甲胎蛋白與肝癌免疫的研究進(jìn)展

趙 倩, 王小平, 胥 冰, 藺煥萍, 張克佩

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 分子病理學(xué)研究室， 咸陽(yáng) 712046)

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甲胎蛋白與肝癌免疫的研究進(jìn)展

趙 倩1, 王小平2, 胥 冰1, 藺煥萍1, 張克佩1

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 分子病理學(xué)研究室， 咸陽(yáng) 712046)

摘要肝癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，目前沒(méi)有較好的治療措施。甲胎蛋白在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，除了用于肝癌診斷外，其作為腫瘤相關(guān)抗原已成為肝癌免疫治療的靶點(diǎn)。雖然甲胎蛋白免疫原性較弱，并通過(guò)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞功能促進(jìn)肝癌細(xì)胞免疫逃逸，但其在肝癌免疫治療中的作用也日益受到重視，通過(guò)體外修飾增強(qiáng)其免疫原性促進(jìn)免疫應(yīng)答，從而提高殺傷肝癌細(xì)胞免疫效應(yīng)。甲胎蛋白在肝癌發(fā)生、發(fā)展及免疫中的作用為研究其在肝癌中的免疫治療奠定了良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞甲胎蛋白；肝癌免疫；多肽疫苗；熱休克蛋白

Advanced progress in alpha-fetoprotein and hepatocarcinoma immunity

ZHAO Qian1, WANG Xiao-ping2, XU Bing1, LIN Huan-ping1, ZHANG Ke-pei1

(Lab of Molecular Pathology, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China)

Abstract Hepatocarcinoma is one of the most prevalent gastroenterological cancers in the world with less effective therapy. Excepting for its diagnosis in liver cancer, AFP has become the target for liver cancer immunotherapy. Although AFP′s immunogenicity is weak and can promote the immune escapes by inhibiting the function of dendritic cells, natural killer cells and T lymphocytes, AFP has drawn more attention in liver cancer immunotherapy. By in vitro modification, the immunogenicity and immune effect of AFP could be enhanced. The important role of AFP in development, progression and immunity of liver cancer can lay a better foundation in hepatocarcinoma immunotherapy.

Keywordsalpha fetoprotein; hepatocarcinoma immunity; peptide vaccine; heat shock protein

肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellilar carcinoma, HCC)是世界上最常見(jiàn)的腫瘤之一，每年新發(fā)病的患者高達(dá)60萬(wàn)例，在我國(guó)已成為惡性腫瘤繼肺癌之后的第2位殺手，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。肝癌被稱(chēng)為“癌中之王”，主要是因?yàn)殡[、長(zhǎng)、晚、快、差五大特征：起病隱匿，潛伏期長(zhǎng)，患者早期通常沒(méi)有特殊癥狀，而一旦發(fā)病，往往已是中、晚期，病情發(fā)展迅速，預(yù)后極差，死亡率高。目前肝癌的治療主要是以手術(shù)切除、肝移植、局部消融、化學(xué)治療栓塞及其他局部區(qū)域治療、分子靶向治療等為主，但這些方法的療效并不理想，3年存活率仍然較低，發(fā)病率和死亡率幾乎相同[1]。肝癌免疫治療的方法可以刺激人體免疫系統(tǒng)特異性識(shí)別并殺傷肝癌細(xì)胞而不損傷機(jī)體自身成分，并且可以產(chǎn)生記憶性淋巴細(xì)胞，防止復(fù)發(fā)，故肝癌免疫治療的方法在近幾年得到了人們的關(guān)注。本文就近年來(lái)甲胎蛋白與肝癌免疫的研究進(jìn)展進(jìn)行如下綜述。

1 甲胎蛋白在肝癌表達(dá)中的意義

1.1 甲胎蛋白的發(fā)現(xiàn)歷史

甲胎蛋白(AFP)是一種糖蛋白，主要是胚胎內(nèi)胚層衍生相關(guān)組織細(xì)胞的同源蛋白產(chǎn)物，廣泛分布于呼吸、消化、生殖、泌尿等系統(tǒng)，除肝癌外，胃、胰腺及生殖系統(tǒng)等惡性腫瘤也常伴有AFP升高，并且AFP是幼稚期的產(chǎn)物，血清AFP陰性或弱陽(yáng)性患者預(yù)后較好符合高分化瘤的特點(diǎn)[2]。甲胎蛋白在胎兒血清中含量豐富，從胎兒出生3個(gè)月開(kāi)始，含量逐漸下降，到出生后第2年達(dá)到成人體內(nèi)甲胎蛋白水平，約1～3 ng/mL。成人血中甲胎蛋白維持較低含量，主要是由于成人肝細(xì)胞合成AFP的能力喪失。受到相應(yīng)刺激時(shí)，肝臟可重新獲得合成AFP的能力，這也是通常肝癌患者體內(nèi)甲胎蛋白含量升高的原因[3]。

1.2 甲胎蛋白在肝癌診斷中的積極作用

檢測(cè)血清中甲胎蛋白含量并結(jié)合一些影像學(xué)的檢查，肝癌的臨床診斷已逐漸變得簡(jiǎn)單。但是臨床上存在三分之一肝癌患者的甲胎蛋白水平并未明顯升高，也就是假陰性的情況，這影響了患者的臨床診斷，延誤治療。所以，在甲胎蛋白陰性或弱陽(yáng)性的情況下，及時(shí)確診肝癌已變得非常急迫且重要。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)一些傳統(tǒng)的肝癌標(biāo)志物與甲胎蛋白聯(lián)合檢測(cè)更能提高診斷率。如：能與扁豆凝集素(LCA)結(jié)合的甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)，運(yùn)用一種高敏感性的方法檢測(cè)，在AFP陰性的肝癌患者中，敏感度達(dá)41.5%，特異度85.1%，比常規(guī)方法大有提高[4]。在與甲胎蛋白聯(lián)合檢測(cè)時(shí)， AFP-L3診斷肝癌的特異度和靈敏度又分別達(dá)到90%和70%。大大提高了肝癌的早期診斷率[5]；異常凝血酶原(DCP)[6]、α-L- 巖藻糖苷酶(AFU)[7]等均在甲胎蛋白陰性時(shí)對(duì)診斷肝癌有一定意義。隨著研究工作的進(jìn)展，肝癌新標(biāo)志物的出現(xiàn)對(duì)肝癌診斷也具有重要意義，如：甲胎蛋白異質(zhì)體和高爾基體蛋白73聯(lián)合，肝癌診斷的敏感度為94.0%，特異度為93.1%，而準(zhǔn)確度為93.3%[ 8]，使肝癌早期診斷率又有所提高。

1.3 甲胎蛋白除了作為肝癌相關(guān)性抗原，用于肝癌診斷外，還有多種生物學(xué)功能。如：屬于類(lèi)白蛋白一族的甲胎蛋白也有著相似的運(yùn)輸功能，可運(yùn)輸金屬離子、藥物、膽紅素和類(lèi)固醇等[9]。

2 甲胎蛋白與肝癌免疫逃逸機(jī)制

肝癌細(xì)胞能經(jīng)自身表面抗原修飾作用和病灶周?chē)h(huán)境的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)機(jī)體免疫識(shí)別和攻擊逃逸，從而發(fā)生免疫逃逸。外源性甲胎蛋白不僅可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞系增殖，促進(jìn)腫瘤血管形成，同時(shí)還增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的抗凋亡作用[10]。所以，甲胎蛋白在肝癌免疫逃逸中起主要作用。細(xì)胞免疫是機(jī)體抗癌的主要免疫機(jī)制，而樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞是參與機(jī)體免疫監(jiān)視最重要的細(xì)胞，現(xiàn)主要就甲胎蛋白對(duì)這三種最重要細(xì)胞的作用來(lái)闡述甲胎蛋白的抗腫瘤免疫效應(yīng)。

2.1 甲胎蛋白抑制樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的成熟，誘導(dǎo)其凋亡

DC細(xì)胞具有高效攝取、加工、提呈抗原的能力，是唯一能直接激活初始T淋巴細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞(APC)。甲胎蛋白可以抑制其成熟，并誘導(dǎo)其凋亡從而使肝癌細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視功能。有研究將外周血的單核細(xì)胞分別培養(yǎng)于臍帶血液正常AFP(nAFP)和腫瘤源性AFP(tAFP)中，并分析DC細(xì)胞的表型和功能。結(jié)果表明，tAFP能顯著抑制DCs的分化，受tAFP限制的DC細(xì)胞維持單核細(xì)胞樣形態(tài)，并未成熟[11]。并且經(jīng)AFP處理后的DCs凋亡指數(shù)及caspase-3表達(dá)量顯著增加，說(shuō)明了甲胎蛋白誘導(dǎo)DC細(xì)胞凋亡具有特異性[12]。DCs凋亡過(guò)程，除了caspase-3表達(dá)增加外，p38絲裂原活化蛋白激酶(MARK)的表達(dá)也是增加的。池詔丞等[13]在用AFP誘導(dǎo)培養(yǎng)人外周血來(lái)源的DCs時(shí)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AFP誘導(dǎo)caspase-3和p38-MARK的表達(dá)，從而抑制DC細(xì)胞成熟，致肝癌細(xì)胞發(fā)生逃逸。

2.2 甲胎蛋白間接抑制自然殺傷細(xì)胞(NK)的功能

NK細(xì)胞是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是機(jī)體抗感染和腫瘤的第一道防線，其表面表達(dá)多種受體，包括活化性受體(NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46)和抑制性受體(KIR2DL3/CD158b)。在殺傷腫瘤時(shí)會(huì)使活化性受體表達(dá)下降，抑制性受體表達(dá)增強(qiáng)，導(dǎo)致其抗腫瘤效應(yīng)減弱[14]。所以，增強(qiáng)活化性受體的表達(dá)，減弱抑制性受體的表達(dá)成為殺傷腫瘤的有效方法。將IL-12注射于肝癌模型小鼠瘤內(nèi)，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞表面的活化性受體表達(dá)增強(qiáng)，抑制性受體減弱，并且，IL-12、IFN-r生成增加，達(dá)到抑制腫瘤的作用[15]。NK細(xì)胞的功能會(huì)受甲胎蛋白的影響，甲胎蛋白不直接損傷NK細(xì)胞功能，而是通過(guò)抑制DC細(xì)胞成熟，使DC細(xì)胞分泌白介素-12(IL-12)的量減少，從而間接抑制NK細(xì)胞的功能[16]。IL-12主要是上調(diào)NK細(xì)胞表面NKG-2D的表達(dá)而改善NK細(xì)胞的毒性作用。NKG2D與其配體結(jié)合后激活NK細(xì)胞，發(fā)揮免疫監(jiān)視作用[17]。

2.3 甲胎蛋白促進(jìn)T淋巴細(xì)胞比例改變，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸

經(jīng)DC活化后的AFP特異性T淋巴細(xì)胞具有顯著的體內(nèi)外抗腫瘤免疫活性，主要機(jī)制是特異性的T淋巴細(xì)胞上調(diào)IL-2、IFN-r、TNF-a、顆粒酶和穿孔素，并且下調(diào)有免疫抑制作用的IL-10的含量[18]，CD4+T細(xì)胞作為輔助性T淋巴細(xì)胞可輔助CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用。AFP特異性CD4+、CD8+T細(xì)胞殺傷腫瘤主要是通過(guò)顆粒酶/穿孔素途徑，而對(duì)Fas/Fasl途徑無(wú)影響[19]。雖然甲胎蛋白在T淋巴細(xì)胞抗腫瘤免疫中起一定作用，但是由于其免疫原性較弱，并不能很好地刺激免疫系統(tǒng)反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤作用。而其另一方面的作用卻較為顯著，那就是促進(jìn)CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例改變而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸[20]。有研究人員對(duì)臨床原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌患者、慢性乙型肝炎患者和健康患者分別測(cè)CD4+的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg細(xì)胞)的含量。結(jié)果顯示，肝癌患者外周血中Treg細(xì)胞含量較高，Treg細(xì)胞具有抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答的作用，并且，Treg細(xì)胞的聚集會(huì)影響CD8+T淋巴細(xì)胞的功能，從而使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視作用，繼續(xù)在機(jī)體內(nèi)生長(zhǎng)[21]。

3 甲胎蛋白在肝癌免疫中的積極作用

3.1 甲胎蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖

甲胎蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)也有重要作用，其機(jī)制可能是通過(guò)受體介導(dǎo)-信息傳遞-基因表達(dá)的方式實(shí)現(xiàn)的。因?yàn)橛醒芯勘砻?，甲胎蛋白多存在于?xì)胞表面或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而胞質(zhì)中的甲胎蛋白是由受體介導(dǎo)內(nèi)吞入細(xì)胞[22]。并且在甲胎蛋白陽(yáng)性的組織中，甲胎蛋白受體(AFPR)也呈現(xiàn)陽(yáng)性。而在正常組織或甲胎蛋白陰性的組織里，AFPR也呈現(xiàn)陰性，說(shuō)明表達(dá)甲胎蛋白受體的細(xì)胞對(duì)甲胎蛋白更加敏感[23]。甲胎蛋白的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用是通過(guò)CAMP-PKA通路和誘導(dǎo)Ca2+向細(xì)胞內(nèi)流實(shí)現(xiàn)的[24]，甲胎蛋白導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)CAMP增多，蛋白酶A活性增強(qiáng)，促使DNA合成，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。

3.2 甲胎蛋白促進(jìn)免疫應(yīng)答

免疫的過(guò)程需要增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞攝取、加工、提呈抗原的能力，使之激活T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)免疫應(yīng)答[25]。甲胎蛋白雖然促進(jìn)肝癌增殖，但其作為肝癌的相關(guān)性抗原，自然會(huì)成為肝癌免疫治療的新靶點(diǎn)。只是在胎兒胚胎期產(chǎn)生的AFP，機(jī)體已將其作為自身抗原，產(chǎn)生一定的免疫耐受，使其促進(jìn)免疫應(yīng)答功能降低。如何克服其免疫耐受狀態(tài)是抗腫瘤免疫的重點(diǎn)。甲胎蛋白氨基酸中存在一些位點(diǎn)可被主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類(lèi)或Ⅱ類(lèi)分子識(shí)別，遞呈給CD8+或CD4+T淋巴細(xì)胞，從而活化T細(xì)胞[26]，并且靶向性刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)分泌高水平的TNF -a和IFN- r，激發(fā)特異性抗肝癌免疫應(yīng)答[27， 28]。其中，氨基酸組成的免疫顯性肽段hAFP(137-145) 可以成功地通過(guò)修飾DC誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞成為特異性CTL，且其效果較完整的hAFP蛋白更佳[29]。這樣就可以克服甲胎蛋白的免疫耐受現(xiàn)狀，以甲胎蛋白為靶點(diǎn)，殺傷肝癌細(xì)胞。

3.3 甲胎蛋白在肝癌免疫治療中的進(jìn)展

腫瘤免疫治療具有高效性和低毒性，其目的是啟動(dòng)或重啟獨(dú)立的癌癥免疫反應(yīng)，并使之持續(xù)，同時(shí)避免損傷自體組織細(xì)胞。目前已有臨床研究證實(shí)免疫治療可改善肝細(xì)胞肝癌患者的預(yù)后[30]。胚胎期產(chǎn)生的甲胎蛋白使機(jī)體對(duì)其保持免疫耐受狀態(tài)，不能很好地刺激免疫系統(tǒng)，引起免疫反應(yīng)。Daley等[31]將DC細(xì)胞與AFP以及IL-12共孵育，發(fā)現(xiàn)自身T淋巴細(xì)胞被激活，產(chǎn)生大量IL-12和TNF，可特異性殺傷肝癌細(xì)胞，說(shuō)明甲胎蛋白可與DC細(xì)胞制備DC疫苗，發(fā)揮一定的免疫效應(yīng)。將其與“內(nèi)在免疫佐劑”的熱休克蛋白(HSP)重組，組成HSP70-AFP復(fù)合物，可增強(qiáng)其免疫原性，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)更好地發(fā)揮效應(yīng)[32]。熱休克蛋白具有“分子伴侶”功能，可協(xié)助蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊、移位、修復(fù)及降解等，在熱休克刺激時(shí)，可以快速地從細(xì)胞中釋放出來(lái)。在細(xì)胞外可提呈抗原、活化免疫細(xì)胞、促進(jìn)Th細(xì)胞向Th1轉(zhuǎn)化并激活補(bǔ)體等。腫瘤表達(dá)的HSP-70可結(jié)合多種腫瘤抗原肽，遞呈多個(gè)供T細(xì)胞識(shí)別的抗原表位。并且有更強(qiáng)的活化DC細(xì)胞的功能，滿足表達(dá)率高、特異性強(qiáng)、多克隆活化等特點(diǎn)[33]。研究發(fā)現(xiàn)，HSPs的C末端有免疫原性，可刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，進(jìn)而誘導(dǎo)DC成熟[34]。N末端在提呈抗原肽中發(fā)揮重要作用。HSP通過(guò)HSP抗原肽復(fù)合物把抗原呈遞給抗原提呈細(xì)胞，通過(guò)MHC-Ⅰ類(lèi)分子激發(fā)CTL反應(yīng)，促使DC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌炎性因子，上調(diào)CD8和IFN-γ含量，下調(diào)TGF-β1的含量[35], 發(fā)揮免疫效應(yīng)。

4 甲胎蛋白在肝癌免疫治療中的應(yīng)用前景

4.1 肝癌臨床疫苗研發(fā)

肝癌疫苗是利用肝癌細(xì)胞或抗原誘導(dǎo)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答，達(dá)到預(yù)防治療肝癌的目的。甲胎蛋白作為肝癌相關(guān)性抗原，可促進(jìn)肝癌的發(fā)生[36]，與細(xì)胞膜受體結(jié)合后通過(guò)影響cAMP和Ca2+濃度，從而影響癌基因的表達(dá)[37， 38]，并且通過(guò)抑制AFP，可以抑制肝癌細(xì)胞增殖，并且誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡[39-41]。所以使得甲胎蛋白成為治療肝癌的新靶點(diǎn)。

4.2 肝癌多肽疫苗的發(fā)展

多肽疫苗的優(yōu)勢(shì)在于具有免疫應(yīng)答能力、安全、反應(yīng)原性低等特點(diǎn)。目前有抗病毒、抗癌、抗瘧和避孕等多肽疫苗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)[42]。在肝癌免疫治療中，由于具有特異性和體內(nèi)免疫效應(yīng)持久等優(yōu)勢(shì)，DC疫苗表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。如何增強(qiáng)DC細(xì)胞的抗原提呈功能，發(fā)揮強(qiáng)大的殺傷肝癌細(xì)胞能力是目前研究的重點(diǎn)。有大量研究取得進(jìn)展，包括：利用唑來(lái)磷酸鹽刺激的DC細(xì)胞可以使T細(xì)胞分泌大量的干擾素，增強(qiáng)細(xì)胞殺傷功能[43]；將肝癌患者分離的DC細(xì)胞與OK432聯(lián)合白細(xì)胞介素-4與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子共培養(yǎng)2 d，通過(guò)動(dòng)脈導(dǎo)管注入肝癌組織中，可以使血清產(chǎn)生大量IL-9、IL-15及腫瘤壞死因子等，延長(zhǎng)患者壽命[44]；為DC細(xì)胞加載甲胎蛋白，臨床觀察發(fā)現(xiàn)，此DC疫苗有良好的安全性和耐受性[45]，并且甲胎蛋白的細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位多肽抗原疫苗(MAP)誘導(dǎo)的CTL 反應(yīng)的能力強(qiáng)于單肽，且只對(duì)AFP陽(yáng)性腫瘤有殺傷效應(yīng)[46]。由于甲胎蛋白的免疫原性較弱，熱休克蛋白以“分子伴侶”“免疫佐劑”的身份走進(jìn)人們的視野。用免疫組化等方法發(fā)現(xiàn)幾乎所有肝癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中都存在一定水平的AFP和HSP，并且HSP可以將在胞質(zhì)中的AFP轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜并釋放抗原至血清，使其暴露[47]。并且，編碼AFP和HSP-70的免疫重組疫苗可產(chǎn)生有效的AFP特異性T細(xì)胞反應(yīng)，有效殺傷腫瘤細(xì)胞[48]。隨著研究的進(jìn)展，王小平[49， 50]等用戊二醛交聯(lián)的方法，構(gòu)建了潛在的治療性的蛋白疫苗HSP72-AFP或gp96-AFP重組疫苗，這些重組疫苗可以引起特定的抗腫瘤免疫，使得肝癌的治療研究又向前邁了一大步。

5 小結(jié)

綜上所述，甲胎蛋白在肝癌發(fā)生發(fā)展及免疫治療中均起著重要作用，免疫治療是目前肝癌治療方法的重要研究方向，并且肝癌免疫治療已經(jīng)在治療肝癌方面取得一定療效。雖然目前對(duì)免疫治療的應(yīng)用還是輔助性的，但隨著不斷深入地研究，肝癌免疫治療方法在未來(lái)有望發(fā)揮更大的作用。

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中圖分類(lèi)號(hào)R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)2095-1736(2016)02-0095-05

作者簡(jiǎn)介：趙 倩，碩士，主要從事腫瘤分子免疫病理學(xué)研究；通信作者:王小平,博士，教授，碩士生導(dǎo)師, 主要從事腫瘤分子免疫病理學(xué)研究，Email：wxpphd@aliyun.com。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81172135，81310108008)；陜西教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目(07JK233，10JK484，14JS025)

收稿日期：2015-06-02；修回日期：2015-06-25

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.02.095