苔麩總黃酮提取工藝及體外抗氧化活性研究

賈小茜，杜進民

（河北科技大學 生命科學與工程學院，河北 石家莊 050018）

苔麩（Eragrostis tef）是一種具有40 條染色體的四倍體（2n=4x=40）植物，為一年生禾本科畫眉草屬作物，又被稱為埃塞俄比亞畫眉草，原產(chǎn)于埃塞俄比亞，多生長在海拔3 000 m 的高原地帶。在埃塞俄比亞，每年大約有300 公頃的耕地用來種植苔麩，糧草兼用[1-3]。因其對環(huán)境具有良好的適應性，所以在美國、印度和澳大利亞等國家已大面積種植[4-6]。

關于苔麩的最新研究結果顯示，苔麩含有豐富的黃酮類化合物[7-9]，如Shreeya Ravisankar 等通過超高效液相色譜質譜聯(lián)用分析，從苔麩中共鑒定出26種黃酮類化合物[9]。黃酮類化合物具有多種藥理作用和生物活性，如抗腫瘤、保護心腦血管系統(tǒng)和肝臟、延緩衰老抗疲勞、提高免疫力、抗氧化及清除自由基等良好的藥理作用和生物活性，因此，黃酮類化合物已經(jīng)成為近幾年的研究熱點[10-12]。目前國內(nèi)對苔麩相關的研究還較少，以苔麩為原料，研究苔麩總黃酮的優(yōu)化提取工藝，并通過體外試驗初步探索苔麩的抗氧化活性，為進一步深入研究和開發(fā)利用苔麩提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苔麩：購自埃塞俄比亞；蘆?。耗暇W多福尼生物科技有限公司；抗壞血酸：索萊寶生物科技有限公司；過氧化氫：分析純，天津大茂化學試劑廠；氫氧化鈉、氫氧化鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇、過硫酸鉀：分析純，天津永大化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：分析純，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2000 紫外可見分光光度計：尤尼柯上海儀器有限公司；DL-5 低速離心機：上海安亭科學儀器廠；UPR-11-10T 優(yōu)普系列超純水器：四川優(yōu)普超純科技有限公司；GM-0.33II 隔膜真空泵：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JJ200 型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；SpectraMax i3 型酶標儀：Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 苔麩總黃酮含量的測定

1.3.1.1 標準曲線的制備

參考文獻[13-14]，以蘆丁作為標準品，準確稱取干燥至恒重的蘆丁標準品5 mg，用80%乙醇溶解并定容至10 mL，配制成終濃度為0.5 mg/mL 的蘆丁標準品溶液，測定過程如下：

分別取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 蘆丁標準品溶液用80%乙醇補至1 mL，不同濃度的蘆丁標準品溶液加5%NaNO20.5 mL 搖勻靜置6min，加10%Al（OH）30.5 mL 搖勻靜置6 min，再加4%NaOH 4 mL，搖勻靜置10 min，波長510 nm 測定吸光度。

1.3.1.2 樣品總黃酮含量測定

參考文獻[15-18]，準確稱取1.00 g 苔麩粉，按照一定的料液比加入一定體積分數(shù)的乙醇，水浴浸提一定時間，每隔10 min 搖晃均勻，提取后盡快冷卻，4 200 r/min，離心15 mim。取上清按照1.3.1.1中方法測定苔麩總黃酮含量。計算公式如下：

式中：A 為樣品吸光度；V取為測定所取樣品體積，mL；V體為樣品總體積，mL。

1.3.2 單因素試驗

稱取1.00 g 苔麩粉，在其他因素不變的情況下，分別考察乙醇體積分數(shù)（60%、70%、80%、90%）、料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]、提取時間（20、40、60、80、100 min）、提取溫度（40、50、60、65、70、80℃）對苔麩總黃酮提取量的影響。篩選出各個因素影響的最優(yōu)條件。

1.3.3 響應面設計

根據(jù)2.2 單因素試驗結果所示，運用Design-Expert8.0.6 軟件設計四因素三水平Box-Behnken 響應面試驗，分別考察料液比、乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度對苔麩總黃酮提取量的影響并對結果進行分析[19]，因素及水平見表1。

表1 響應面設計因素和水平表Table 1 Response surface design factors and level tables

1.3.4 驗證試驗

根據(jù)響應面最終優(yōu)化的結果，水浴提取苔麩總黃酮，平行3 次試驗，計算苔麩總黃酮提取量，以確定最終的優(yōu)化結果。驗證最優(yōu)工藝可行性。

1.3.5 抗氧化能力測定

1.3.5.1 ABTS＋·清除能力的測定

500μL ABTS 反應液（140 mmol/L 過硫酸鉀 100 mL與 1.76 mL7 mmol/L 混合反應16 h，取 1 mL 定容至50 mL）加入不同體積的樣品，用60 %乙醇補齊至650 μL，反應 6 min，在 734 nm 條件下測定吸光度[20]。

計算公式如下：

式中：A2為試驗組吸光度；A1為空白組吸光度以等體積60%乙醇代替樣品；A3為背景對照組吸光度用等體積去離子水替代ABTS 反應液。

1.3.5.2 羥自由基（·OH）清除能力的測定

100 μL 4 mmol/mL FeSO4加入不同體積樣品（樣品加去離子水補齊至 400 μL） 和 100 μL 4 mmol/mLH2O2，室溫反應 10 min，加入 100 μL 4 mmol/mL 水楊酸 37℃水浴20 min，在510 nm 處測定吸光度[21]。

計算公式如下：

式中：A5為試驗組吸光度；A4為空白組吸光度以等體積60%乙醇代替樣品；A6背景對照組吸光度用等體積無水乙醇代替水楊酸。

2 結果分析

2.1 標準曲線繪制

標準曲線方程為：Y=1.029X+0.002 7；相關系數(shù)R2=0.998 9，標準液的線性范圍為0～0.035 mg/mL，線性關系良好。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數(shù)

固定料液比 1∶10（g/mL），在 60℃條件下水浴浸提60 min，測定乙醇體積分數(shù)對苔麩總黃酮提取量的影響，結果見圖1。

圖1 乙醇體積分數(shù)對苔麩總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on total flavonoids extraction from Eragrostis tef

如圖1所示，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，苔麩總黃酮提取量不斷上升，當乙醇體積分數(shù)增長到70%時，其總黃酮提取量達到最大，隨后，當乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大時，其提取量又降低，這可能是因為隨著乙醇含量的增高，水溶性黃酮溶解度降低。因此，以70%乙醇為最佳提取劑。

2.2.2 料液比

固定乙醇體積分數(shù)70%，在60℃條件下水浴浸提60 min，測定不同料液比對苔麩總黃酮提取量的影響，結果見圖2。

圖2 料液比對苔麩總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction of total flavonoids from Eragrostis tef

如圖2所示，隨著溶劑體積的增加，苔麩總黃酮的提取量不斷上升，當料液比變到 1∶15（g/mL）時，其總黃酮提取量達到最大，隨后，當溶劑體積繼續(xù)增大時，其提取量又出現(xiàn)降低的趨勢。這可能與隨著溶劑體積增多使非黃酮類物質溶解度增大有關。因此，初步選擇料液比 1∶15（g/mL）為優(yōu)。

2.2.3 提取時間

固定料液比 1∶10（g/mL），乙醇體積分數(shù) 70%，在60℃條件下水浴浸提不同的時間，測定不同提取時間對苔麩總黃酮提取量的影響，結果見圖3。

圖3 水浴浸提時間對苔麩總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of water bath extraction time on total flavonoids extraction from Eragrostis tef

如圖3所示，隨著提取時間的增加，苔麩總黃酮提取量不斷上升，當浸提時間為60 min 時，提取量達到最大，當浸提時間繼續(xù)增大時，其提取量基本不變。因此，選取60 min 為最適提取時間。

2.2.4 提取溫度

固定液料比 1∶10（g/mL），乙醇體積分數(shù) 70%，水浴浸提60 min，測定不同提取溫度對苔麩總黃酮提取量的影響，結果見圖4。

圖4 水浴浸提溫度對苔麩總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of water bath extraction temperature on total flavonoids content of Eragrostis tef

如圖4所示，隨著水浴提取溫度的增加，苔麩總黃酮的提取量不斷上升，當水浴溫度增長到65℃時，其總黃酮提取量達到最大，隨后，當水浴溫度繼續(xù)增大時，其提取量又逐漸下降，這可能是因為溫度過高使黃酮被氧化或是加快乙醇的揮發(fā)從而降低黃酮的溶出率。當溫度繼續(xù)升高時提取量又出現(xiàn)略有上升的趨勢，這可能是隨溫度升高，一些非黃酮類物質溶解度上升對測定的干擾增大，同時考慮到經(jīng)濟成本問題，因此，選用65℃為最適提取溫度。

2.3 響應面試驗

2.3.1 響應面試驗設計

通過用Desert-expert8.0.1 軟件設計Box-Behnken響應面優(yōu)化試驗，統(tǒng)計結果如表2所示，得到苔麩總黃酮提取量與乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）之間的二元多項式模型如下：

響應面試驗結果見表2。

模型回歸方程方差分析見表3。

表2 響應面優(yōu)化設計表Table 2 Response surface optimization design table

表3 模型回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

續(xù)表3 模型回歸方程方差分析Continue table 3 Variance analysis of regression equation

通過表3 方差分析可知，其模型P〈0.000 1，說明以響應值顯示的模型為極顯著，方程的相關系數(shù)R2=0.955 6，修正系數(shù)AdjR2=0.911 2，說明該方程模型有較高的可信度。失擬項P=0.117 8〉0.05，為不顯著，說明該二元多項式擬合較好，試驗誤差較小。方差分析結果表示一次項 A、B、D，二次項 A2、B2、C2，交互項 AB均對響應值產(chǎn)生極顯著的影響（P〈0.01）；各試驗因素對苔麩總黃酮提取的影響為D〉A〉B〉C，即提取溫度〉乙醇體積分數(shù)〉料液比〉提取時間。

2.3.2 響應面圖分析及優(yōu)化

響應面和等高線圖見圖5～圖10。

圖5 乙醇體積分數(shù)和料液比之間的交互作用Fig.5 Interaction between ethanol volume fraction and solidliquid ratio

圖6 乙醇體積分數(shù)和提取時間之間的交互作用Fig.6 Interaction between ethanol volume fraction and extraction time

圖7 乙醇體積分數(shù)和提取溫度之間的交互影響Fig.7 Interaction between ethanol volume fraction and extraction temperature

圖8 料液比和提取時間之間的交互作用Fig.8 Interaction between solid-liquid ratio and extraction time

圖9 料液比和提取溫度之間的交互作用Fig.9 Interaction between solid-liquid ratio and extraction temperature

圖10 提取時間和提取溫度之間的交互作用Fig.10 Interaction between extraction time and extraction temperature

根據(jù)模型繪制出乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取溫度兩兩因素之間的等高線和響應面，等高線越接近橢圓說明交互作用越強，響應面越陡峭表面該因素對苔麩總黃酮提取量影響越大，反之曲面越平緩表明其對苔麩總黃酮提取量影響越小，由圖5 顯示乙醇體積分數(shù)和料液比的響應曲面圖陡峭，且等高線呈橢圓形，表明其在因素水平變化范圍以內(nèi)響應值具有最大值，兩因素之間的交互作用顯著，對苔麩總黃酮提取量影響最大，這與表3 分析結果一致。

2.4 驗證性工藝

考慮到實際操作問題，將優(yōu)化結果乙醇體積分數(shù)60.08%，提取時間70.81 min，調(diào)整為乙醇體積分數(shù)60%，料液比 1∶20（g/mL），提取時間 71 min，提取溫度80℃，得到苔麩總黃酮提取量為144.0 mg/10 g，接近于預測值145.42 mg/100 g，說明該工藝可行。

2.5 抗氧化能力測定

2.5.1 ABTS+·清除能力測定

苔麩總黃酮提取物對ABTS+·清除能力見圖11。

圖11 苔麩總黃酮提取物對ABTS+·清除率Fig.11 ABTS+·scavenging rates of total flavonoids extract from Eragrostis tef

如圖11所示，以 25 μL/mLVC為對照，隨著樣品和VC含量的增加，二者對ABTS+·的清除率均呈現(xiàn)逐步增加的趨勢，同時顯示出樣品溶液對ABTS+·的清除率與25 μL/mLVC相當。以接近100%的清除效果來說明苔麩總黃酮具有較好的ABTS+·清除作用。

2.5.2 羥基自由基（·OH）清除能力測定

苔麩總黃酮提取物對羥基自由基（·OH）的清除能力見圖12。

圖12 苔麩總黃酮提取物對羥基自由基（·OH）的清除Fig.12 Hydroxyl radical（·OH）scavenging rates of total falvonoids from Eragrostis tef

如圖12所示，以0.2 mg/mLVC為對照，在樣品和VC量均較低時，二者呈現(xiàn)對·OH 較為接近的清除率，隨著二者含量的增加，清除率逐漸增強，樣品對·OH清除率高于 VC對照組，在 150 μL～200 μL 之間樣品和VC對照對·OH 清除率出現(xiàn)交點，隨后樣品對·OH 清除率低于VC對照組，其原因有待考證。樣品對羥自由基清除率最高達57.78 %以說明苔麩總黃酮具有較好的·OH 清除作用。

3 結論

本試驗通過水浴浸提法提取苔麩總黃酮并對其抗氧化作用進行初步探討。在單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken 響應面優(yōu)化苔麩總黃酮提取工藝。優(yōu)化結果為乙醇體積分數(shù) 60%，料液比 1∶20（g/mL），提取時間71 min，提取溫度80℃，在此條件下苔麩總黃酮提取量為144.0 mg/100 g。苔麩總黃酮提取液對ABTS+·和·OH 的清除作用分別達到99.23%和57.78%，表明苔麩總黃酮提取液具有一定的抗氧化活性。苔麩作為一種新興的全谷物，人們對其關注度越來越高，本試驗為苔麩的探索研究及進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。