網(wǎng)狀纖維染色，操作步驟按說明書），免疫組織化學染色（CD38染色，免疫組織化學染色采用MaXVisionTM方法，高壓抗原修復，DAB顯色，蘇木精復染胞核，中性樹膠封固，光鏡觀察。所有染色均用已知陽性片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用卡方檢驗計算器V1.61進行統(tǒng)計學檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1組織結(jié)構(gòu)及染色情況

經(jīng)Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣后骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)保持完整，完整率達98.67%。與對照組比較，具有顯著差異（χ2=57.27，P<0.05）。觀察組鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，組織結(jié)構(gòu)清晰率達100.00%，染色情況良好。經(jīng)5%的硝酸脫鈣液脫鈣后的骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)不完整，完整率僅達60.00%，鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)欠清晰，清晰率只達52.00%，染色情況欠佳。見表1。

2.2脫鈣時間、脫鈣效果比較

Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣時間短，為150 min，5%的硝酸脫鈣液脫鈣時間長，達240 min。Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣完全，脫鈣效果較好。5%的硝酸脫鈣液脫鈣不完全，效果欠佳。

2.3組織抗原的保持

Jy-Ⅱ脫鈣液對組織損傷小。組織抗原保持完好。5%硝酸脫鈣液對組織損傷大，抗原丟失。

2.4對染色效果的評估

2.4.1 HE結(jié)果 Jy-Ⅱ脫鈣液骨組織結(jié)構(gòu)保持良好， 細胞核呈藍色，細胞漿、紅細胞、骨小梁呈紅色，色澤亮麗，對比鮮明。見圖1。5%硝酸脫鈣液鏡下紅染，胞核和細胞漿對比不鮮明，模糊不清。見圖2。

2.4.2網(wǎng)狀纖維染色結(jié)果 Jy-Ⅱ脫鈣液網(wǎng)狀纖維呈藍黑色，細胞核呈藍色。見圖3。5%硝酸脫鈣液網(wǎng)狀纖維著色不理想。見圖4。

2.4.3免疫組化結(jié)果判斷 Jy-Ⅱ脫鈣液陽性部位定位于準確，定位于細胞膜，呈棕黃色，見圖5；5%硝酸脫鈣液陽性部位定位不準確，部分抗原丟失，見圖6。

3 討論

由于骨組織中含有大量的鈣鹽沉淀而成最堅硬的結(jié)締組織，直接切片相當麻煩[3]。骨和含有骨質(zhì)的腫瘤及鈣化組織和骨髓穿刺組織，均需經(jīng)脫鈣處理 ，鈣鹽被溶解 ，組織變軟后才能制作切片[4]。脫鈣，是骨髓活檢組織制片染色技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它是應用化學或物理化學的方法將組織成分中的鈣鹽與膠原纖維分離，棄去鈣鹽，保留完整的膠原纖維成分[5]，脫鈣方法和脫鈣液的選擇與骨組織切片的制作質(zhì)量有著密切的聯(lián)系[6]。尤其要進行免疫組織化學染色時如何達到既充分脫鈣又保護骨組織抗原不受破壞[7]。脫鈣的方法和脫鈣液的種類很多，尋求一種理想的脫鈣液，是良好脫鈣效果的關(guān)鍵。通常使用的脫鈣液有以硝酸、甲酸、鹽酸為主配置的脫鈣液還有以鉻酸和贅合劑配置的脫鈣液[8]，但大多數(shù)酸類脫鈣液對骨骼造成一定的損害[9]，對組織內(nèi)的酶、抗原、核酸均有一定的破壞性[10]。硝酸脫鈣時間過長，對超微結(jié)構(gòu)也有一定的損傷[11]，而且除酸時間較長。目前多數(shù)病理實驗室使用硝酸脫鈣。硝酸是一種強酸，脫鈣較迅速，但存在以下不足：脫鈣時間1～5 d不等，不易掌握，脫鈣過程中易產(chǎn)生氣CO2，CO2氣泡可引起組織變形，用硝酸做脫鈣液容易形成亞硫酸鈉，使脫鈣液呈黃色，產(chǎn)生顏色后，影響脫鈣速度，且組織黃染后，妨礙以后的染色反應，并影響對組織的觀察判斷，硝酸在組織脫鈣過程易造成組織酸化，因此硝酸脫鈣后的標本容易造成細胞核著色不良，染色效果不理想[12]。本實驗室采用Jy-Ⅱ混合脫鈣液，Jy-Ⅱ混合脫鈣液的效果明顯優(yōu)越于單純的5%硝酸脫鈣液，所制成的切片，骨組織結(jié)構(gòu)保持完整，胞核細胞漿著色清晰，對比鮮明。這種混合脫鈣液可促進脫鈣完全并加快脫鈣速度，同時有防止纖維組織過度膨脹，減少組織的破壞及對染色的影響作用。在脫鈣液中加入甲醛，具有穿透速度快，固定均勻，對組織收縮小的特點[13]，使骨髓活檢標本在脫鈣的同時得到了固定，甲醛不僅是優(yōu)良的固定液，還可適度緩沖酸對組織的腐蝕作用。加入鹽酸，對組織損害較小，對組織不膨脹，不至于導致脫鈣過程緩慢。加入甲酸，甲酸又稱蟻酸，甲酸性質(zhì)溫和，對組織破壞較輕，脫鈣時間范圍較寬，對組織損害程度較小，對染色效果影響不大。Jy-Ⅱ混合脫鈣液脫鈣速度較快，也就彌補了其他無機酸對組織的損害。利用鹽酸和甲酸起到了事半功倍的效果。同時克服了單一酸類脫鈣液對組織的損傷，使組織內(nèi)部的抗原及超微結(jié)構(gòu)也得到很好的保護。

本實驗室對150例骨髓活檢組織采用Jy-Ⅱ混合脫鈣液，經(jīng)反復實踐，取得了良好的效果，骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)保持完好，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，在脫鈣過程中無需更換脫鈣液，操作簡便，脫鈣時間短，對組織損傷小，組織抗原保存完好。HE染色、特殊染色和免疫組化染色效果評估也都比較滿意，實用性強，因此本研究認為Jy-Ⅱ混合脫鈣液不失為一種良好的脫鈣液，值得推廣。

[參考文獻]

[1] 陳世梁，盧志承，董玉英. 介紹一種改良脫鈣液在骨組織中應用[J]. 臨床與實驗病理學雜志，2009，25（5）：557.

[2] 席越，王戈平，黃嘯原，等. 骨組織病理解剖學技術(shù)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：133.

[3] 趙潔，李霞，魏志敏，等. 骨組織脫鈣方法的改良[J]. 齊魯醫(yī)學雜志，2006，21（4）：356.

[4] 連麗琴，夏凌志，鐘慧霞. 三種脫鈣液對骨組織脫鈣后切片染色效果分析[J]. 武警醫(yī)學雜志，2008，19（10）：937.

[5] 萬蕾，章錦才，軒冬英，等. 不同脫鈣方式觀察牙髓組織切片的效果比較[J]. 廣東醫(yī)學，2012，33（7）：917.

[6] 胥維勇，楊群. 脫鈣方法與脫鈣液的選擇及應用[J]. 中國組織化學與細胞化學組織雜志，2002，11（3）：263.

[7] 馬恒輝，章如松，周航波，等. 介紹一種改良的Neutral氏EDTA脫鈣液[J]. 診斷病理學雜雜志，2005，12（5）：391.

[8] 陳明城，張偉，賴續(xù)文，等. 改良脫鈣液在骨骼組織切片中的應用[J]. 中國誤診學雜志，2011，11（35）：8640.endprint

[摘要] 目的 探討Jy-Ⅱ脫鈣液在骨髓活檢中的應用。方法 收集200例骨髓活檢穿刺組織，選取其中150例采用Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣，同時選取50例采用5%的硝酸脫鈣液脫鈣做對照觀察，脫鈣后分別做HE染色、特殊染色（Gomori氏網(wǎng)狀纖維染色）和免疫組織化學染色（MaxVisionTM法CD38染色），觀察Jy-Ⅱ脫鈣液對骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)的保存及染色情況。 結(jié)果 經(jīng)Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣后骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)保持完整，完整率達98.67%。鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，組織結(jié)構(gòu)清晰率達100.00%，染色情況良好，脫鈣時間短，為150 min。脫鈣完全，效果好。經(jīng)5%的硝酸脫鈣液脫鈣后的骨髓活檢組織，結(jié)構(gòu)保持不完整，完整率達60.00%，鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)欠清晰，清晰率達52.00%，染色情況欠佳，脫鈣時間長，長達240 min，脫鈣不完全，效果欠佳（P<0.05）。 結(jié)論 Jy-Ⅱ脫鈣液效果明顯優(yōu)于5%的硝酸脫鈣液，骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)保持良好，操作簡便，脫鈣時間短，在脫鈣過程中無需更換脫鈣液，HE染色、特殊染色、免疫組化染色效果也較滿意，實用性強，不失為一種良好的脫鈣液，值得推廣

[關(guān)鍵詞] Jy-Ⅱ脫鈣液；骨髓活檢

[中圖分類號] R361 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）24-0046-03

組織脫鈣過度，破壞組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和細胞成分性質(zhì)，造成細胞核著色很淺或不著色，從而影響了組織的病理診斷[1]。本醫(yī)院病理科實驗室根據(jù)多年的工作經(jīng)驗，將Jy-Ⅱ氏混合脫鈣液應用在骨髓活檢工作中，獲得了良好的效果，現(xiàn)將方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1一般材料

1.1.1 標本 收集我院2010年1月～2013年11月骨髓活檢標本200例。

1.1.2主要儀器及設(shè)備 主要儀器：LeicaASP300型全自動脫水機，英國珊鈍石蠟包埋機，Leica HM2235輪轉(zhuǎn)石蠟切片機，常規(guī)病理制片和免疫組織化學染色所需的試劑及儀器；Gomori氏網(wǎng)狀纖維染色試劑盒，抗體采用鼠抗CD38和DAB試劑盒均為即用型（均購自福州邁新生物有限技術(shù)開發(fā)公司）。

1.1.3 脫鈣液的配制 Jy-Ⅱ脫鈣液的配制：甲醛 30 mL，鹽酸30 mL，甲酸20 mL，蒸餾水20 mL；將甲醛30 mL加入事先放有20 mL蒸餾水的燒杯中，再徐徐加入甲酸20 mL和鹽酸30 mL，加蓋搖勻即可[2]。5%硝酸脫鈣液：將5 mL濃硝酸加入95 mL的蒸餾水中，搖勻即可。

1.1.4脫鈣及脫鈣終點的判斷 以大頭針刺入組織無阻力感，為脫鈣完全。

1.2 方法

將取材好的骨髓穿刺標本（一般均為長0.5～1.0 cm，直徑0.05～1.0 cm），選取其中150例，將組織放入1 mL的塑料離心管內(nèi)，10%的中性福爾馬林液固定2 h，傾去固定液，加入適量的Jy-Ⅱ氏脫鈣液中2～2.5 h后取出，用蒸餾水稍洗。另一組50例采用5%硝酸脫鈣液脫鈣后蒸餾水沖洗，兩組標本同時常規(guī)脫水，包埋，連續(xù)切片3張，厚2 μm，分別行HE染色，特殊染色（Gomori氏網(wǎng)狀纖維染色，操作步驟按說明書），免疫組織化學染色（CD38染色，免疫組織化學染色采用MaXVisionTM方法，高壓抗原修復，DAB顯色，蘇木精復染胞核，中性樹膠封固，光鏡觀察。所有染色均用已知陽性片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用卡方檢驗計算器V1.61進行統(tǒng)計學檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1組織結(jié)構(gòu)及染色情況

經(jīng)Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣后骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)保持完整，完整率達98.67%。與對照組比較，具有顯著差異（χ2=57.27，P<0.05）。觀察組鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，組織結(jié)構(gòu)清晰率達100.00%，染色情況良好。經(jīng)5%的硝酸脫鈣液脫鈣后的骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)不完整，完整率僅達60.00%，鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)欠清晰，清晰率只達52.00%，染色情況欠佳。見表1。

2.2脫鈣時間、脫鈣效果比較

Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣時間短，為150 min，5%的硝酸脫鈣液脫鈣時間長，達240 min。Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣完全，脫鈣效果較好。5%的硝酸脫鈣液脫鈣不完全，效果欠佳。

2.3組織抗原的保持

Jy-Ⅱ脫鈣液對組織損傷小。組織抗原保持完好。5%硝酸脫鈣液對組織損傷大，抗原丟失。

2.4對染色效果的評估

2.4.1 HE結(jié)果 Jy-Ⅱ脫鈣液骨組織結(jié)構(gòu)保持良好， 細胞核呈藍色，細胞漿、紅細胞、骨小梁呈紅色，色澤亮麗，對比鮮明。見圖1。5%硝酸脫鈣液鏡下紅染，胞核和細胞漿對比不鮮明，模糊不清。見圖2。

2.4.2網(wǎng)狀纖維染色結(jié)果 Jy-Ⅱ脫鈣液網(wǎng)狀纖維呈藍黑色，細胞核呈藍色。見圖3。5%硝酸脫鈣液網(wǎng)狀纖維著色不理想。見圖4。

2.4.3免疫組化結(jié)果判斷 Jy-Ⅱ脫鈣液陽性部位定位于準確，定位于細胞膜，呈棕黃色，見圖5；5%硝酸脫鈣液陽性部位定位不準確，部分抗原丟失，見圖6。

3 討論

由于骨組織中含有大量的鈣鹽沉淀而成最堅硬的結(jié)締組織，直接切片相當麻煩[3]。骨和含有骨質(zhì)的腫瘤及鈣化組織和骨髓穿刺組織，均需經(jīng)脫鈣處理 ，鈣鹽被溶解 ，組織變軟后才能制作切片[4]。脫鈣，是骨髓活檢組織制片染色技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它是應用化學或物理化學的方法將組織成分中的鈣鹽與膠原纖維分離，棄去鈣鹽，保留完整的膠原纖維成分[5]，脫鈣方法和脫鈣液的選擇與骨組織切片的制作質(zhì)量有著密切的聯(lián)系[6]。尤其要進行免疫組織化學染色時如何達到既充分脫鈣又保護骨組織抗原不受破壞[7]。脫鈣的方法和脫鈣液的種類很多，尋求一種理想的脫鈣液，是良好脫鈣效果的關(guān)鍵。通常使用的脫鈣液有以硝酸、甲酸、鹽酸為主配置的脫鈣液還有以鉻酸和贅合劑配置的脫鈣液[8]，但大多數(shù)酸類脫鈣液對骨骼造成一定的損害[9]，對組織內(nèi)的酶、抗原、核酸均有一定的破壞性[10]。硝酸脫鈣時間過長，對超微結(jié)構(gòu)也有一定的損傷[11]，而且除酸時間較長。目前多數(shù)病理實驗室使用硝酸脫鈣。硝酸是一種強酸，脫鈣較迅速，但存在以下不足：脫鈣時間1～5 d不等，不易掌握，脫鈣過程中易產(chǎn)生氣CO2，CO2氣泡可引起組織變形，用硝酸做脫鈣液容易形成亞硫酸鈉，使脫鈣液呈黃色，產(chǎn)生顏色后，影響脫鈣速度，且組織黃染后，妨礙以后的染色反應，并影響對組織的觀察判斷，硝酸在組織脫鈣過程易造成組織酸化，因此硝酸脫鈣后的標本容易造成細胞核著色不良，染色效果不理想[12]。本實驗室采用Jy-Ⅱ混合脫鈣液，Jy-Ⅱ混合脫鈣液的效果明顯優(yōu)越于單純的5%硝酸脫鈣液，所制成的切片，骨組織結(jié)構(gòu)保持完整，胞核細胞漿著色清晰，對比鮮明。這種混合脫鈣液可促進脫鈣完全并加快脫鈣速度，同時有防止纖維組織過度膨脹，減少組織的破壞及對染色的影響作用。在脫鈣液中加入甲醛，具有穿透速度快，固定均勻，對組織收縮小的特點[13]，使骨髓活檢標本在脫鈣的同時得到了固定，甲醛不僅是優(yōu)良的固定液，還可適度緩沖酸對組織的腐蝕作用。加入鹽酸，對組織損害較小，對組織不膨脹，不至于導致脫鈣過程緩慢。加入甲酸，甲酸又稱蟻酸，甲酸性質(zhì)溫和，對組織破壞較輕，脫鈣時間范圍較寬，對組織損害程度較小，對染色效果影響不大。Jy-Ⅱ混合脫鈣液脫鈣速度較快，也就彌補了其他無機酸對組織的損害。利用鹽酸和甲酸起到了事半功倍的效果。同時克服了單一酸類脫鈣液對組織的損傷，使組織內(nèi)部的抗原及超微結(jié)構(gòu)也得到很好的保護。

本實驗室對150例骨髓活檢組織采用Jy-Ⅱ混合脫鈣液，經(jīng)反復實踐，取得了良好的效果，骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)保持完好，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，在脫鈣過程中無需更換脫鈣液，操作簡便，脫鈣時間短，對組織損傷小，組織抗原保存完好。HE染色、特殊染色和免疫組化染色效果評估也都比較滿意，實用性強，因此本研究認為Jy-Ⅱ混合脫鈣液不失為一種良好的脫鈣液，值得推廣。

[參考文獻]

[1] 陳世梁，盧志承，董玉英. 介紹一種改良脫鈣液在骨組織中應用[J]. 臨床與實驗病理學雜志，2009，25（5）：557.

[2] 席越，王戈平，黃嘯原，等. 骨組織病理解剖學技術(shù)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：133.

[3] 趙潔，李霞，魏志敏，等. 骨組織脫鈣方法的改良[J]. 齊魯醫(yī)學雜志，2006，21（4）：356.

[4] 連麗琴，夏凌志，鐘慧霞. 三種脫鈣液對骨組織脫鈣后切片染色效果分析[J]. 武警醫(yī)學雜志，2008，19（10）：937.

[5] 萬蕾，章錦才，軒冬英，等. 不同脫鈣方式觀察牙髓組織切片的效果比較[J]. 廣東醫(yī)學，2012，33（7）：917.

[6] 胥維勇，楊群. 脫鈣方法與脫鈣液的選擇及應用[J]. 中國組織化學與細胞化學組織雜志，2002，11（3）：263.

[7] 馬恒輝，章如松，周航波，等. 介紹一種改良的Neutral氏EDTA脫鈣液[J]. 診斷病理學雜雜志，2005，12（5）：391.

[8] 陳明城，張偉，賴續(xù)文，等. 改良脫鈣液在骨骼組織切片中的應用[J]. 中國誤診學雜志，2011，11（35）：8640.endprint

[摘要] 目的 探討Jy-Ⅱ脫鈣液在骨髓活檢中的應用。方法 收集200例骨髓活檢穿刺組織，選取其中150例采用Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣，同時選取50例采用5%的硝酸脫鈣液脫鈣做對照觀察，脫鈣后分別做HE染色、特殊染色（Gomori氏網(wǎng)狀纖維染色）和免疫組織化學染色（MaxVisionTM法CD38染色），觀察Jy-Ⅱ脫鈣液對骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)的保存及染色情況。 結(jié)果 經(jīng)Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣后骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)保持完整，完整率達98.67%。鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，組織結(jié)構(gòu)清晰率達100.00%，染色情況良好，脫鈣時間短，為150 min。脫鈣完全，效果好。經(jīng)5%的硝酸脫鈣液脫鈣后的骨髓活檢組織，結(jié)構(gòu)保持不完整，完整率達60.00%，鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)欠清晰，清晰率達52.00%，染色情況欠佳，脫鈣時間長，長達240 min，脫鈣不完全，效果欠佳（P<0.05）。 結(jié)論 Jy-Ⅱ脫鈣液效果明顯優(yōu)于5%的硝酸脫鈣液，骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)保持良好，操作簡便，脫鈣時間短，在脫鈣過程中無需更換脫鈣液，HE染色、特殊染色、免疫組化染色效果也較滿意，實用性強，不失為一種良好的脫鈣液，值得推廣

[關(guān)鍵詞] Jy-Ⅱ脫鈣液；骨髓活檢

[中圖分類號] R361 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）24-0046-03

組織脫鈣過度，破壞組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和細胞成分性質(zhì)，造成細胞核著色很淺或不著色，從而影響了組織的病理診斷[1]。本醫(yī)院病理科實驗室根據(jù)多年的工作經(jīng)驗，將Jy-Ⅱ氏混合脫鈣液應用在骨髓活檢工作中，獲得了良好的效果，現(xiàn)將方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1一般材料

1.1.1 標本 收集我院2010年1月～2013年11月骨髓活檢標本200例。

1.1.2主要儀器及設(shè)備 主要儀器：LeicaASP300型全自動脫水機，英國珊鈍石蠟包埋機，Leica HM2235輪轉(zhuǎn)石蠟切片機，常規(guī)病理制片和免疫組織化學染色所需的試劑及儀器；Gomori氏網(wǎng)狀纖維染色試劑盒，抗體采用鼠抗CD38和DAB試劑盒均為即用型（均購自福州邁新生物有限技術(shù)開發(fā)公司）。

1.1.3 脫鈣液的配制 Jy-Ⅱ脫鈣液的配制：甲醛 30 mL，鹽酸30 mL，甲酸20 mL，蒸餾水20 mL；將甲醛30 mL加入事先放有20 mL蒸餾水的燒杯中，再徐徐加入甲酸20 mL和鹽酸30 mL，加蓋搖勻即可[2]。5%硝酸脫鈣液：將5 mL濃硝酸加入95 mL的蒸餾水中，搖勻即可。

1.1.4脫鈣及脫鈣終點的判斷 以大頭針刺入組織無阻力感，為脫鈣完全。

1.2 方法

將取材好的骨髓穿刺標本（一般均為長0.5～1.0 cm，直徑0.05～1.0 cm），選取其中150例，將組織放入1 mL的塑料離心管內(nèi)，10%的中性福爾馬林液固定2 h，傾去固定液，加入適量的Jy-Ⅱ氏脫鈣液中2～2.5 h后取出，用蒸餾水稍洗。另一組50例采用5%硝酸脫鈣液脫鈣后蒸餾水沖洗，兩組標本同時常規(guī)脫水，包埋，連續(xù)切片3張，厚2 μm，分別行HE染色，特殊染色（Gomori氏網(wǎng)狀纖維染色，操作步驟按說明書），免疫組織化學染色（CD38染色，免疫組織化學染色采用MaXVisionTM方法，高壓抗原修復，DAB顯色，蘇木精復染胞核，中性樹膠封固，光鏡觀察。所有染色均用已知陽性片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用卡方檢驗計算器V1.61進行統(tǒng)計學檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1組織結(jié)構(gòu)及染色情況

經(jīng)Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣后骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)保持完整，完整率達98.67%。與對照組比較，具有顯著差異（χ2=57.27，P<0.05）。觀察組鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，組織結(jié)構(gòu)清晰率達100.00%，染色情況良好。經(jīng)5%的硝酸脫鈣液脫鈣后的骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)不完整，完整率僅達60.00%，鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)欠清晰，清晰率只達52.00%，染色情況欠佳。見表1。

2.2脫鈣時間、脫鈣效果比較

Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣時間短，為150 min，5%的硝酸脫鈣液脫鈣時間長，達240 min。Jy-Ⅱ脫鈣液脫鈣完全，脫鈣效果較好。5%的硝酸脫鈣液脫鈣不完全，效果欠佳。

2.3組織抗原的保持

Jy-Ⅱ脫鈣液對組織損傷小。組織抗原保持完好。5%硝酸脫鈣液對組織損傷大，抗原丟失。

2.4對染色效果的評估

2.4.1 HE結(jié)果 Jy-Ⅱ脫鈣液骨組織結(jié)構(gòu)保持良好， 細胞核呈藍色，細胞漿、紅細胞、骨小梁呈紅色，色澤亮麗，對比鮮明。見圖1。5%硝酸脫鈣液鏡下紅染，胞核和細胞漿對比不鮮明，模糊不清。見圖2。

2.4.2網(wǎng)狀纖維染色結(jié)果 Jy-Ⅱ脫鈣液網(wǎng)狀纖維呈藍黑色，細胞核呈藍色。見圖3。5%硝酸脫鈣液網(wǎng)狀纖維著色不理想。見圖4。

2.4.3免疫組化結(jié)果判斷 Jy-Ⅱ脫鈣液陽性部位定位于準確，定位于細胞膜，呈棕黃色，見圖5；5%硝酸脫鈣液陽性部位定位不準確，部分抗原丟失，見圖6。

3 討論

由于骨組織中含有大量的鈣鹽沉淀而成最堅硬的結(jié)締組織，直接切片相當麻煩[3]。骨和含有骨質(zhì)的腫瘤及鈣化組織和骨髓穿刺組織，均需經(jīng)脫鈣處理 ，鈣鹽被溶解 ，組織變軟后才能制作切片[4]。脫鈣，是骨髓活檢組織制片染色技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它是應用化學或物理化學的方法將組織成分中的鈣鹽與膠原纖維分離，棄去鈣鹽，保留完整的膠原纖維成分[5]，脫鈣方法和脫鈣液的選擇與骨組織切片的制作質(zhì)量有著密切的聯(lián)系[6]。尤其要進行免疫組織化學染色時如何達到既充分脫鈣又保護骨組織抗原不受破壞[7]。脫鈣的方法和脫鈣液的種類很多，尋求一種理想的脫鈣液，是良好脫鈣效果的關(guān)鍵。通常使用的脫鈣液有以硝酸、甲酸、鹽酸為主配置的脫鈣液還有以鉻酸和贅合劑配置的脫鈣液[8]，但大多數(shù)酸類脫鈣液對骨骼造成一定的損害[9]，對組織內(nèi)的酶、抗原、核酸均有一定的破壞性[10]。硝酸脫鈣時間過長，對超微結(jié)構(gòu)也有一定的損傷[11]，而且除酸時間較長。目前多數(shù)病理實驗室使用硝酸脫鈣。硝酸是一種強酸，脫鈣較迅速，但存在以下不足：脫鈣時間1～5 d不等，不易掌握，脫鈣過程中易產(chǎn)生氣CO2，CO2氣泡可引起組織變形，用硝酸做脫鈣液容易形成亞硫酸鈉，使脫鈣液呈黃色，產(chǎn)生顏色后，影響脫鈣速度，且組織黃染后，妨礙以后的染色反應，并影響對組織的觀察判斷，硝酸在組織脫鈣過程易造成組織酸化，因此硝酸脫鈣后的標本容易造成細胞核著色不良，染色效果不理想[12]。本實驗室采用Jy-Ⅱ混合脫鈣液，Jy-Ⅱ混合脫鈣液的效果明顯優(yōu)越于單純的5%硝酸脫鈣液，所制成的切片，骨組織結(jié)構(gòu)保持完整，胞核細胞漿著色清晰，對比鮮明。這種混合脫鈣液可促進脫鈣完全并加快脫鈣速度，同時有防止纖維組織過度膨脹，減少組織的破壞及對染色的影響作用。在脫鈣液中加入甲醛，具有穿透速度快，固定均勻，對組織收縮小的特點[13]，使骨髓活檢標本在脫鈣的同時得到了固定，甲醛不僅是優(yōu)良的固定液，還可適度緩沖酸對組織的腐蝕作用。加入鹽酸，對組織損害較小，對組織不膨脹，不至于導致脫鈣過程緩慢。加入甲酸，甲酸又稱蟻酸，甲酸性質(zhì)溫和，對組織破壞較輕，脫鈣時間范圍較寬，對組織損害程度較小，對染色效果影響不大。Jy-Ⅱ混合脫鈣液脫鈣速度較快，也就彌補了其他無機酸對組織的損害。利用鹽酸和甲酸起到了事半功倍的效果。同時克服了單一酸類脫鈣液對組織的損傷，使組織內(nèi)部的抗原及超微結(jié)構(gòu)也得到很好的保護。

本實驗室對150例骨髓活檢組織采用Jy-Ⅱ混合脫鈣液，經(jīng)反復實踐，取得了良好的效果，骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)保持完好，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，在脫鈣過程中無需更換脫鈣液，操作簡便，脫鈣時間短，對組織損傷小，組織抗原保存完好。HE染色、特殊染色和免疫組化染色效果評估也都比較滿意，實用性強，因此本研究認為Jy-Ⅱ混合脫鈣液不失為一種良好的脫鈣液，值得推廣。

[參考文獻]

[1] 陳世梁，盧志承，董玉英. 介紹一種改良脫鈣液在骨組織中應用[J]. 臨床與實驗病理學雜志，2009，25（5）：557.

[2] 席越，王戈平，黃嘯原，等. 骨組織病理解剖學技術(shù)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：133.

[3] 趙潔，李霞，魏志敏，等. 骨組織脫鈣方法的改良[J]. 齊魯醫(yī)學雜志，2006，21（4）：356.

[4] 連麗琴，夏凌志，鐘慧霞. 三種脫鈣液對骨組織脫鈣后切片染色效果分析[J]. 武警醫(yī)學雜志，2008，19（10）：937.

[5] 萬蕾，章錦才，軒冬英，等. 不同脫鈣方式觀察牙髓組織切片的效果比較[J]. 廣東醫(yī)學，2012，33（7）：917.

[6] 胥維勇，楊群. 脫鈣方法與脫鈣液的選擇及應用[J]. 中國組織化學與細胞化學組織雜志，2002，11（3）：263.

[7] 馬恒輝，章如松，周航波，等. 介紹一種改良的Neutral氏EDTA脫鈣液[J]. 診斷病理學雜雜志，2005，12（5）：391.

[8] 陳明城，張偉，賴續(xù)文，等. 改良脫鈣液在骨骼組織切片中的應用[J]. 中國誤診學雜志，2011，11（35）：8640.endprint