綠色熒光蛋白裸小鼠的培育及應(yīng)用進(jìn)展

方　天,　惲?xí)r鋒（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科, 南京 210002）

綠色熒光蛋白裸小鼠的培育及應(yīng)用進(jìn)展

方天,惲?xí)r鋒
（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科, 南京 210002）

綠色熒光蛋白（GFP）裸小鼠最初是為腫瘤研究而培育，是同時(shí)具有T淋巴細(xì)胞缺陷和系統(tǒng)表達(dá)GFP基因的裸小鼠。近20年來，學(xué)者們對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了廣泛而深入的研究，為該小鼠模型的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

綠色熒光蛋白（GFP）； 裸小鼠； 免疫學(xué)特性； 腫瘤模型

自1962年Shimomura 等［1］從水母（Aequorea victoria）中提取綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）以來，GFP幾乎應(yīng)用于各個(gè)科學(xué)領(lǐng)域；GFP廣泛作為報(bào)告基因用于檢測(cè)特殊細(xì)胞中啟動(dòng)子的活性［2］。同時(shí)，GFP能與目的蛋白組成一個(gè)嵌合體用于檢測(cè)蛋白的功能、位置和表達(dá)情況［3］；也經(jīng)常應(yīng)用于基因治療［4］和GFP融合蛋白的定量檢測(cè)［5］。隨著GFP等熒光染料和影像技術(shù)的發(fā)展，體內(nèi)成像取得了巨大進(jìn)步，這使得研究宿主微環(huán)境內(nèi)不同細(xì)胞在細(xì)胞水平和分子水平上的相互作用成為可能［6］。Ikawa等［7］第一次報(bào)道了系統(tǒng)性表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠，GFP轉(zhuǎn)基因小鼠雖然可用于癌癥生物學(xué)特性的研究, 但容易對(duì)接種的癌細(xì)胞或者腫瘤組織出現(xiàn)免疫排斥。為了降低免疫排斥反應(yīng), 研究者致力于將GFP基因?qū)肼阈∈?。?0年, 已有系統(tǒng)性表達(dá)GFP、紅色熒光蛋白（red fluorescent protein, RFP）和青色熒光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）裸小鼠的報(bào)道［8-10］。GFP裸小鼠應(yīng)用廣泛, 特別是在癌癥研究領(lǐng)域； GFP裸小鼠模型幫助解釋間質(zhì)細(xì)胞在癌細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移中的作用［11,12］。另外,由于GFP裸小鼠沒有毛發(fā), 整體成像更具有優(yōu)勢(shì)［13］。

本實(shí)驗(yàn)室于2005年從美國Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)表達(dá)GFP的C57BL/6-Tg（ACTB-EGFP）10sb/J小鼠，與普通BALB/c裸小鼠進(jìn)行雜交繁育，經(jīng)過篩選，選育出GFP裸小鼠，并對(duì)該小鼠進(jìn)行了十多年精心培育和對(duì)生物學(xué)特性的研究探索。本文作者將對(duì)GFP裸小鼠的生物學(xué)特性及其應(yīng)用進(jìn)行綜述，為動(dòng)物模型，特別是腫瘤模型的研究應(yīng)用者，提供有價(jià)值的參考資料。

1　GFP裸小鼠的來源

普通裸小鼠是先天性胸腺缺陷的突變小鼠,目前已成為醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究領(lǐng)域中不可缺少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，特別是在腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥品與生物制品的安全性評(píng)價(jià)及有效藥品的篩選等實(shí)驗(yàn)方面，具有特殊應(yīng)用價(jià)值［14］。目前已將裸基因（nu）導(dǎo)入不同近交系動(dòng)物，成為系列動(dòng)物模型，我國目前所應(yīng)用的自發(fā)性免疫缺陷小鼠，主要是BALB/c遺傳背景的裸小鼠。

本實(shí)驗(yàn)室培育的GFP裸小鼠是將GFP基因?qū)隑ALB/c-nu/nu小鼠而得。具體培育過程：通過（GFP）C57BL/6轉(zhuǎn)基因小鼠與BALB/c裸小鼠進(jìn)行雜交，獲得子一代（F1）代，選取F1代小鼠進(jìn)行自交，產(chǎn)生子二代（F2）代，從F2代中選擇帶綠色熒光的雄性裸小鼠與雌性熒光雜合子，進(jìn)行全同胞交配，獲得的GFP裸小鼠再與BALB/c小鼠進(jìn)行回交，回交后代再自交，產(chǎn)生子三代（F3）代，F(xiàn)3代回交后代再自交，產(chǎn)生子四代（F4）代，如此重復(fù)，直至第十五代（F15）代，便可成功選育出在體內(nèi)能穩(wěn)定表達(dá)GFP的裸小鼠。

2　GFP基因表達(dá)特點(diǎn)

近年來，無胸腺裸小鼠作為動(dòng)物模型，為實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)提供了新的工具［15,16］。而GFP，無需作用底物或共同作用物，在熒光激發(fā)下可以直接發(fā)光, 性質(zhì)穩(wěn)定，已成為細(xì)胞生物學(xué)以及分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記之一［1,17］。1980年, Gordon等［18］用顯微注射方法獲得了2只轉(zhuǎn)基因小鼠。1995年, Ikawa等［7］采用GFP報(bào)告基因，成功建立了GFP轉(zhuǎn)基因小鼠。熒光成像具有操作簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點(diǎn)，在活體動(dòng)物體內(nèi)成像中得到廣泛應(yīng)用［19-21］。而表達(dá)GFP的裸小鼠因自身含有標(biāo)記蛋白與普通裸小鼠相比而具有明顯優(yōu)勢(shì)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有其特殊應(yīng)用價(jià)值。

在熒光顯微鏡下, 本實(shí)驗(yàn)室培育的GFP裸小鼠大部分器官都表達(dá)綠色熒光，包括心臟、肺臟、脾臟、胰腺、食管、胃和十二指腸，其中皮膚、血細(xì)胞、肌肉均表達(dá)綠色熒光［22］。初步研究結(jié)果顯示，該GFP轉(zhuǎn)基因裸小鼠既保留了裸小鼠的生物學(xué)特性，在全身組織器官中又能穩(wěn)定表達(dá)GFP。

本科室尤金煒等［23］進(jìn)一步利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分子技術(shù)檢測(cè)GFP基因在不同日齡的GFP裸小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況，得出結(jié)論：胰腺、心臟、皮膚等主要器官中均檢測(cè)到表達(dá)，其中在胰腺中相對(duì)表達(dá)量最高，其次是心臟、皮膚、全腦和睪丸，而在腸道、肺臟、腎臟、脾臟和肝臟中的相對(duì)表達(dá)量較少。GFP在各種組織中表達(dá)量的差異，為科學(xué)研究中選擇疾病模型及移植供體提供了依據(jù)。

3　GFP裸小鼠生物學(xué)特性

3.1生理生化特點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)中“活的試劑”、“活的精密儀器”，血液學(xué)、生理生化常數(shù)是鑒定其遺傳品質(zhì)的重要依據(jù)［24］。尤金煒等［25］報(bào)道，GFP裸小鼠與對(duì)照組BALB/c裸小鼠比較, 雖然它是在BALB/c裸小鼠的基礎(chǔ)上構(gòu)建成功的，但在生理、生化等指標(biāo)上確實(shí)存在差異，9項(xiàng)生理指標(biāo)有5項(xiàng)差異顯著，其中白細(xì)胞總數(shù)（WBC）、平均血紅蛋濃度（MCHC）差異極顯著；WBC也通常被稱為免疫細(xì)胞，是監(jiān)測(cè)機(jī)體的免疫防御功能，現(xiàn)已成為免疫力低下動(dòng)物模型的重要參考指標(biāo)之一，檢測(cè)結(jié)果顯示兩者雖然差異極顯著, 但是均遠(yuǎn)低于正常小鼠的WBC，這與本文作者方天等［26］報(bào)道結(jié)果一致。12項(xiàng)生化指標(biāo)中除了尿酸（UA）差異顯著，尿素（URE）、葡萄糖（GLU）差異極顯著之外，整體差異性不大。該實(shí)驗(yàn)選擇的GFP裸小鼠與賀曉玉等［27］報(bào)道的GFP小鼠在生理生化數(shù)值上有一定的差異性，但是在與同樣條件對(duì)照組的差異性結(jié)果基本一致。GFP裸小鼠在免疫指標(biāo)WBC、腎功能指標(biāo)URE和UA以及血糖指標(biāo)GLU上與對(duì)照組的差異性十分明顯, 但是影響此結(jié)果的因素是否為外源基因GFP的導(dǎo)入及其發(fā)生機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果還表明, GFP裸小鼠的血液生理、生化指標(biāo)在雌雄性別間均存在差異, 對(duì)照組BALB/c裸小鼠雌雄性別間也存在差異。這種雌雄間的差異性與田小蕓等［28］報(bào)道的轉(zhuǎn)基因小鼠及王冬平等［29］報(bào)道的近交系與遠(yuǎn)交群小鼠所得出結(jié)果一致。但是GFP裸小鼠在雌雄間差異較對(duì)照組更為明顯, 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示, GFP裸小鼠在白蛋白（ALB）、球蛋白（G）、紅細(xì)胞分布寬度（RDW）、平均血紅蛋白含量（MCH）、平均血紅蛋濃度（MCHC）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）等指標(biāo)在雌雄間存在差異。可見品種、性別因素對(duì)血液學(xué)指標(biāo)有一定影響, 因此GFP裸小鼠在實(shí)際應(yīng)用中要考慮雌雄間差異。

3.2免疫學(xué)特性

GFP裸小鼠是在裸小鼠的基礎(chǔ)上培育，故其T細(xì)胞活性大致與裸小鼠相似，一定程度上保持了裸小鼠的免疫學(xué)特性，但外源基因GFP的導(dǎo)入或?qū)е旅庖咛匦愿淖?。脾臟是機(jī)體內(nèi)最大的外周免疫器官［30,31］, 脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)量多少可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的高低［32,33］。本文作者方天等［27］實(shí)驗(yàn)表明，28日齡GFP裸小鼠脾臟指數(shù)明顯高于14日齡、49日齡和70日齡的GFP裸小鼠（P＜0.05），可能是脾臟在14日齡到28日齡生長發(fā)育速度快，而28日齡后則基本停止脾臟個(gè)體發(fā)育。與普通裸小鼠相比，同一日齡GFP裸小鼠脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)較少、淋巴細(xì)胞密度稀疏（P＜0.05）； GFP裸小鼠不同日齡組之間比較結(jié)果，28日齡之后，隨日齡增長，淋巴細(xì)胞數(shù)呈減小趨勢(shì)（P＜0.05）。這從一定程度上說明，GFP裸小鼠與同一日齡普通裸小鼠相比較，免疫功能更為低下； 并且GFP裸小鼠隨日齡增長，免疫功能有下降趨勢(shì)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映外源基因（GFP基因）會(huì)對(duì)脾臟形態(tài)及其功能產(chǎn)生一定的影響。關(guān)于外源導(dǎo)入基因影響GFP裸小鼠脾臟形態(tài)及其功能的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

另外，本科室已有研究人員就GFP裸小鼠的體液免疫以及細(xì)胞免疫例如T細(xì)胞活性及數(shù)量、B細(xì)胞活性以及NK細(xì)胞活性正在進(jìn)行進(jìn)一步的研究與探討。

4　GFP裸小鼠在生物學(xué)研究中應(yīng)用

4.1腫瘤學(xué)中應(yīng)用

GFP裸小鼠在國外的應(yīng)用廣泛，遍布于腫瘤學(xué)、基因?qū)W等多個(gè)生物科學(xué)領(lǐng)域，如RFP標(biāo)記腫瘤細(xì)胞接種到綠色熒光裸小鼠體內(nèi)后, 在熒光顯微鏡或熒光成像系統(tǒng)下可以很清楚區(qū)分動(dòng)物正常組織細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞，能方便地在動(dòng)物活體內(nèi)觀察腫瘤的生長、代謝、轉(zhuǎn)移、凋亡情況［34］, 也能觀察腫瘤動(dòng)物模型在各種治療（藥物、化療、放療、生物治療等）后的恢復(fù)情況［35］。在研究人類腫瘤的發(fā)病機(jī)制、侵襲與轉(zhuǎn)移過程和治療措施中占據(jù)重要地位，而帶熒光標(biāo)記的裸小鼠能更好模擬及觀察腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的微環(huán)境［8］。GFP裸小鼠因無毛發(fā)遮掩，成像更為簡單，有望取代手術(shù)解剖或切割皮膚的方法來觀察腫瘤組織［36］。另外，GFP裸小鼠模型有助于鑒定腫瘤組織中細(xì)胞生物學(xué)特性，也提供了研究腫瘤血管生成中細(xì)胞間融合作用的簡易工具,以GFP/RFP在同一個(gè)多核巨細(xì)胞中出現(xiàn)的示蹤證據(jù)直接證實(shí)：腫瘤細(xì)胞和正常宿主細(xì)胞融合后的細(xì)胞更加具有轉(zhuǎn)移能力、侵襲性、耐藥性、異倍體性以及惡性基因水平轉(zhuǎn)移等［37］。

近年GFP裸小鼠在國內(nèi)腫瘤學(xué)方面的應(yīng)用研究也逐漸增多。綠色熒光裸小鼠的建立和應(yīng)用中，將RFP-A549細(xì)胞皮下接種于GFP轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，結(jié)合分子影像技術(shù)手段，利用雙色熒光成像系統(tǒng)區(qū)分癌細(xì)胞和宿主動(dòng)物［38］。GFP裸小鼠為進(jìn)一步研究癌細(xì)胞和宿主動(dòng)物之間的關(guān)系提供了有力的工具動(dòng)物，是活體熒光影像研究的重要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)“3R”原則。同樣, 代興亮等［39］將轉(zhuǎn)染RFP基因的SU3、U87-MG細(xì)胞和用親脂性的碳青染料染色的c6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，接種于GFP近交系裸小鼠腦內(nèi)，建立RFP/GFP雙色熒光示蹤的腫瘤模型，結(jié)果表明，移植瘤組織重構(gòu)是在侵襲于腦實(shí)質(zhì)、腦室、腦血管的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)或宿主細(xì)胞融合后發(fā)生的。

與普通裸小鼠相比，GFP裸小鼠除了有明顯的活體觀察和體內(nèi)示蹤方便的優(yōu)勢(shì)之外，在成瘤率和腫瘤組織特性方面也有一定優(yōu)勢(shì)。胡文娟等［40］比較GFP裸小鼠結(jié)直腸癌腫瘤模型和普通裸小鼠模型的腫瘤形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性以及病理學(xué)之間的差異，結(jié)果表明，GFP裸小鼠結(jié)直腸癌腫瘤模型的成瘤時(shí)間較短（3～5 d），腫瘤瘤體積較大，且在顯微鏡下，病理切片上觀察到腫瘤細(xì)胞生長活躍，大小較為均勻，部分區(qū)域可見腺腔形成。

4.2其他應(yīng)用

Hu等［41］從GFP裸小鼠體內(nèi)分離培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell, EC）。在體外研究中，檢測(cè)紅細(xì)胞生成素（EPO）對(duì)EC擴(kuò)增和凋亡的影響；在體內(nèi)研究中，誘導(dǎo)普通小鼠制作急性肺損傷模型，隨機(jī)分為兩組，一組靜脈注射從GFP裸小鼠體內(nèi)分離的EC進(jìn)行處理，另一組不進(jìn)行處理作為對(duì)照組，檢測(cè)各組肺臟內(nèi)皮修復(fù)、肺臟毛細(xì)血管通透性、急性肺炎和肺臟血管新生狀況，結(jié)果顯示EPO對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）有明顯的抗凋亡和擴(kuò)增作用，EPC可降低急性肺損傷程度，且與EPO聯(lián)合給藥對(duì)EPC會(huì)有保護(hù)效應(yīng)，EPO對(duì)EPC的作用可能是由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB, 也稱Akt）（PI3K/Akt） 信號(hào)通路介導(dǎo)的。

張俊華等［42］在研究間充質(zhì)干細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓的療效和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的過程中，用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白和弗氏完全佐劑誘導(dǎo)建立小鼠自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型，隨機(jī)分為骨髓間充質(zhì)（MSC）細(xì)胞治療組和EAE組。MSC組尾靜脈注射分離純化GFP裸小鼠MSC細(xì)胞，EAE組尾靜脈注射PBS，采用臨床評(píng)分和脊髓組織切片評(píng)估小鼠的發(fā)病情況，結(jié)果表明，MSC移植對(duì)小鼠EAE療效顯著。

Zhao 等［43］應(yīng)用GFP裸小鼠進(jìn)行細(xì)菌靶向治療腫瘤的體內(nèi)研究。RFP標(biāo)記前列腺癌細(xì)胞PC-3，并于體外將鼠傷寒沙門氏菌感染PC-3細(xì)胞； 再將細(xì)胞接種于GFP裸小鼠，活體成像，研究結(jié)果顯示，腫瘤接種15 d，肝臟、肺臟、脾臟和腎臟中沒有檢測(cè)到鼠傷寒沙門氏菌，但PC-3腫瘤停止生長，并在腫瘤中檢測(cè)到鼠傷寒沙門氏菌，為腫瘤治療提供了另一條有效途徑。Hose等［44］將腎母細(xì)胞瘤基因WT1導(dǎo)入GFP裸小鼠， 揭示W(wǎng)T1在正常造血和患有白血病個(gè)體造血過程中動(dòng)態(tài)調(diào)控規(guī)律，指出白血病造血干細(xì)胞中表達(dá)WT1，而正常造血干細(xì)胞中不表達(dá)WT1，這將會(huì)白血病的一個(gè)特異性靶向治療方向。

5　展望

從GFP裸小鼠的培育到應(yīng)用，已有20年，科研工作者對(duì)其免疫學(xué)特點(diǎn)及其生理生化特征都做了一定的研究。但是，就目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道而言，對(duì)該小鼠體液免疫特性研究較少，對(duì)細(xì)胞免疫研究也不完善，例如T細(xì)胞數(shù)量及功能、B細(xì)胞功能和NK細(xì)胞功能均未有明確報(bào)道，有待進(jìn)一步探討。深入了解GFP裸小鼠的免疫學(xué)特性，有助于擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，從而為生物科學(xué)研究提供新的動(dòng)物模型。另外，GFP/RFP雙色熒光示蹤的腫瘤模型因其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中分別獨(dú)特地示蹤腫瘤細(xì)胞與宿主組織細(xì)胞的雙重關(guān)系，對(duì)研究腫瘤微生態(tài)環(huán)境［45］、腫瘤細(xì)胞社會(huì)成員關(guān)系［46］等目前熱點(diǎn)問題具有重要意義。

本文作者嘗試將GFP裸小鼠應(yīng)用于腫瘤模型雙色示蹤研究，但需要克服諸多難點(diǎn)，如在建立（RFP）標(biāo)記的肺腺癌A549皮下接種GFP裸小鼠的腫瘤模型和花菁染料活體示蹤GFP裸小鼠腫瘤模型的建立和研究中，活體雙色熒光成像時(shí)，需要光譜范圍廣，穿透力強(qiáng)的熒光顯微鏡。利用GFP裸小鼠的組織以及血管都能表達(dá)強(qiáng)烈GFP熒光的優(yōu)勢(shì)，在研究腫瘤組織血管新生的過程中具有重要價(jià)值，但需結(jié)合制作冰凍切片、免疫熒光以及共聚焦成像等一系列等分子研究方法。

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Progress on Development and Application of BALB/c Nude Mouse with GFP

FANG Tian, YUN Shi-feng
（Department of Comparative Medicine， Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command， Nanjing 21002， China）

It reported here that the development and application of the transgenic green fluorescent protein （GFP） nude mouse with ubiquitous GFP expression. BALB/c nude mouse with GFP were bred for cancer research initially, in which were deficient in T lymphocytes. In the last decades, researchers had studied vastly and deeply the biological characteristics and application of BALB/c nude mouse with GFP. The application of GFP nude mouse model should greatly expandedour knowledge inscience research.

Green fluorescent protein （GFP）； Nude mouse； Immunologic characteristics； Tumor models

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0152-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.016

2015-10-09

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院院課題（2013001）

方天（1984-）, 女, 碩士, 技師。E-mail： Fangtianlove@126.com

惲?xí)r鋒（1965-）, 男, 博士, 主任技師, 教授, 碩士研究生導(dǎo)師, 從事醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)工作。E-mail： yunshifeng1@163.com