低分子質量褐藻寡糖的高效酶法制備及其抗氧化活性評價

張明杰, 李 恒, 蔣 敏, 郝 瑤, 許正宏, 史勁松

(江南大學 藥學院, 江蘇 無錫 214122)

低分子質量褐藻寡糖的高效酶法制備及其抗氧化活性評價

張明杰, 李 恒, 蔣 敏, 郝 瑤, 許正宏, 史勁松

(江南大學 藥學院, 江蘇 無錫 214122)

褐藻寡糖具有多種生理活性, 本研究通過酶解與分級條件的優(yōu)化, 獲得了低分子質量褐藻寡糖的酶法制備工藝, 并在體外模型上評價了不同分子質量組分的抗氧化活性。結果表明, 優(yōu)化后的褐藻寡糖制備條件為: 底物濃度1.20%, 酶底比4.35 U/mg, 酶解時間4 h。進一步采用乙醇沉淀和超濾分離后, 獲得了重均分子質量分別為0.84、1.40、2.25和34.56 kDa的4種組分, 其得率分別為50.82%、5.15%、11.48%和12.00%。各組分均具有一定的還原能力, 可有效清除DPPH和羥自由基, 其中低分子質量組分A的抗氧化活性最為顯著, 其清除羥自由基的能力與維生素C相近。

褐藻寡糖; 制備工藝; 乙醇沉淀; 超濾; 抗氧化

褐藻寡糖主要由褐藻類植物細胞壁中的褐藻膠降解獲得, 與多糖形式相比, 褐藻寡糖具有更高的溶解度和生物利用度, 有著抗氧化、免疫調節(jié)、抗腫瘤等多種生物活性[1-8]。其中, 抗氧化活性是其他生物活性產生的基礎[9], 能夠減緩生物體內活性氧自由基所造成的細胞和組織損傷。相關研究也顯示, 自由基的過量產生和累積與癌癥、帕金森病等一系列疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[10-11], 而褐藻寡糖對上述疾病均有一定程度的改善作用。因此, 對褐藻寡糖的抗氧化性進行評價, 可以指導其生產工藝, 也可為產品開發(fā)提供依據。

研究表明, 褐藻寡糖的抗氧化活性不僅與其制備方式、M/G比例等相關, 還與組分的分子質量大小相關[12-16]。Zhao等[17]通過酶解制備得到三種褐藻寡糖, 其中分子質量低于1.0 kDa的組分具有較強的羥自由基清除能力, 且分子質量大小對抗氧化性能的影響程度要大于M/G比值。目前, 褐藻寡糖作為功能因子已受到較多關注, 需要建立一種高效、安全、簡便的低分子質量褐藻寡糖的制備工藝來推動其產業(yè)進程。本研究以海藻酸鈉為原料, 通過褐藻膠裂解酶水解方法制備褐藻寡糖, 在水解條件優(yōu)化的基礎上, 利用乙醇沉淀和超濾方法對產物進行分級分離,對所獲得的4種組分進行抗氧化活性分析。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料

褐藻膠裂解酶: 由嗜鹽白蟻菌WX (Isoptericola halotolerans WX)發(fā)酵產酶[18-19], 純化得到酶液, 酶活為870 U/mL; 海藻酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、酒石酸鉀鈉、3, 5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、苯酚、亞硫酸氫鈉等購自國藥化學試劑有限公司; 抗壞血酸(Vitamin C, VC)、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH)、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、鹽酸、水楊酸均為分析純。二到七糖標準品, 購自青島博智匯力生物科技公司。

DNS試劑: 準確稱取酒石酸鉀鈉 244.40 g加入煮沸的500 mL蒸餾水中溶解, 然后依次加入6 g 3, 5-二硝基水楊酸, 21 g氫氧化鈉, 5 g苯酚和5 g亞硫酸氫鈉, 攪拌溶解后定容至1 L, 在棕色瓶中貯存7~10 d后使用。

TLC展開劑: 由正丁醇、甲酸、水按4︰6︰1配制; 顯色劑: HCl 1 mL, 苯胺 2 mL, 二苯胺2 g, 85%磷酸10 mL, 溶于100 mL丙酮中, 棕色瓶儲存。

1.2 實驗儀器

恒溫水浴鍋: 金壇市富華電器有限公司; Milli-Q超濾裝置: Milford公司; 旋轉蒸發(fā)儀: 德國Heidolph公司; 真空冷凍干燥機: 美國Labconco公司; 恒溫磁力攪拌器: 鞏義市予華儀器有限責任公司。

2 實驗方法

2.1 褐藻寡糖的酶法制備工藝研究

2.1.1 酶解時間的影響

以50 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液配制10 mL 1%(W/V)海藻酸鈉溶液, 加入2 mL酶液。40℃下分別水解1~9 h, 反應結束后測定還原糖含量。

2.1.2 酶底比的影響

以50 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液配制10 mL 1%(W/V)海藻酸鈉溶液, 分別加入不同體積的酶液,在40℃下水解4.0 h, 通過測定反應結束后的還原糖含量, 考察不同酶底比水解效果的影響。

2.1.3 底物濃度對酶解效果的影響

以50 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液分別配制0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%(W/V)海藻酸鈉溶液, 按最適加酶量和水解時間考察底物濃度的影響。

2.2 DNS法測定還原糖含量

2.2.1 標準曲線制作

準確稱取10 mg無水葡萄糖醛酸溶解定容至100 mL。分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL標準葡萄糖醛酸溶液, 用去離子水補至1 mL, 各加入1 mL DNS, 沸水浴3 min, 立即冷卻定容至10 mL, 520 nm處測定吸光值。以1 mL去離子水按同樣顯色操作為空白, 以橫坐標為葡萄糖醛酸含量(mg), 縱坐標為吸光值, 繪制標準曲線。

2.2.2 酶解樣品還原糖含量測定方法

分別取1 mL降解產物, 用同樣的方法測定吸光度值, 帶入標準曲線計算其還原糖含量。

2.3 咔唑-硫酸法測定總糖含量

2.3.1 標準曲線制作

準確稱取20 mg葡萄糖醛酸溶解定容至50 mL,分別吸取0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mL標準葡萄糖醛酸溶液, 用去離子水補至1 mL,冰浴條件下加入5mL 0.025 mol/L H2SO4-四硼酸鈉溶液, 混勻后在沸水浴中加熱25 min, 冷卻至室溫后加入0.2 mL 0.1%咔唑-無水乙醇溶液, 震蕩搖勻, 沸水浴加熱15 min, 冷卻至室溫, 520 nm處測定吸光度值, 以橫坐標為葡萄糖醛酸含量(mg), 縱坐標為吸光度值, 繪制標準曲線。

2.3.2 酶解樣品總糖含量測定方法

分別取1 mL降解產物, 用同樣的方法測定吸光度值, 帶入標準曲線計算其總糖。

2.4 低聚糖樣品的平均聚合度

2.5 低分子質量褐藻寡糖的分級制備

褐藻寡糖水解液經10 000 r/min離心5 min去除沉淀, 加入無水乙醇至60%(V/V), 4℃靜置過夜, 離心收集上清, 經濃縮、凍干后得到組分A。離心所得沉淀經去離子水復溶后, 依次通過截留分子質量10 kDa和3 kDa的中空纖維膜進行超濾處理, 再分別經濃縮、凍干得到10 kDa膜截留組分(D)、3 kDa膜截留組分(C)和3 kDa透過組分(B)。

2.6 重均分子質量分析

采用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)法檢測并分析褐藻寡糖平均分子質量, 以不同分子質量葡聚糖標準品制作標準曲線。色譜柱為Shodex Ohpak SB-803HQ (8.0 mm×300 mm), 流動相為0.1 mol/L Na2SO4, 流速為0.5 mL/min, 檢測器為示差折光檢測器, 采用Chemstation色譜工作站和GPC軟件計算分子質量。

2.7 褐藻寡糖抗氧化性活性測定

2.7.1 DPPH自由基清除能力的測定

用無水乙醇配制成0.04 g/L DPPH溶液。分別取2 mL不同濃度的褐藻寡糖和多糖(2、4、6和8 g/L)溶液, 加入等體積的DPPH溶液, 混合均勻后室溫放置30 min, 5000 r/min離心10 min后取上清液于517 nm處測定吸光值。以維生素C(VC)作為陽性對照。樣品對DPPH自由基的清除率用以下公式計算:

A0—無水乙醇與DPPH溶液混合液的吸光值;

A1—樣品溶液與DPPH溶液混合液的吸光值;

A2—樣品溶液與無水乙醇混合液的吸光值。

2.7.2 羥自由基(·OH)清除率的測定

分別吸取1 mL的9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液, 依次加入1 mL不同濃度褐藻寡糖和多糖(2、4、6和8 g/L)的溶液和1 mL 8.8 mmol/L H2O2, 37℃反應30 min, 以蒸餾水為對照, 于510 nm處測定吸光值。以VC作為陽性對照。樣品吸光值為測定吸光值減去不加H2O2時的溶液本底吸光值。按下式計算羥自由基清除率:

A0—空白對照液的吸光值; Ax—加入樣品溶液后扣除本底的吸光值;

Ax0—不加顯色劑H2O2樣品溶液本底的吸光值。

2.7.3 總還原能力的測定

分別吸取2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液(pH 6.6)和1 mL不同濃度褐藻寡糖和多糖(2、4、6和8 g/L)的溶液, 加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀, 混合均勻后于50℃反應20 min, 加入2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應。反應液經5000 r/min離心10 min后取2.5 mL上清液,依次加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL FeCl3, 混勻后靜置10 min, 于700 nm處測定吸光值。以VC作為陽性對照。

3 結果與分析

3.1 褐藻寡糖酶法制備工藝優(yōu)化

3.1.1 酶解時間對降解效果的影響

酶解過程中, 隨時間的推移, 酶解所得褐藻低聚糖的平均聚合度也隨之快速下降(圖1)。酶解4 h后, 低聚糖的平均聚合度趨于平穩(wěn), 其平均聚合度為24.42左右。進一步延長反應時間, 底物的轉化率有所增加, 但從生產效率角度考慮, 適宜的酶解時間4 h。

圖1 時間對海藻酸鈉水解效果的影響Fig. 1 Effect of hydrolysis time on sodium alginate hydrolysis

3.1.2 酶底比對降解效果的影響

從圖2可以看出, 在海藻酸鈉降解過程中, 褐藻低聚糖平均聚合度隨著加酶量的提高而逐漸降低。在酶用量4.35 U/mg時, 酶解所得低聚糖的平均聚合度值近似達到穩(wěn)定, 為16.95。繼續(xù)增加酶量時平均聚合度變化并不顯著, 所以選擇最適加酶量為4.35 U/mg。

圖2 酶底比對海藻酸鈉水解效果的影響Fig. 2 Effect of the ratio of enzyme and substrate addition on sodium alginate hydrolysis

3.1.3 底物濃度對降解效果的影響

海藻酸鈉的水溶液具有高粘度特性, 且隨底物濃度增加, 溶液黏度呈幾何級數上升[20]。因此在能夠保證均勻攪拌的前提下, 底物濃度一般低于2%, 否則呈現凝膠狀態(tài)。實驗考查了不同底物濃度下的水解效果(圖3), 發(fā)現海藻酸鈉濃度為1.2%時, 所得低聚糖的平均聚合度最低, 平均聚合度為9.84, 水解率最高; 之后平均聚合度不再顯著變化。

圖3 底物濃度對海藻酸鈉水解效果的影響Fig. 3 Effect of substrate concentration on sodium alginate hydrolysis

3.2 低分子質量褐藻寡糖的制備工藝

實驗采用乙醇沉淀與超濾法對酶解后的褐藻寡糖進行分級分離。如圖4所示, 采用TLC對4種組分進行分析, 組分A主要由聚合度2-7的褐藻寡糖組成, 推測其平均分子質量小于1.50 kDa; 組分B、C、D分子質量較大, 僅有少量的2-7的褐藻寡糖。

圖4 4種組分TLC圖譜Fig. 4 TLC profile of alginate oligosaccharides

進一步采用HPGPC法檢測各組分分子質量, HPGPC圖譜如圖5所示。4種樣品中均含有多個分子質量分布的寡糖片段。組分A中主要含重均分子質量為0.48 kDa的組分; 組分B中主要含重均分子質量為5.03 kDa的組分; 組分C中主要含重均分子質量為3.68 kDa的組分; 組分D中主要含重均分子質量為51.15kDa和68.23 kDa的兩個組分。

依據Chemstation色譜工作站和GPC軟件計算得到4種組分的重均分子質量(Mw), 如表1所示。褐藻寡糖(平均聚合度<13)的總得率達到67.45%, 其中,組分A得率最高, 達到50.82%。結合制備工藝分析可知, 利用60%的乙醇沉淀, 可以一步得到重均分子質量0.84 kDa的較低分子質量褐藻寡糖組分, 得率達到50%以上; 進一步結合膜分離的方法, 雖無法對不同分子質量低聚糖進行精確分離, 但可高效率的得到較低分子質量的寡糖部分, 并實現不同分子質量分布低聚糖的有效分級。

由以上酶解與分級分離過程得到低分子質量褐藻寡糖的制備工藝, 如圖6所示:

3.3 褐藻寡糖體外抗氧化能力

3.3.1 褐藻寡糖對DPPH的清除能力

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基, 可用來衡量物質的抗氧化能力[21]。表2顯示了原料和經過分級處理的4種組分的DPPH清除活性, 結果表明, 酶解得到的4種組分均具有一定的DPPH清除活性, 且清除作用均隨濃度的升高而增強。其中, 組分A對DPPH清除能力顯著高于其他三種組分。當組分A濃度為6 g/L時, 清除率達到最高, 為78.65%。組分A對DPPH自由基的半抑制濃度IC50為0.79 g/L。Liu等[22]研究了氧化法降解得到的褐藻寡糖體外抗氧化活性,其在2.50 g/L時對DPPH的清除率為40.40%。相比于化學降解法, 酶解的褐藻寡糖具有更好的DPPH清除能力, 可能與其酶解過程中形成雙鍵有關[3]。

圖5 褐藻寡糖的HPGPC色譜圖Fig. 5 High-performance gel chromatogram profiles of alginate oligosaccharides

圖6 低分子質量褐藻寡糖的制備工藝流程圖Fig. 6 Process chart of alginate oligosaccharides

3.3.2 褐藻寡糖對羥自由基的清除能力

羥自由基是造成組織脂質過氧化、蛋白質解聚等的主要活性氧種類, 羥自由基清除率是反映抗氧化劑的抗氧化作用的重要指標[23]。由表3可以看出,海藻酸鈉和4種組分對羥自由基均具有良好的清除能力。與 DPPH 清除活性相似, 4種組分對羥自由基的清除能力隨著各自濃度的升高而增強。在同一濃度下, 4種組分對羥自由基的清除能力均大于海藻酸鈉, 且具有隨分子質量降低, 清除能力增大的趨勢。當組分A的濃度為2 g/L時, 可達到與VC相近的抗氧化結果, 其IC50為0.50 g/L。周緒霞等[13]研究發(fā)現, 分子質量小于8 kDa的褐藻寡糖在濃度為1.20 g/L時, 對羥自由基的清除率達到75%。與之相比, 組分A達到75%羥自由基清除率時的濃度僅為0.59 g/L。由此可見, 經自行篩選的褐藻膠裂解酶降解制備的低分子量褐藻寡糖具有較強的羥自由基清除能力。

研究表明, 寡糖可能通過氫電轉移機制引起內在單糖基團中異頭氫的移動而發(fā)揮羥自由基清除活性[24]。一些研究者也認為, 醇類物質的化學結構能有效地清除羥基自由基[25], 由此推測, 褐藻寡糖的羥基基團為其羥自由基清除功能的發(fā)揮提供了結構基礎。

3.3.3 褐藻寡糖的還原能力

表4可以看出, 海藻酸鈉和4種組分均表現出一定的還原力。在同等濃度下, 組分A的還原力大于其他各低聚糖組分。這也可以為以上不同分子質量低聚糖組分在DPPH和羥自由基清除能力的差異結果提供依據。

綜上所述, 酶解得到的4種褐藻低聚糖組分對DPPH、羥自由基均具有良好的清除作用, 其自身有一定的還原力, 其中, 平均分子質量較小的組分A具有最高的抗氧化活性。文獻報道, 寡糖的分子質量是影響其抗氧化活性的一個重要因素。在硫酸軟骨素、透明質酸等的抗氧化活性評價中, 低分子質量產物均表現出比大分子更高的自由基清除活性, 且不同聚合度低聚糖的活性程度不同。褐藻寡糖抗氧化活性與分子質量的關系與上述結論一致[26-28]。

表2 各組分的DPPH清除活性Tab. 2 Scavenging effects of alginate oligosaccharides on DPPH

表3 褐藻寡糖對羥自由基的清除活性Tab. 3 Scavenging effects of alginate oligosaccharides on ·OH

4 結語

采用自制的褐藻膠裂解酶對海藻酸鈉溶液進行酶解制備褐藻低聚糖, 得到的產物通過60%乙醇沉淀和超濾法進行分級得到4種分子質量不同的組分。通過HPGPC對4個組分的分子量進行檢測, 其平均分子質量分別為0.84、1.40、2.25和34.56 kDa, 其中, 分子質量低于2.25 kDa的褐藻寡糖成分得率達67.45%, 與文獻結果相比, 本實驗在酶解效率及低分子量褐藻寡糖的得率方面具有更明顯的優(yōu)勢[29]。

對這4種組分的抗氧化活性進行評價, 4個組分對DPPH均有一定的清除作用, 并具有劑量依賴關系。其中, 平均分子質量最小的組分A清除DPPH的能力遠大于其余各組分, 其IC50為0.79 g/L。此外,組分A具有較強的羥自由基清除活性和還原力, 2 g/L組分A即表現出與0.8 g/L的VC相近的羥自由基清除效果。綜合抗氧化評價結果來看, 組分A表現出較好的體外抗氧化活性, 也進一步說明分子質量較小的低聚糖具有更強的抗氧化活性, 詳細的抗氧化機制以及構效關系還有待深入研究。

表4 褐藻寡糖的還原力Tab. 4 Reducing power of alginate oligosaccharides

[1] Iwamoto M, Kurachi M, Nakashima T, et al. Structure-activity relationship of alginate oligosaccharides in the induction of cytokine production from RAW264.7 cells[J]. Febs Letters, 2005, 579(20): 4423-4429．

[2] Thiang Y W, Lori A P, Neal L S. Alginate lyase: Review of major sources and enzyme characteristic, structure-function analysis, biological roles, and applications[J]. Annual Review of Microbiology, 2000, 54(2): 289-340.

[3] Xu X, Wu X T, Wang Q Q, et al. Immunomodulatory effects of alginate oligosaccharides on murine macrophage RAW264.7 cells and their structure?activity relationships[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2014, 62, 3168-3176.

[4] Hu X, Jiang X. Antitumour activities of alginate-derived oligosaccharides and their sulphated substitution derivatives[J]. European Journal of Phycology, 2004, 39(1) : 67-71.

[5] Le Q L, Naotsugu N, Vo T T H, et al. Enhancement of plant growth stimulation activity of irradiated alginate by fractionation[J]. Radiation Physics and Chemistry, 2009, 78: 796-799.

[6] 吳燕燕, 張婉, 李來好, 等. 海藻中抗氧化、保濕功能活性物質的研究進展[J]. 海洋科學, 2015, 39(9): 138-142. Wu Yanyan, Zhang Wan, Li Laihao, et al. The research progress of antioxidant and moisturizing active substance in seaweed[J]. Marine Sciences, 2015, 39(9): 138-142.

[7] 劉旭, 曲桂燕, 周裔彬, 等. 泡葉藻及海帶藻渣中巖藻聚糖硫酸酯的提取及其抗氧化活性[J]. 海洋科學, 2013, 37(12): 34-39. Liu Xu, Qu Guiyan, Zhou Yibin, et al. Ultrasound assisted extraction and in vitro antioxidant activity analysis of fucoidans from Ascophyllum mackaii and Laminaria japonica residue[J]. Marine Sciences, 2013, 37(12): 34-39.

[8] 王雪妹, 王晶, 張全斌. 褐藻多糖硫酸酯對脂多糖誘導大鼠腎小球系膜細胞NO產生量的影響[J]. 海洋科學, 2014, 38(10): 1-5. Wang Xuemei, Wang Jing, Zhang Quanbin. Effect of fucoidan on NO production induced by LPS in rat glomerular mesangial cells[J]. Marine Sciences, 2014, 38(10): 1-5.

[9] 甘瑾. 瑪咖(Lepidium meyenii Walp.)抗氧化活性及活性物質基礎的研究[D]. 北京: 中國林業(yè)科學研究院, 2013: 1-112. Gan Jin. Study on antioxidant activities and antioxidative substance basis of Maca (Lepidium mevenii Waip.) [D]. Beijing: Chinese Academy of Forestry. 2013: 1-112.

[10] 董曉莉, 耿美玉, 管華詩, 等. 褐藻酸性寡糖對帕金森病大鼠紋狀體、杏仁核多巴胺釋放的影響[J]. 中國海洋藥物, 2003, 5(95): 9-11. Dong Xiaoli, Geng Meiyu, Guan Huashi. et al. Effects of marine acidic oligose on dopamine release from striatum and amygdala in the rat models of Parkinson’s disease[J]. Chinese Journal of Marine Drugs, 2003, 5(95): 9-11.

[11] 王媛媛, 郭文斌, 王淑芳, 等. 褐藻寡糖的生物活性與應用研究進展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2010, 36(10): 122-126. Wang Yuanyuan, Guo Wenbin, Wang Shufang, et al. Research progress on biological activities and applications of alginate oligosaccharide[J]. Food and Fermentation Industries, 2010, 36(10): 122-126.

[12] 孫麗萍, 薛長湖, 許家超, 等. 褐藻膠寡糖體外清除自由基活性的研究[J]. 中國海洋大學學報, 2005, 35(5): 811-814. Sun Liping, Xue Changhu , Xu Jiachao, et al. A Study of the antioxidant abilities of alginate oligosaccharides[J]. Periodical of Ocean University of China, 2005, 35(5): 811-814.

[13] 周緒霞, 徐鋆, 丁玉庭. 酶解制備褐藻膠寡糖及其產物的抗氧化活性分析[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2014, 40(2): 116-120. Zhou Xuxia, Xu Jun, Ding Yuting. Alginate-derived oligosaccharides product by alginate lyase and detection of the antioxidant activity[J]. Food and Fermentation Industries, 2014, 40(2): 116-120.

[14] Falkeborg M, Cheong L Z, Gianfico C, et al. Alginate oligosaccharides: Enzymatic preparation and antioxidant property evaluation[J]. Food Chemistry, 2014, 164: 185-194.

[15] 楊釗, 張真慶, 管華詩, 等. 一種新的褐藻膠寡糖制備方法—氧化降解法[J]. 海洋科學, 2004, 28(7): 19-22. Yang Zhao, Zhang Zhenqing, Guan Huashi, et al. Oxidation depolymerization-a new method for preparation of alginate oligosaccharides. Marine sciences, 2004, 28(7): 19-22.

[16] 楊小青, 盧虹玉, 李延平, 等. 羊棲菜不同分子質量褐藻多酚抗氧化活性研究[J]. 海洋科學, 2013, 37(4): 47-51. Yang Xiaoqing, Lu Hongyu, Li Yanping, et al. Antioxidative Activities of phlorotannins with different molecular weight extracted from Sargassum fusiforme[J]. Marine Sciences, 2013, 37(4): 47-51.

[17] Zhao X, Li B F, Xue C H, et al. Effect of molecular weight on the antioxidant property of low molecular weight alginate from Laminaria japonica[J]. Journal of Applied Phycology, 2012, 24: 295-300.

[18] 魏丹. 高效降解褐藻膠菌種的選育及其酶學性質的研究[D]. 無錫: 江南大學, 2013: 1-50. Weidan. Isolation of a high efficient alginate-degrading strain and characterization of alginase[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2013: 1-50.

[19] Dou W F, Wei D, Li H, et al. Purification and characterisation of a bifunctional alginate lyase from novel Isoptericola halotolerans CGMCC 5336[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 98: 1476-1482.

[20] 于子森, 孫慶山, 紀全, 等. 海藻酸鈉溶液粘度特性的研究[J]. 科技信息, 2007, 11, 277-278. Yu Zisen, Sun Qingshan, Ji Quan, et al. Study on the viscosity property of sodium alginate[J]. Science Information, 2007, 11, 277-278.

[21] 韋獻雅, 殷麗琴, 鐘成, 等. DPPH法評價抗氧化活性研究進展[J]. 食品科學, 2014, 35(9): 317-322. Wei Xianya, Yin Liqin, Zhong Cheng, et al. Advances in the DPPH radical scavenging assay for antioxidant activity evaluation Food Science, 2014, 35(9): 317-322.

[22] Liu S Y, Liu G Y, Yi Y T. Novel vanadyl complexes of alginate saccharides: Synthesis, characterization, and biological activities[J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 121: 86-91.

[23] 金黎明, 鄭奕, 楊艷, 等. 殼聚糖及其衍生物的抗氧化作用[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(11): 66-68. Jin Liming, Zheng Yi, Yang Yan, et al. Study on antioxidant activity of chitosan and its derivatives[J]. Food and Fermentation Industries, 2008, 34(11): 66-68.

[24] Chen H X, Wang Z S, Qu Z H, et al. Physicochemical characterization and antioxidant activity of a polysaccharide isolated from oolong tea[J]. European Food Research and Technology, 2009, 229, 629-635.

[25] Li X. Solvent effects and improvements in the deoxyribose degradation assay for hydroxyl radical scavenging [J]. Food Chemistry, 2013, 141(3): 2083-2088.

[26] 張蓮. 硫酸軟骨素寡糖的制備及其體外抗氧化活性研究[D]. 無錫: 江南大學, 2012, 1-41. Zhang Lian. Preparation and antioxidant activity in vitro of chondroitin sulfate oligosaccharides[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2012, 1-41.

[27] Kim J K, Srinivasan P, Kim J H, et al. Structural and antioxidant properties of gamma irradiated hyaluronic acid[J]. Food Chemistry, 2008, 109(4): 763-770.

[28] Stern R. Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet?[J]. Glycobiology, 2003, 13(12): 105R-115R.

[29] 黃菊, 丁晨, 謝超, 等. 海藻膠低聚寡糖的酶法制備純化技術及保水理化性質分析[J]. 海洋與湖沼, 2015, 46(3): 595-602. Huang Ju, Ding Chen, Xie Chao, et al. Alginate oligosaccharides: Enzymatic preparation, purification, and the physical and chemical properties[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2015, 46(3): 595-602.

Received:Mar. 15, 2016

Efficient preparation of alginate oligosaccharides by enzymatic hydrolysis and evaluation of antioxidant activities in vitro

ZHANG Ming-jie, LI Heng, JIANG Min, HAO Yao, XU Zheng-hong, SHI Jin-song
(School of Pharmaceutical Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

alginate oligosaccharides; preparation procedure; ethanol precipitation; ultrafiltration; antioxidant activity

Alginate oligosaccharides are characterized by various biological activities. In this study, we developed a technique for the efficient preparation of alginate oligosaccharides by optimizing the process conditions for enzymatic hydrolysis and separation. We evaluated the antioxidant activities of the obtained alginate hydrolysates in vitro. We found the optimized conditions for alginate oligosaccharides preparation to be as follows: a substrate concentration of 1.2%, a ratio of enzyme to substrate dosage of 4.35 U·mg–1, and a hydrolysis time of 4 h. Through successive processes of ethanol precipitation and ultrafiltration, we obtained four constituents with average molecular weights of 0.84, 1.40, 2.25, and 34.56 kDa, respectively. The yields of these four constituents were 50.82%, 5.15%, 11.48%, and 12.00%, respectively. Our in vitro antioxidation study results show that the constituent A (Mw 0.84 kDa) demonstrated the most significant antioxidant activity and the hydroxyl radical scavenging ability was similar to that of vitamin C.

Q539

A

1000-3096(2016)12-0062-09

10.11759/hykx20160315001

(本文編輯: 康亦兼)

2016-03-15;

2016-04-05

國家海洋公益性行業(yè)科研專項(201305007); “十二五”國家科技支撐項目(2012BAD33B06)

[Foundation: Public Science and Technology Research Funds Projects of the Ocean (No. 201305007) ; “twelfth five-year” National Science and Technology Support Program (No. 2012BAD33B06)]

張明杰(1989-), 女, 江蘇宿遷人, 碩士研究生, 研究方向為制藥工程, 電話: 0510-85328177, E-mail: zhangmingjie2013@126.com;史勁松, 通信作者, 主要從事糖工程技術及功能糖產品開發(fā)研究, 電話: 0510-85328177, E-mail: shijs@163.com