凡納濱對(duì)蝦TOR蛋白下游信號(hào)傳導(dǎo)因子eIF4E2和eIF4E1A基因克隆與功能分析

辛 芳, 王 雷 劉 梅 王寶杰 蔣克勇 孫國瓊

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室, 海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

凡納濱對(duì)蝦TOR蛋白下游信號(hào)傳導(dǎo)因子eIF4E2和eIF4E1A基因克隆與功能分析

辛 芳1,2, 王 雷1, 劉 梅1, 王寶杰1, 蔣克勇1, 孫國瓊1

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室, 海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

為研究mTOR信號(hào)通路在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)氨基酸代謝中的調(diào)控作用, 本研究利用RACE技術(shù)首次克隆獲得了凡納濱對(duì)蝦肌肉組織中eif4e2和eif4e1a基因的全長cDNA序列。eif4e2基因cDNA序列全長1 069 bp, 開放閱讀框699 bp, 編碼232個(gè)氨基酸; eif4e1a基因cDNA序列全長3579bp, 開放閱讀框627bp, 編碼208個(gè)氨基酸。氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化分析均證實(shí)eIF4E2和eIF4E1A為目前已知的eIF4E家族蛋白的同源蛋白。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法研究了eif4e2和eif4e1a基因在凡納濱對(duì)蝦不同組織中的表達(dá)差異以及注射雷帕霉素或氨基酸后肌肉中eif4e2和eif4e1a基因表達(dá)量的變化情況, 探討了eif4e2和eif4e1a基因在細(xì)胞生長中的調(diào)控作用。結(jié)果表明, 凡納濱對(duì)蝦eif4e2和eif4e1a基因在眼柄、肝胰臟、腸道、胃、鰓絲和肌肉等組織中均有表達(dá); 其中eif4e2基因在肌肉中的表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05), eif4e1a基因在腸道和肌肉中都有較高表達(dá)量, 且在腸道中的表達(dá)量顯著高于其在肌肉中的表達(dá)量(P<0.05); 注射雷帕霉素后2 h內(nèi)肌肉中eif4e2和eif4e1a基因表達(dá)量都出現(xiàn)顯著下降(P<0.05); 肌肉中eif4e1a基因的表達(dá)量在單獨(dú)注射亮氨酸或精氨酸4 h內(nèi)均未出現(xiàn)變化, 但在同時(shí)注射亮氨酸和精氨酸后表達(dá)量顯著增加(P<0.05); 肌肉中eif4e2基因在注射亮氨酸、精氨酸及亮氨酸加精氨酸后表達(dá)量都明顯提高(P<0.05), 且同時(shí)注射亮氨酸和精氨酸后, 基因表達(dá)變量明顯比單獨(dú)注射亮氨酸或精氨酸后變化量大。本研究從動(dòng)物分子營養(yǎng)學(xué)角度出發(fā), 克隆了凡納濱對(duì)蝦mTOR信號(hào)通路中eif4e2和eif4e1a兩個(gè)基因, 并證明其能夠通過mTOR信號(hào)通路接收不同氨基酸信號(hào)來調(diào)控細(xì)胞生長, 對(duì)于深入了解對(duì)蝦的生長和代謝調(diào)控機(jī)制、飼料配方的優(yōu)化以及建立合理的養(yǎng)殖管理模式都具有重要的意義。

eIF4E; 凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei); mTOR; 氨基酸; 生長

動(dòng)物細(xì)胞生長調(diào)控是一個(gè)受多因素影響的復(fù)雜過程, 它不僅受到動(dòng)物生長不同時(shí)期的限制, 營養(yǎng)條件等細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境條件也都是重要的影響因素。只有在營養(yǎng)元素充足且外界理化條件合適的情況下,動(dòng)物細(xì)胞才能進(jìn)行快速的營養(yǎng)代謝, 并獲得最快生長[1]。在機(jī)體細(xì)胞中, mTOR(mechanistic target of rapamycin)信號(hào)通路接收來自于營養(yǎng)素、生長因子或者環(huán)境脅迫等信號(hào), 通過調(diào)控細(xì)胞的合成代謝和分解代謝, 實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生長和生理活動(dòng)的精確調(diào)控,其中最典型的就是對(duì)蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)控[2-3]。另外, mTOR信號(hào)通路也調(diào)控脂類物質(zhì)合成以補(bǔ)充新增殖細(xì)胞的細(xì)胞膜形成[4]; 當(dāng)細(xì)胞中能量水平較低時(shí), 通過激活H1F1α的轉(zhuǎn)錄和翻譯促進(jìn)糖酵解產(chǎn)生能量[5];還參與抑制細(xì)胞的自我吞噬和溶酶體形成[6]。mTOR信號(hào)通路接收營養(yǎng)素信號(hào), 并對(duì)下游效應(yīng)因子做出調(diào)控主要是由細(xì)胞環(huán)境中氨基酸濃度決定的[7], 并且有研究表明: 亮氨酸和精氨酸對(duì)mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用尤其顯著[8-9]。

eIF4E(Eukaryotic translation initiation factor 4E)是mTOR信號(hào)通路下游的信號(hào)傳導(dǎo)因子, 能夠通過eIF4E-BP(eIF4E binding protein)接收來自TOR蛋白的信號(hào), 而起到調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的重要作用[10]。eIF4E作為蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合物eIF4F的關(guān)鍵部分,是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵因子[11]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)翻譯起始時(shí), eIF4E首先結(jié)合到mRNA的5′帽結(jié)構(gòu)上,然后募集eIF4G和eIF4A, 形成eIF4F復(fù)合物, 再將核糖體小亞基招募到mRNA上開始肽鏈合成[12]。Altmann等[13]克隆獲得了小鼠(Mus musculus)eif4e基因的cDNA序列, 并發(fā)現(xiàn)當(dāng)用小鼠eif4e基因代替酵母細(xì)胞中eif4e基因時(shí), 酵母仍然有正常的細(xì)胞活性,并能夠進(jìn)行生長和繁殖, 說明eIF4E與其他翻譯因子之間的相互作用是高度保守的。2004年, Javier等[14]從斑馬魚(Danio rerio)中克隆了兩個(gè)eif4e家族的基因, 并發(fā)現(xiàn)eif4e1a和eif4e1b兩個(gè)基因在功能上有較大差異, eif4e1a廣泛表達(dá)于斑馬魚的各個(gè)組織, eif4e1b只在早期胚胎的性腺和肌肉中表達(dá)。

凡納濱對(duì)蝦是世界對(duì)蝦養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)品種,目前針對(duì)其營養(yǎng)調(diào)控以及細(xì)胞生長的分子營養(yǎng)學(xué)研究鮮有報(bào)道。開展水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物分子營養(yǎng)學(xué)研究可以通過對(duì)不同營養(yǎng)狀態(tài)下動(dòng)物個(gè)體基因表達(dá)譜的差異分析, 發(fā)現(xiàn)更多用于評(píng)價(jià)營養(yǎng)狀態(tài)的分子標(biāo)記物,有助于確定水產(chǎn)動(dòng)物的營養(yǎng)需要量[15]。

在斑馬魚和小鼠等模式生物eif4e基因研究的基礎(chǔ)上, 本研究克隆獲得了凡納濱對(duì)蝦eif4e2和eif4e1a基因(根據(jù)其序列與已知序列的同源性命名)的cDNA序列, 分別對(duì)其進(jìn)行了比對(duì)和分析; 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測了eif4e2和eif4e1a基因的組織特異性表達(dá)以及雷帕霉素(Rapamycin)、亮氨酸(Leu)和精氨酸(Arg)對(duì)eif4e2和eif4e1a基因在肌肉組織中表達(dá)水平的影響。研究證實(shí)了eif4e2和eif4e1a基因存在于凡納濱對(duì)蝦的mTOR信號(hào)通路中, 且能夠接收氨基酸信號(hào)調(diào)控蛋白質(zhì)合成, 進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長。為研究對(duì)蝦等甲殼動(dòng)物的營養(yǎng)調(diào)控機(jī)理提供了重要的理論基礎(chǔ), 也為水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)蝦飼料配方調(diào)配和水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長機(jī)制研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦體長9.0 cm±1.0 cm, 養(yǎng)殖和實(shí)驗(yàn)均于青島市膠南瑞茲海珍品養(yǎng)殖基地進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過程中, 對(duì)蝦養(yǎng)殖在約1 m3的白色方形水槽中,自然光照, 鹽度為30, 持續(xù)充氣, 室溫。

1.2 基因克隆

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)課題組前期對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析的結(jié)果, 對(duì)數(shù)據(jù)庫中注釋為mTOR信號(hào)通路的基因序列, 利用primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE實(shí)驗(yàn)所需特異性引物以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物, 見表1。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 用于基因克隆和熒光定量的引物序列Tab. 1 Nucleotide primers used in gene cloning and real-time PCR

引物名稱 序列(5′-3′) 用途qeIF4E2-F TGGAATCAAACCTATGTGGG qeIF4E2-R GTCCTCCTGGAAGCGTA qeIF4E1A-F TCCCTTTCCCTAACCCTCA qeIF4E1A-R GTTTTGCTGTCTCGCTTCC EF1αF TGGCTGTGAACAAGATGGAC EF1αR AGATGGGGATGATTGGGACC熒光定量

1.2.2 cDNA全長基因克隆

取凡納濱對(duì)蝦肌肉組織約50 mg, 用Trizol法抽提總RNA, 以oligo d (T)或3′CDS為引物, 用Takara M-MLV反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 儲(chǔ)存于–20℃冰箱中。

3′RACE: 以3′CDS為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板, UPM/特異性引物3F1和NUP/特異性引物3F2為引物進(jìn)行巣式PCR, 擴(kuò)增得到3′端序列。

5′RACE: 以oligo d(T)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,經(jīng)純化后, 用Takara TdT酶在cDNA末端加poly(C),以此為模板, oligo d(G)和特異性引物5R1、5R2、5R3為引物進(jìn)行巣式PCR, 擴(kuò)增得到5′端序列。

取60 μL獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,切下目的條帶, 用3S柱式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒回收?；厥盏漠a(chǎn)物連接到Trans-T1載體上,轉(zhuǎn)入Trans DH5α大腸桿菌中進(jìn)行序列測定, 序列測定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

將測序獲得的3′端序列、5′端序列以及轉(zhuǎn)錄組獲得序列進(jìn)行拼接, 得到基因的cDNA全長。

1.2.3 基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站查找同源基因序列和氨基酸序列;開放閱讀框的尋找利用ORF Finder (Open Reading Frame Finder)在線軟件; 序列翻譯和蛋白質(zhì)相似性分析利用DNAMAN和ClustalW等軟件; 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建利用MEGA5.1軟件的最大似然法進(jìn)行; 利用http: //smart.embl-heidelberg.de/網(wǎng)站提供的蛋白質(zhì)序列分析工具查找功能域。

1.3 基因表達(dá)的組織分布

隨機(jī)挑選4只凡納濱對(duì)蝦, 分別取眼柄、肝胰臟、腸道、胃、鰓絲和肌肉等新鮮組織約50 mg放于Trizol中, 采用Trizol法提取總RNA, 利用Takara Reverse Transcriptase M-MLV(RnaseH)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 用于組織差異表達(dá)熒光定量。

1.4 雷帕霉素和氨基酸注射實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

進(jìn)行雷帕霉素應(yīng)答實(shí)驗(yàn)時(shí), 將凡納濱對(duì)蝦隨機(jī)分成兩組養(yǎng)殖于室內(nèi)水槽中。第一組注射500 mmol/L的雷帕霉素, 第二組注射75% DMSO(雷帕霉素的溶劑), 每尾蝦自倒數(shù)第二腹節(jié)肌肉注射100 μL。注射開始記為0 h, 分別在0.5、1、2、3和4 h取樣。雷帕霉素注射濃度和取樣時(shí)間根據(jù)Oshiro等[16]mTOR信號(hào)通路相關(guān)研究及實(shí)驗(yàn)室原有研究[17]確定。每尾蝦取第一腹節(jié)肌肉組織約50 mg, 提取總RNA, 每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取4只蝦作為平行。

進(jìn)行氨基酸應(yīng)答實(shí)驗(yàn)時(shí), 將凡納濱對(duì)蝦隨機(jī)分成4組。第一組注射0.1 mol/L亮氨酸, 第二組注射0.1 mol/L精氨酸, 第三組注射0.1 mol/L亮氨酸+精氨酸(1︰1), 第四組注射0.01 mol/L pH7.4 PBS溶液(氨基酸溶劑), 每尾蝦自尾節(jié)處腹腔注射 100 μL。從0 時(shí)起, 分別在 0.5、1、2, 3和4 h取樣。注射濃度和取樣時(shí)間根據(jù)Hara等[18-19]mTOR信號(hào)通路相關(guān)研究及實(shí)驗(yàn)室原有研究確定。每尾蝦取第一腹節(jié)肌肉組織約 50 mg, 提取組織總 RNA, 每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取4只蝦作為平行。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

采用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行Real-time PCR, 20 μL反應(yīng)體系為: 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL, 正反向引物(10 nmol/L)各0.4 μL, cDNA 1 μL, ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)條件: 95℃-30 s; 95℃-5 s, 60℃-30 s, 45個(gè)循環(huán); 結(jié)束。以凡納濱對(duì)蝦EF1α為內(nèi)參基因, 運(yùn)用Line-Gene K軟件得到各樣品均一化處理的Ct值, 采用2–ΔΔCt法求各樣品mRNA的相對(duì)表達(dá)量, 然后運(yùn)用Excel和SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 并運(yùn)用Origin Pro 8.0繪圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 基因序列分析

將擴(kuò)增獲得的3′端序列、5′端序列以及轉(zhuǎn)錄組測序獲得的部分序列拼接得到: eIF4E2的cDNA 全長序列, 共1 069 bp, 開放閱讀框699 bp, 3′非翻譯區(qū)74 bp,5′非翻譯區(qū)296bp, 翻譯得到232個(gè)氨基酸, 見圖1; eIF4E1A的cDNA 全長序列, 共3 579 bp, 開放閱讀框627 bp, 3′非翻譯區(qū)42 bp, 5′非翻譯區(qū)2 910 bp, 翻譯得到208個(gè)氨基酸, 見圖2。eife2基因和eif4e1a基因編碼的蛋白質(zhì)均含有一個(gè)典型的保守IF4E結(jié)構(gòu)域, 見圖3和圖4。

圖1 凡納濱對(duì)蝦eif4e2完整cDNA序列及推斷氨基酸序列Fig. 1 Complete nucleotide and deduced amino acid sequence of eif4e2 from L. vannamei

2.2 蛋白質(zhì)氨基酸序列分析利用MEGA5.1軟件的最大似然法將相關(guān)已有研究報(bào)道的動(dòng)物eIF4E氨基酸序列與本研究凡納濱對(duì)蝦的兩個(gè)eIF4E家族氨基酸序列分別構(gòu)建進(jìn)化樹,見圖5和圖6。eIF4E2氨基酸序列進(jìn)化樹顯示, 凡納濱對(duì)蝦與日本對(duì)蝦單獨(dú)聚為一支, 親緣關(guān)系最近,其次與其他昆蟲綱節(jié)肢動(dòng)物親緣關(guān)系較近, 與哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。eIF4E1A氨基酸序列進(jìn)化樹顯示,凡納濱對(duì)蝦與其他昆蟲綱節(jié)肢動(dòng)物聚為一個(gè)分支,同時(shí)凡納濱對(duì)蝦單獨(dú)為一個(gè)小分支; 其他軟體動(dòng)物和脊椎動(dòng)物聚于另一分支。

將凡納濱對(duì)蝦的eIF4E2推測氨基酸序列與日本對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicas)、濕木白蟻(Zootermopsis nevadensis)、畢氏粗角蟻(Cerapachys biroi)、小鼠、人類(Homo sapiens)、黃牛(Bos taurus)等的eIF4E2氨基酸序列比對(duì), 相似性分別為99%、72%、65%、62%、62%和60%。將凡納濱對(duì)蝦的eIF4E1A推測氨基酸序列與濕木白蟻、尼日爾蟻(Lasius niger)、螞蟻(Cerapachys biroi)、蜜蜂(Melipona quadrifasciata)、加洲海兔(Aplysia californica)、太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑馬魚、胡瓜魚(Osmerus mordax)等的eIF4E1A(或eIF4E1)氨基酸序列比對(duì), 相似性分別為64%、61%、63%、61%、63%、65%、63%、61%和62%。將本研究獲得的eIF4E2和eIF4E1A推測氨基酸序列進(jìn)行比對(duì), 其相似性為35%。利用Swiss-Modle預(yù)測的兩個(gè)eIF4E蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)都含有8個(gè)反向平行的β折疊和3個(gè)長α螺旋。

圖2 凡納濱對(duì)蝦eif4e1a完整cDNA 序列及推斷氨基酸序列Fig. 2 Complete nucleotide and deduced amino acid sequence of eif4e1a from L. vannamei

圖3 eIF4E2中IF4E超級(jí)家族結(jié)構(gòu)域的位置Fig. 3 Position of domain IF4E superfamily in deduced protein eIF4E2

圖4 eIF4E1A中IF4E超級(jí)家族結(jié)構(gòu)域的位置Fig. 4 Position of domain IF4E superfamily in deduced protein eIF4E1A

圖5 基于eIF4E2氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 5 Phylogenetic tree based on eIF4E2 amino acid sequence

2.3 eif4e2和eif4e1a基因的組織表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了eif4e2和eif4e1a基因在不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示, eif4e2和eif4e1a基因在眼柄、肝胰腺、腸道、胃、鰓絲和肌肉等不同組織中均有表達(dá)(圖7)。eif4e2基因在肌肉中的表達(dá)顯著高于其他組織, 其次是腸道、胃和肝胰腺, 眼柄和鰓絲中表達(dá)量較低; eif4e1a基因在腸道和肌肉中的表達(dá)顯著高于其他組織, 且在腸道中的表達(dá)高于肌肉, 在眼柄、肝胰腺、胃和鰓絲中的表達(dá)量沒有顯著性差異。

圖6 基于eIF4E1A氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 6 Phylogenetic tree based on eIF4E1A amino acid sequence

圖7 凡納濱對(duì)蝦eif4e2和eif4e1a基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig. 7 Relative expression level of eif4e2 and eif4e1a in different tissues of L. vannamei

圖8 eif4e2和eif4e1a基因應(yīng)答雷帕霉素注射的相對(duì)表達(dá)量Fig. 8 Relative expression levels of eif4e2 and eif4e1a in muscle responding to rapamycin

2.4 基因應(yīng)答雷帕霉素注射的表達(dá)分析

為了驗(yàn)證凡納濱對(duì)蝦eIF4E家族因子是否存在于mTOR信號(hào)通路中且受TOR蛋白的調(diào)控, 選擇TOR蛋白抑制劑雷帕霉素進(jìn)行肌肉注射。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了注射雷帕霉素后, 凡納濱對(duì)蝦肌肉組織中eif4e2和eif4e1a兩個(gè)eIF4E家族基因表達(dá)量的變化。以0時(shí)不做處理的對(duì)蝦肌肉組織中基因表達(dá)量為對(duì)照, 計(jì)算和分析注射雷帕霉素和DMSO(對(duì)照組)0.5、1、2、3、和4 h后兩個(gè)eif4e家族基因表達(dá)量的變化。結(jié)果如圖8所示, 注射雷帕霉素后, 凡納濱對(duì)蝦肌肉中兩個(gè)eif4e家族基因的表達(dá)量都受到顯著影響, eif4e1a在注射雷帕霉素0.5 h后表達(dá)量出現(xiàn)顯著下降(P<0.05), 直到第三小時(shí)才恢復(fù)注射前水平。eif4e2在注射雷帕霉素1 h后表達(dá)量出現(xiàn)顯著下降(P<0.05), 直到第4小時(shí)才恢復(fù)注射前水平。

2.5 基因應(yīng)答氨基酸注射的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證凡納濱對(duì)蝦eIF4E家族因子通過mTOR信號(hào)通路接收細(xì)胞外氨基酸信號(hào)來發(fā)揮作用, 選擇mTOR信號(hào)通路較為敏感的亮氨酸和精氨酸進(jìn)行腹腔注射。通過Reatime-PCR實(shí)時(shí)熒光定量的相對(duì)定量法分析了注射不同氨基酸后, 凡納濱對(duì)蝦肌肉中eif4e2和eif4e1a兩個(gè)基因表達(dá)量的變化。以0時(shí)不做處理的對(duì)蝦肌肉組織中基因表達(dá)量為對(duì)照, 計(jì)算和分析注射亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)、亮氨酸加精氨酸(LeuArg)和PBS(對(duì)照組)0.5、1、2和4 h后兩個(gè)eif4e基因表達(dá)量的變化。如圖9所示, 注射亮氨酸后, eif4e1a的表達(dá)量在4 h內(nèi)沒有出現(xiàn)顯著性變化, 而eif4e2的表達(dá)量在1 h后顯著升高; 注射精氨酸后, eif4e1a的表達(dá)量在4 h內(nèi)沒有出現(xiàn)顯著性變化,而eif4e2的表達(dá)量在第4小時(shí)出現(xiàn)顯著升高(P<0.05);同時(shí)注射亮氨酸和精氨酸后, eif4e2和eif4e1a基因在0.5 h都出現(xiàn)極顯著升高(P<0.01), 且升高值顯著大于只注射一種氨基酸時(shí)eif4e表達(dá)量的升高值。

圖9 eif4e2和eif4e1a基因應(yīng)答氨基酸注射的相對(duì)表達(dá)量Fig. 9 Relative expression levels of eif4e2 and eif4e1a in muscle responding to amino acid

3 討論

現(xiàn)有關(guān)于eIF4E家族基因的研究報(bào)道, 大多是進(jìn)行cDNA序列克隆和進(jìn)化分析, 對(duì)其功能的研究報(bào)道還較少。關(guān)于eif4e基因家族功能的研究主要有:線蟲(Caenorhabditis elegans)eIF4E家族不同成員在不同細(xì)胞狀態(tài)下與mRNA帽結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用進(jìn)而調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯[20-21], 表明eIF4E家族成員的多樣性分化不能簡單地用功能冗余來解釋; 在斑馬魚中, eIF4E1A和eIF4E1B蛋白都有與mRNA帽結(jié)構(gòu)及eIF4G相結(jié)合的氨基酸殘基, 但是只有eIF4E1A能與mRNA帽結(jié)構(gòu)及eIF4G發(fā)生相互作用起始蛋白質(zhì)合成,而eIF4E1B不能與之發(fā)生相互作用[14]。Diane等[22]研究發(fā)現(xiàn), 在沒有雷帕霉素存在的情況下, 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中eif4e的過量表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞生長。迄今尚未見甲殼動(dòng)物eif4e基因家族的研究報(bào)道, 本研究在甲殼動(dòng)物中克隆了eif4e基因家族成員eif4e2和eif4e1a并對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究。

3.1 基因序列比較分析

通過基因克隆獲得凡納濱對(duì)蝦eif4e2和eif4e1a基因cDNA全長序列, 將其氨基酸序列分別與其他動(dòng)物的eIF4E氨基酸序列進(jìn)行比對(duì), eIFE2氨基酸序列與其他已報(bào)道動(dòng)物eIF4E2的序列相似性在62%~ 99%, eIFE1A氨基酸序列與其他已報(bào)道動(dòng)物eIF4E1 (或eIF4E1A)的序列相似性在61%~64%, 證明了eif4e2和eif4e1a基因分別與其他已報(bào)道動(dòng)物eif4e2和eif4e1a基因是同源的。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析把凡納濱對(duì)蝦eIF4E2與日本對(duì)蝦eIF4E2單獨(dú)聚為一支, eIF4E1A也單獨(dú)聚為一支, 都與昆蟲綱節(jié)肢動(dòng)物聚在不同分支, 說明eif4e基因在節(jié)肢動(dòng)物的甲殼綱和昆蟲綱之間存在較大的進(jìn)化變異。

根據(jù)NCBI保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測, 凡納濱對(duì)蝦eIFE2和eIFE1A蛋白質(zhì)都含有IF4E結(jié)構(gòu)域。Marcotrigiano等[23]利用X射線蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn), eIF4E蛋白質(zhì)呈杯狀, 包括1個(gè)彎曲、8個(gè)反向平行β片層和3個(gè)長α螺旋, 本研究利用Swiss-Modle預(yù)測的凡納濱對(duì)蝦的兩個(gè)eIF4E蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)都與Marcotrigiano等的研究結(jié)果一致, 兩個(gè)eIF4E蛋白質(zhì)的IF4E結(jié)構(gòu)域具有相似的α/β結(jié)構(gòu), 呈杯狀, 包括8條反向平行的β鏈彎曲形成的β片層以及3條長α螺旋。兩個(gè)eIF4E家族蛋白預(yù)測結(jié)構(gòu)中, 色氨酸殘基多位于杯狀結(jié)構(gòu)的底部, Marcotrigiano 等[24]研究認(rèn)為eIF4E蛋白質(zhì)的杯狀結(jié)構(gòu)底部含有較多色氨酸殘基, 可以便于與 mRNA 5′端帽結(jié)構(gòu)及eIF4G結(jié)合, 進(jìn)而保證eIF4E參與蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合物的形成, 起到啟動(dòng)mRNA翻譯的關(guān)鍵作用。

3.2 基因的組織表達(dá)分析

研究發(fā)現(xiàn), eif4e1基因普遍存在于真核生物中,而eif4e2基因僅存在于后生動(dòng)物中, 兩個(gè)基因在動(dòng)物各個(gè)組織中都有廣泛表達(dá)[25]。本研究基因差異表達(dá)分析結(jié)果顯示, 凡納濱對(duì)蝦eif4e2和eif4e1a基因在所檢測的眼柄、肝胰臟、腸道、胃、鰓絲和肌肉等組織中均有表達(dá); eif4e2基因在肌肉中有較高表達(dá);而eif4e1a基因在腸道和肌肉中都有較高表達(dá), 且在腸道中的表達(dá)高于肌肉。斑馬魚eif4e1a基因在各個(gè)組織中廣泛表達(dá), 但是其在肌肉中的表達(dá)量高于腸道、心臟和魚鰭等組織中的表達(dá)[14]。eif4e基因在肌肉或腸道中的較高表達(dá)與其調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的生物學(xué)功能相對(duì)應(yīng): 肌肉作為動(dòng)物體中生長最快的組織, 肌蛋白合成量最多; 腸道作為主要的營養(yǎng)消化和吸收的場所, 消化和吸收相關(guān)的代謝酶合成量較高。

3.3 注射雷帕霉素后基因功能分析

雷帕霉素在真核細(xì)胞內(nèi)的受體是1個(gè)12 kDa的小分子蛋白質(zhì), 稱為FK506結(jié)合蛋白12(FK506-binding protein 12, FKBP12), 而FKBP12-RAPA復(fù)合物的靶向物質(zhì)是TOR, FKBP12與RAPA結(jié)合可以抑制TOR的活性[26]。TOR蛋白活性被抑制后, 磷酸化4EBP的能力降低, 低磷酸化狀態(tài)的4EBP能夠與eIF4E的結(jié)合, 因此eIF4E不能夠參與蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合物的形成, 從而抑制蛋白質(zhì)合成[27]。本研究設(shè)計(jì)了雷帕霉素注射實(shí)驗(yàn), 驗(yàn)證凡納濱對(duì)蝦eIF4E因子是否存在于mTOR信號(hào)通路中且受TOR蛋白的調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 與對(duì)照組相比, 注射雷帕霉素后凡納濱對(duì)蝦肌肉中eif4e2和eif4e1a基因的表達(dá)量在2 h內(nèi)都出現(xiàn)顯著下降, 表明在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)eif4e2和eif4e1a基因表達(dá)量與mTOR信號(hào)通路密切相關(guān),在TOR蛋白活性受到抑制后, 其表達(dá)量下降, 從而導(dǎo)致細(xì)胞蛋白合成作用降低, 最終影響細(xì)胞的生長。

3.4 注射氨基酸后基因功能分析

Peponi等[28]通過體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明TOR蛋白能磷酸化4E-BP1, 從而使其失去與eIF4E結(jié)合的活性, 增加elf4e的表達(dá), 促進(jìn)與細(xì)胞生長相關(guān)蛋白的翻譯。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠肝臟細(xì)胞中, 亮氨酸和精氨酸通過激活mTOR信號(hào)通路促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成, 并能抑制肝臟細(xì)胞自噬, 同時(shí)也可能抑制腸上皮細(xì)胞自噬介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解[29]。本研究通過等濃度氨基酸注射實(shí)驗(yàn), 分析了凡納濱對(duì)蝦mTOR信號(hào)通路在接收氨基酸信號(hào)后, 肌肉中eif4e2和eif4e1a基因的表達(dá)量變化情況, 結(jié)果顯示, 與PBS對(duì)照組相比, 肌肉中eif4e1a基因僅在同時(shí)注射亮氨酸加精氨酸后表達(dá)量發(fā)生變化; 肌肉中eif4e2基因在注射亮氨酸、精氨酸及亮氨酸加精氨酸后表達(dá)量都發(fā)生明顯變化,且同時(shí)注射亮氨酸加精氨酸后, 基因表達(dá)變量明顯比單獨(dú)注射亮氨酸或精氨酸后變化量大。據(jù)此推測,亮氨酸和精氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉mTOR信號(hào)通路的激活作用可能是疊加的。有關(guān)于小鼠胚胎發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn), 亮氨酸和精氨酸對(duì)胚胎滋養(yǎng)層TOR蛋白復(fù)合物的激活作用是疊加的, 然而亮氨酸和精氨酸對(duì)囊胚發(fā)育的激活作用是相互獨(dú)立的[30]。另外, 根據(jù)凡納濱對(duì)蝦eif4e2和eif4e1a基因應(yīng)答氨基酸注射后在肌肉中的表達(dá)差異, 及其在不同組織中的差異表達(dá), 推測它們可能調(diào)控不同類型蛋白質(zhì)的合成, 或者不止有mTOR信號(hào)通路調(diào)控其活性。

4 總結(jié)

本研究從動(dòng)物分子營養(yǎng)學(xué)角度出發(fā), 克隆了凡納濱對(duì)蝦mTOR信號(hào)通路中eif4e2和eif4e1a兩個(gè)基因, 并分析了他們的氨基酸序列結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化地位; 同時(shí)研究了營養(yǎng)素對(duì)凡納濱對(duì)蝦基因表達(dá)的調(diào)控作用, 為營養(yǎng)素在動(dòng)物體內(nèi)的生理功能提供了更深入的認(rèn)識(shí)。

[1] 仁和, 占秀安. 水產(chǎn)動(dòng)物氨基酸營養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 飼料研究, 2006, 2: 41-43. Ren He, Zhan Xiuan. Research progress on amino acid nutrition of aquatic animals[J]. Feed Research, 2006, 2: 41-43.

[2] Kim J, Guan K L. Amino acid signaling in TOR activation[J]. Annu Rev Biochem, 2011, 80: 1001-1032.

[3] Ma X J M, Blenis J. Molecular mechanisms of mTOR-mediated translational control[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2009, 10(5): 307-318.

[4] Laplante M, Sabatini D M. An emerging role of mTOR in lipid biosynthesis[J]. Current Biology, 2009, 19(22): R1046-R1052.

[5] Duvel K, Yecies J L, Menon S, et al. Activation of a metabolic gene regulatory network downstream of mTOR complex 1[J]. Molecular Cell, 2010, 39(2): 171-183.

[6] Koren I, Reem E, Kimchi A. DAP1, a novel substrate of mTOR, negatively regulates autophagy[J]. Current Biology, 2010, 20(12): 1093-1098.

[7] Proud C G. Regulation of mammalian translation factors by nutrients[J]. Biochem, 2002, 269: 5338-5349.

[8] Kimball S R. Regulation of translation initiation by amino acids in eukaryotic cells[J]. Prog Mol Subcell Biol, 2001, 26: 155-184.

[9] Hara K. Amino acid sufficiency and mTOR regulate p70 S6 kinase and eIF4E-BP1 through a common effector mechanism[J]. J Biol Chem, 1998, 273: 14484-14494.

[10] Laplante M, Sabatini D M. mTOR signaling in growth control and disease[J]. Cell, 2012, 149(2): 274-293.

[11] 夏良平, 曾宗淵. eIF4E作用及調(diào)節(jié)機(jī)制[J]. 國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊(cè), 2001, 23(5): 280-282. Xia Liangping, Zeng Zongyuan. The function and regulation mechanism of eIF4E[J]. Foreign Medical Sciences Series of Molecular Biology, 2001, 23(5): 280-282.

[12] Sonenberg N, Hershey J W B, Mathews M B. Translational control of gene expression[M]. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000: 39.

[13] Altmann M, Müller P P, Pelletier J, et al. A mammalian translation initiation factor can substitute for its yeast homologue in vivo[J]. Journal of Biological Chemistry, 1989, 264(21): 12145-12147.

[14] Javier R, Bhaveh J, Scott C F, et al. Two zebrafish eif4e family members are differentially expressed and functionally divergent[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(11): 10532-10541.

[15] 李茜, 李建國. 動(dòng)物分子營養(yǎng)學(xué)的研究進(jìn)展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2015, 1: 50-52. Li Qian, Li Jianguo. Research progress in molecular nutriology of animal[J]. Heilonjiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2015, 1: 50-52.

[16] Oshiro N, Yoshino K, Hidayat S, et al. Dissociation of raptor from mTOR is a mechanism of rapamycin induced inhibition of mTOR function[J]. Genes to Cells 2004, 9(4): 359-366.

[17] Sun S, Wang B, Jiang K, et al. Target of rapamycin (TOR) in Fenneropenaeus chinensis: cDNA cloning, characterization, tissue expression and response to amino acids[J]. Aquaculture Nutrition, 2015, 21: 1-9.

[18] Hara K, Yonezawa K, Weng Q P, et al. Amino acid sufficiency and mTOR regulate p70 S6 kinase and eIF-4E BP1 through a common effector mechanism[J]. Journal of Biological Chemistry, 1998, 273(23): 14484-14494.

[19] Kimball S R, Shantz L M, Horetsky R L, et al. Leucine regulates translation of specific mRNAs in L6 myoblasts through mTOR-mediated changes in availability of eIF4E and phosphorylation of ribosomal protein S6[J]. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(17): 11647-11652.

[20] Keiper B D, Lamphear B J, Deshpande A M, et al. Functional characterization of five eIF4E isoforms in Caenorhabditis elegans[J]. Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(14): 10590-10596.

[21] Miyoshi H, Dwyer D S, Keiper B D, et al. Discrimination between mono– and trimethylated cap structures by two isoforms of Caenorhabditis elegans eIF4E[J]. EMBO Journal, 2002, 21(17): 4680-4690.

[22] Fingar D C, Salama S, Tsou C, et al. Mammalian cell size is controlled by mTOR and its downstream targets S6K1 and 4EBP1/eIF4E[J]. Genes and Development, 2002, 16(12): 1472-1487.

[23] Marcotrigiano J, Gingras A C, Sonenberg N, et al. Cocrystal structure of the messenger RNA 5′cap- binding protein (eIF4E) bound to 7-methyl-GDP[J]. Cell, 1997, 89(6): 951-961.

[24] Marcotrigiano J, Gingras A C, et al. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G[J]. Molecular Cell, 1999, 3: 707-716.

[25] Bhavesh J, Amy C, Rosemary J. Characterization of mammalian eIF4E-family members[J]. European Journal of Biochemistry, 2004, 271: 2189-2203.

[26] Harding M W, Galat A, Uehlingd E, et al. A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidylprolyl isomerase[J]. Nature, 1989, 341(6244): 758-760.

[27] Ma X M, Blenis J. Molecular mechanisms of mTOR-mediated translational control[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2009, 10(5): 307-318.

[28] Peponi E, Drakos E, Reyes G, et al. Activation of mammalian target of rapamycin signaling promotes cell cycle progression and protects cells from apoptosis in mantle cell lymphoma[J]. The American Journal of Pathology, 2006, 169(6): 2171-2180.

[29] Blommaart E F, Luiken J J, Blommaart P J, et al. Phosphorylation of ribosomal protein S6 is inhibitory for autophagy in isolated rat hepatocytes[J]. J Biol Chem, 1995, 270: 2320-2326.

[30] Gonzalez I M, Martin P M, Burdsal C, et al. Leucine and arginine regulate trophoblast motility through mTOR-dependent and independent pathways in the preimplantation mouse embryo[J]. Developmental biology, 2012, 361(2): 286-300.

Received:Dec. 18, 2015

Cloning and functional analysis of TOR downstream signaling factors eIF4E2 and eIF4E1A of Litopenaeus vannamei

XIN Fang1,2, WANG Lei1, LIU Mei1, WANG Bao-jie1, JIANG Ke-yong1, SUN Guo-qiong1
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

eIF4E; Litopenaeus vannamei; mTOR; amino acid; growth

The aim of this study was to explore the regulation function of mTOR signaling in the amino acid metabolism of Litopenaeus vannamei. We cloned the full length cDNA of eif4e2 and eif4e1a genes from the muscle of L. vannamei for the first time. The cDNA of eif4e2 was 1069 bp and contained a 699 bp open reading frame that encoded 208 amino acids. The cDNA of eif4e1a was 3579 bp and contained a 627 bp open reading frame that encoded 232 amino acids. We individually compared the deduced eIF4E2 and eIF4E1A amino acid sequences of L. vannamei with other known sequences. The results confirmed their homology. We used a real-time polymerase chain reaction (PCR) to detect the tissue-specific expressions of eif4e2 and eif4e1a in L. vannamei and the responses of eif4e2 and eif4e1a in muscle to the injection of rapamcyin or amino acid (leucine or arginine). We also investigated the functions of eif4e2 and eif4e1a in the cell growth of L. vannamei. The results showed that the eif4e2 and eif4e1a genes were expressed in all the detected tissues, including the eyestalk, hepatopancreas, stomach, intestine, gill, and muscle. The relative expression level of eif4e2 was significantly higher than that of other tissues (P < 0.05). The relative expression levels of eif4e1a in intestine and muscle were both higher than those in other tissues, and that of the intestine was higher than that of the muscle (P < 0.05). The relative expression levels of eif4e2 and eif4e1a in muscle decreased after the injection of rapamcyin (P < 0.05). The relative expression level of eif4e1a was unchanged four hours after the injection of unitary leucine or arginine, while it increased significantly after the simultaneous injections of leucine and arginine (P < 0.05). The relative expression level of eif4e2 increased significantly after the injection of unitary leucine, unitary arginine, or both leucine and arginine (P < 0.05), and the relative expression level of eif4e2 after the simultaneous injections of leucine and arginine was significantly higher than that after injection of unitary leucine or arginine. In conclusion, with respect to animal molecular nutriology, we cloned full-length cDNA of eif4e2 and eif4e1a genes from the muscle of L. vannamei, and the results indicate that eif4e2 and eif4e1a can accept the amino acid signal and regulate cell growth in L. vannamei muscle. This study represents a significant contribution to our understanding of the mechanisms of growth and metabolism regulation, the optimization of feed formulas, and the establishment of a reasonable management model for shrimp culture development.

S917.4

A

1000-3096(2016)12-0071-11

10.11759//hykx 20151218002

(本文編輯: 譚雪靜)

2015-12-18;

2016-03-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41406151)

[Foundation: Program of National Natural Science Funds of China, No.41406151]

辛芳(1989-), 女, 山東日照人, 碩士研究生, 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物分子營養(yǎng)學(xué)研究, 電話: 0532-82898723, E-mail: rzxinfang@163.com;劉梅, 通信作者, 電話: 0532-82898722, E-mail: liumei@qdio.ac.cn