沙門氏菌檢測的不確定度研究

崔晗，劉玥婷，孫赟，柳媛，徐婕，趙航

（1.大連出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連116050；2.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連116000）

沙門氏菌檢測的不確定度研究

崔晗1，劉玥婷1，孫赟2，柳媛1，徐婕1，趙航1

（1.大連出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連116050；2.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連116000）

隨著我國實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平的不斷提高，對于菌類的檢測也達(dá)到了一定的高度。盡管如此，因?yàn)橐恍?shí)驗(yàn)因素的影響，無法保證實(shí)驗(yàn)測量數(shù)據(jù)的精度，通過對于沙門氏菌的不確定度研究，可以分析出影響不確定度比較大的因素，對于我國實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平的提高具有重要意義。

沙門氏菌；不確定度；檢測方法

沙門氏菌是食物傳播病原菌中研究最活躍的細(xì)菌。沙門氏菌也稱豬霍亂沙門氏菌，有的沙門氏菌對人形成專門致病，有的沙門氏菌對動物形成致病，而沙門氏菌對人的病害主要是引起食物中毒。目前從食品中分離和鑒定沙門氏菌，通用的方法分5個(gè)步驟。首先，前增菌。使食物樣品在含有營養(yǎng)的非選擇性培養(yǎng)基中增菌，使受損傷的沙門氏菌細(xì)胞恢復(fù)到穩(wěn)定的生理狀態(tài)。其次，選擇性增菌。在含選擇性抑制劑的促生長培養(yǎng)基中樣品進(jìn)一步增菌的一個(gè)步驟。此培養(yǎng)基允許沙門氏菌持續(xù)增殖，同時(shí)阻止大多數(shù)其他細(xì)菌的增殖。再次，選擇性平板分離。這一步采用固體選擇性培養(yǎng)基，抑制非沙門氏菌的生長，提供肉眼可見的疑似沙門氏菌純菌落的識別。最后，生物化學(xué)篩選。排除大多數(shù)非沙門氏菌，也提供了沙門氏菌培養(yǎng)物菌屬的初步鑒定。血清學(xué)技術(shù)提供了培養(yǎng)物菌種的鑒定。

1 不確定度概述

1.1 研究不確定度的意義

不確定度意指測量誤差的存在，對于結(jié)果的準(zhǔn)確性存在著不確定性程度，從另一個(gè)側(cè)面也能反映出實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)度。不確定度越小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果越接近真實(shí)值[1]，質(zhì)量就會越高，水平也就越高，其使用的價(jià)值也就會越高。對于不確定度的研究是學(xué)界對于誤差判斷的最新理解和闡述，是實(shí)驗(yàn)性誤差研究的新思維。在研究不確定度時(shí)，也要準(zhǔn)確分析誤差與不確定度的區(qū)別，統(tǒng)計(jì)學(xué)家與測量學(xué)家一直在尋找合適的術(shù)語正確表達(dá)測量結(jié)果的可靠性。譬如以前常用的偶然誤差，由于“偶然”二字表達(dá)不確切，已被隨機(jī)誤差所代替，近年來人們感到“誤差”二字的詞義較為模糊，如講“誤差是±1%”，使人感到含義不清晰。但是，若講“不確定度是±1%”則含義是明確的。因而用隨機(jī)不確定度和系統(tǒng)不確定度分別取代了隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差。測量不確定度與測量誤差是完全不同的概念，它不是誤差，也不等于誤差。不確定度目前有2種表達(dá)方式，一是標(biāo)準(zhǔn)不確定度，二是擴(kuò)展不確定度。標(biāo)準(zhǔn)的不確定度體現(xiàn)于測量值的分散性，一般根據(jù)分散程度得出標(biāo)準(zhǔn)的不確定度。

1.2 校準(zhǔn)的不確定度

測量的不確定度是指在某一測量過程中，某一項(xiàng)的結(jié)果值與實(shí)際結(jié)果存在的誤差，而影響這一現(xiàn)象的因素有多種，包括主標(biāo)準(zhǔn)、被測標(biāo)準(zhǔn)、人員、方法和環(huán)境等多方面因素影響。不確定度與準(zhǔn)確度不同，它只是實(shí)驗(yàn)的測量結(jié)果，而準(zhǔn)確度針對的是標(biāo)準(zhǔn)裝置或標(biāo)準(zhǔn)器。[2]在檢測試驗(yàn)中，檢測試驗(yàn)的技術(shù)狀況由周期鑒定保證，同時(shí)還要設(shè)定有效期限。在測量時(shí)一定要有統(tǒng)一試驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，測量過程中檢測、實(shí)驗(yàn)的其他技術(shù)由控制實(shí)驗(yàn)的規(guī)程規(guī)定，這也說明實(shí)驗(yàn)過程管理規(guī)律性的重要性。在實(shí)驗(yàn)室定期檢查過程中，分為幾大環(huán)境狀況，既檢測實(shí)驗(yàn)、檢測實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員、檢測實(shí)驗(yàn)環(huán)境、測量方法等。檢測實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)也與以上幾大狀況有關(guān)，要求每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室的規(guī)程做到標(biāo)準(zhǔn)化，當(dāng)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)檢測異常時(shí)，應(yīng)確定是否是實(shí)驗(yàn)室檢測環(huán)節(jié)出現(xiàn)了問題，并及時(shí)找到原因，采取措施及時(shí)糾正。

實(shí)驗(yàn)室校準(zhǔn)的不確定度也要求所有的檢測標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)及各類型的校準(zhǔn)都應(yīng)具有評定測量不確定程序。對于校準(zhǔn)的不確定度，需要開展不確定度評估的領(lǐng)域有：對校準(zhǔn)的檢測實(shí)驗(yàn)室，必須每項(xiàng)參數(shù)都進(jìn)行不確定度評價(jià)；對于儀器校準(zhǔn)、儀器校正、儀器校驗(yàn)、儀器計(jì)量實(shí)驗(yàn)室，必須具備完整的不確定度評價(jià)程序，必須具有對所檢項(xiàng)目進(jìn)行不確定度評估的能力[3]。

2 沙門氏菌的不確定度分析

2.1 不確定度的分析來源

①被測量數(shù)據(jù)及定義的不完整性，主要是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果的不全面。②測量方法在實(shí)驗(yàn)中不夠理想。測量方法對于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的結(jié)果影響很大，直接影響不確定度的值域大小。③取樣的代表性不夠。由于實(shí)驗(yàn)本身帶有的一種不確定性，有時(shí)候取樣由于受現(xiàn)實(shí)環(huán)境的限制，并不能代表被測量的真實(shí)情況，同時(shí)一般實(shí)驗(yàn)也只能通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，所以取樣的代表性往往對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，勢必影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不確定度。④測量過程受環(huán)境影響或?qū)嶒?yàn)前未完善實(shí)驗(yàn)環(huán)境，在實(shí)驗(yàn)時(shí)測量結(jié)果受環(huán)境的影響是必然的，也是不可避免的。⑤測量儀器的分辨力及測量敏感度對不確定度的影響，儀器的好壞對結(jié)果產(chǎn)生直接的影響，這也是儀器使用的局限性。⑥測量標(biāo)準(zhǔn)或測量物質(zhì)的不標(biāo)準(zhǔn)性。測量的標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)一定條件設(shè)定的，因?yàn)槭侨藶樵O(shè)定的，必將影響實(shí)驗(yàn)測量結(jié)果的確定度。⑦實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生于對比，對于不確定度的研究，其不確定度分析來源離不開測量方法的近似假設(shè)。因此，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性與以上因素息息相關(guān)，對于實(shí)驗(yàn)的結(jié)果把控離不開以上因素。同樣，對于沙門氏菌的不確定度研究也離不開對于以上數(shù)據(jù)的分析。

2.2 沙門氏菌的檢測原理及流程

沙門氏菌是需氧菌，具有較完善的呼吸酶系統(tǒng)，需分子氧做受氫體，只能在有氧條件下生長繁殖。厭氧菌缺乏完善的呼吸酶系統(tǒng)，受氫體為有機(jī)物，只能在無氧條件下生長繁殖：兼性厭氧菌具有完善的呼吸酶系統(tǒng)，在有氧或無氧環(huán)境中都能生長。

檢測流程1：測定樣品→取樣→稀釋樣品→培養(yǎng)基表面涂布→沙門氏菌個(gè)數(shù)→報(bào)告結(jié)果。

檢測流程2：樣品25g+225mL生理鹽水→10倍系列稀釋→選擇兩三個(gè)適宜稀釋度，各以0.1mL加入到MRS平板進(jìn)行涂布→（36±1）℃培養(yǎng)→沙門氏菌總數(shù)→報(bào)告結(jié)果。

2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及步驟

20個(gè)樣品選擇10-5、10-6、10-73個(gè)連續(xù)的稀釋度進(jìn)行沙門氏菌總數(shù)檢測，同一個(gè)樣品每次平行檢測2次，最終采用合并樣品標(biāo)準(zhǔn)差來求檢測結(jié)果的不確定性。

具體步驟如下：①整個(gè)操作均在無菌環(huán)境下進(jìn)行，先將蛋白胨、牛肉浸出粉、瓊脂、蒸餾水制成普通瓊脂培養(yǎng)基；②調(diào)節(jié)pH，0.1MPa，20min滅菌，趁熱加入其他成分，充分搖勻使溶解，制得平板后備用；③按上述過程，再取1mL無菌吸管，10倍遞增樣品勻液；④沙門氏菌總數(shù)計(jì)數(shù)，首先估計(jì)樣品的活菌總數(shù)，每個(gè)稀釋度吸取0.1mL樣品均勻液分別置于2個(gè)普通瓊脂培養(yǎng)基，然后使用L形線進(jìn)行涂布，在（36±1）℃下進(jìn)行培養(yǎng)，從稀釋到培養(yǎng)時(shí)間間隔必須在15min內(nèi)，然后在平板上查出所有菌落。通過記錄稀釋倍數(shù)的所有菌落數(shù)量，以CFC/g表示。實(shí)驗(yàn)取菌落數(shù)在30～300CFU的平板上進(jìn)行查取，選擇的10-5、10-6、10-73個(gè)平板中的2個(gè)平板的平均數(shù)進(jìn)行計(jì)量。在選擇平板時(shí)，要選擇比較均勻的平板，大片的菌落平板一般不作為實(shí)驗(yàn)參考平板，有的平板只有1/2的菌落分布，而且比較均勻，可以查出菌落數(shù)并乘以2。

2.4 測量結(jié)果與分析

菌落數(shù)在30～300CFU時(shí)，按公式計(jì)算：N=∑C/（n1+0.1n2）d，∑C為平板菌落數(shù)，n1為第一稀釋度的平板個(gè)數(shù)，n2為第二稀釋度的平板個(gè)數(shù)。

沙門氏菌的不確定度來源，主要是培養(yǎng)條件，分為培養(yǎng)時(shí)間允差及培養(yǎng)適度的允差，沙門氏菌既是需氧菌也兼具厭氧菌。所以，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看到，在培養(yǎng)基上的分布大部分都是均勻的，大部分菌落的分布也很均勻，得出培養(yǎng)條件對不確定度影響不大。實(shí)驗(yàn)要求在15min完成，且多次進(jìn)行稀釋，從培養(yǎng)的菌落中可以看出稀釋對不確定度影響很大。通過以上實(shí)驗(yàn)可以分析出可能影響沙門氏菌實(shí)驗(yàn)不確定度的三大因素，一是實(shí)驗(yàn)測量結(jié)果是否具有完成性，二是需了解實(shí)驗(yàn)的設(shè)備、器材及人員操作水平等，三是改進(jìn)測量方法及提高實(shí)驗(yàn)檢測水平。同時(shí)，對不確定度展開細(xì)化研究，包括培養(yǎng)條件、樣品保存條件、重復(fù)性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，沙門氏菌經(jīng)過重復(fù)測量，每次測量的結(jié)果相差較大，分散性也有明顯差異，對不確定度影響較大，而對于一些實(shí)驗(yàn)儀器如天平、移液管、錐形瓶、菌落計(jì)數(shù)器，這些器材對于不確定度的影響可以忽略不計(jì)。

從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來看，檢測方法可以影響到計(jì)量學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)上的有效計(jì)算；合理的不確定度評定，可以根據(jù)對方法及特性的理解和測量范圍，并結(jié)合經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)；對于實(shí)驗(yàn)測量的結(jié)果具有影響的因素，應(yīng)對其進(jìn)行充分的分析，保證其對實(shí)驗(yàn)測量的不確定因素在經(jīng)驗(yàn)值范圍內(nèi)。從檢測結(jié)果還可以發(fā)現(xiàn)，用貝塞爾公式直接計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，會因?yàn)閿?shù)據(jù)的分散導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差值較大，所以可以先對分散值取對數(shù)，再對其結(jié)果進(jìn)行比較分析。

3 結(jié)論

隨著生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，沙門氏菌的檢測和鑒定技術(shù)也在不斷的完善。而對于沙門氏菌的不確定度研究，對于人類在生物制藥及其他領(lǐng)域都有重要意義，也是未來實(shí)驗(yàn)原因分析的新思路。通過實(shí)驗(yàn)對沙門氏菌的不確定度進(jìn)行研究，同樣可以看到沙門氏菌研究存在的問題，對于解決沙門氏菌實(shí)驗(yàn)中的難題具有非常好的效果。

[1]陳玲,張菊梅,楊小鵑,等.南方食品中沙門氏菌污染調(diào)查及分型[J].微生物學(xué)報(bào),2013,53(12):1326-1333.

[2]楊保偉,曲東,申進(jìn)玲,等.陜西食源性沙門氏菌耐藥及相關(guān)基因[J].微生物學(xué)報(bào),2010,50(6):788-796.

[3]黃福標(biāo),盧冰霞,劉磊,等.屠宰豬腸道沙門氏菌的分離鑒定、耐藥性分析及致病性試驗(yàn)[J].中國畜牧獸醫(yī),2012,39(1):172-177.

Study on the Uncertainty of Salmonella

Cui Han1,Liu Yue-ting1,Sun Yun2,Liu Yuan1,Xu Jie1,Zhao Hang1
(1.Dalian Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Liaoning Dalian 116050;2.Liaoning Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Liaoning Dalian 116000)

With the level of experimental technology of our country continues to improve,the fungus research has reached a certain height.In spite of this,because of some experimental factors,the complete accuracy of the experimental measurement data can not be guaranteed,through the research on the uncertainty of Salmonella,it is important to analyze the factors that affect the degree of uncertainty,which is important to improve the level of experimental technology in our country.This paper is based on the uncertainty of the entrance of Salmonella,Salmonella and briefly describes the relevant concepts of uncertainty,the uncertainty of Salmonella research experiment.Based on this,in view of the uncertainty of the Salmonella,a brief description of the relevant concepts of Salmonella and its uncertainty and its experimental results were described.

Salmonella;Uncertainty;Detection method

R516.3

A

2096-0387（2016）06-0055-03

崔晗（1980-），女，內(nèi)蒙古人，碩士，工程師，研究方向：食品分析。