卵黃高磷蛋白調控生物礦化的研究進展

介怡琳，陳 嬋，劉晴麗，馬美湖，黃 茜*

（華中農業(yè)大學食品科學技術學院，蛋品加工技術國家地方聯合工程研究中心，湖北 武漢 430070）

卵黃高磷蛋白調控生物礦化的研究進展

介怡琳，陳 嬋，劉晴麗，馬美湖，黃 茜*

（華中農業(yè)大學食品科學技術學院，蛋品加工技術國家地方聯合工程研究中心，湖北 武漢 430070）

近年來研究發(fā)現磷酸化蛋白質在生物礦化過程中起著重要的作用，而卵黃高磷蛋白是目前自然界中磷酸化程度最高的蛋白質之一，已有部分研究證明了卵黃高磷蛋白具有礦化調節(jié)作用，但關于它調控礦化的活性位點及具體機制還不明確。本文概述了生物礦化發(fā)生的環(huán)境、礦化原理、礦化過程及礦化調控等內容，對卵黃高磷蛋白調控生物礦化的相關假說及研究進展進行了探討。

卵黃高磷蛋白；生物礦化；調控機制；雞蛋

近年來，人們已經認識到磷酸化蛋白質（phosphoprotein）在仿生礦化過程中起到很重要的作用［1］，國內外一些科學家研究了骨橋蛋白、牙本質磷蛋白等磷蛋白調節(jié)生物礦化的過程，有望為仿生材料的研究帶來突破。卵黃高磷蛋白（phosvitin，PV）是雞蛋蛋黃中的一種高度磷酸化糖蛋白［2］，其含磷量占蛋黃總磷量的80%，且具有能捕捉金屬離子的特性，在雞胚骨骼發(fā)育中起著重要作用。然而作為一種典型的磷蛋白，其發(fā)揮調節(jié)生物礦化的具體作用機制并沒有得到充分的認識，相關的研究進展比較緩慢。本文綜述了PV調控生物礦化的相關假說及研究進展。

1 生物礦化與磷蛋白

1.1 生物礦化概述

生物礦化是指于生物體不同部位的特定環(huán)境中，在有機基質和細胞等的共同參與下，環(huán)境中無機元素選擇性地在特定有機基質上形核、生長、相變，最終轉變?yōu)楦叨扔行虻纳锏V物的過程［3］。

生物礦化發(fā)生的大環(huán)境是細胞外或細胞內，它提供了礦化所需的特定的溫度、pH值和礦物離子等條件，同時大環(huán)境的空間結構也決定了礦物的尺寸大小及排列組裝［4］。無論是細胞內還是細胞外礦化，生物礦化的精密控制過程都依賴特定的微環(huán)境：由細胞分泌的有機基質按照一定方式自組裝形成的具有特定結構的礦化空間［5］。在此空間中，有機基質自組裝結構通常是作為礦化體系的核心，既提供礦物形核的位點，又作為模板控制晶體的生長和組裝［6］。生物礦化的基本過程包括4 個階段：晶體生長、界面分子的識別、晶體生長的調制、晶體的外延生長與組裝［7］。綜合來看，這4 個階段中同時存在著對成核位點、晶型、晶體生長方向及有序性等方面的控制。另外，有研究表明，礦化的過程往往不是直接從溶液到礦物的一步到位，而是經歷無定形前驅相［8］→晶體中間相→最終礦物的連續(xù)轉變［9］。生物礦化的產物即生物礦物，主要有以下特點：選擇性礦化（即生物體根據其生命活動的功能需求選擇性的進行礦化）、有機-無機復合結構、非熱力學穩(wěn)定相（即生物礦物以熱力學亞穩(wěn)形式存在［10］）、復雜有序的分級結構、良好的物理化學和力學性能。

1.2 生物礦化的調控

生物礦化是在基因、蛋白、基質和細胞等因素的綜合作用和逐級調控下進行的［11］。納米尺度上，基因控制著特定蛋白在特定空間時間中分泌、表達，并組裝形成細胞外基質，繼而啟動蛋白-蛋白和蛋白-晶體等相互作用。中等尺度上，礦化組織的分級組裝由多種細胞代謝活動控制。最終才形成了宏觀尺度上組織結構與功能的高度配合。

在生物礦化中，膠原蛋白［12-13］、高磷蛋白［1］等蛋白質作為有機基質對礦化過程起關鍵調控作用。有研究發(fā)現了這種有機模板在礦化過程中的控制定向形核現象：Mann［14-15］采用Langmuir單層膜的分子有序組合體作生長基底膜，模擬碳酸鈣生物礦化體系，在特定的溶液環(huán)境下探究了溶液成分、pH值、功能團、有序體結構、形態(tài)、膜表面極性頭部的電荷狀況以及脂雙層內外凹凸曲面的化學勢差異等許多因素對晶體形成與生長的影響，并由此提出了“有機-無機界面分子識別”理論。主要方式包括晶格匹配、立體化學互補、極性作用、靜電作用、空間定位、表面形貌等［16］。具體來講，有機基質的調控可以分為化學調控、空間控制、結構控制、形態(tài)控制、構象控制5 種機制［17］。這幾種控制機制并不是單獨作用的，而是相互配合，共同實現對晶體的全面調控。

1.3 生物礦化中磷蛋白的作用

磷蛋白是指一類含有共價結合磷酸根的結合蛋白質。眾所周知，蛋白質的磷酸化作用與細胞內信號傳導、基質排列、蛋白質加工密切相關。近年來研究發(fā)現，磷酸化蛋白質在生物礦化過程中起到很重要的作用［18-22］，逐漸展開了大量的研究。George等［1］在2008年對磷酸化蛋白質及其對礦化過程中晶核形成、晶體生長的促進或抑制作用進行了綜述，其中骨橋蛋白的磷酸化作用使得它對礦化晶體的成核和生長有雙重作用，骨涎蛋白、牙本質磷蛋白、牙本質基質蛋白都能夠促進生物礦化等。磷酸化蛋白質具有參與磷酸鈣晶體沉積和調控生物礦化的功能［23-24］；高度的磷酸化還使其具有參與信號調控和影響破骨細胞分化和骨重吸收的能力［25］，進而調控新骨的發(fā)育和骨創(chuàng)傷的愈合［26］。

Gower等［9］在研究體外膠原礦化時，使用聚天冬氨酸來代替高磷蛋白在膠原礦化中的作用，并且提出了聚合物誘導前驅體相（polymer induced liquid precursor，PILP）機制。Deshpande等［27］使用聚天冬氨酸實現了重構膠原微纖維的礦化。隨后，他們分別使用釉原蛋白［28］、牙本質基質蛋白和牙本質磷蛋白［29］等研究不同高磷蛋白對磷灰石礦物形貌、取向以及膠原礦化的影響。高磷蛋白在礦化中的主要作用包括以下幾點［1］：聚合物捕獲離子，同時抑制晶體成核，這樣導致局部的離子濃度過高，從而誘導無定形相的分離；聚合物能有效穩(wěn)定無定形相，抑制其溶解，并且能使最終晶體維持無定形相的形貌；在液-液相分離過程中，聚合物能增加水化程度，這樣能有效抑制其固化，從而提高其可控性。

PV是雞蛋蛋黃中的糖磷蛋白，占蛋黃干質量的4%［30］，含有10%的磷［2］，一級氨基酸序列顯示PV含有50%的絲氨酸，且近80%的絲氨酸被磷酸化［31］，是目前自然界中發(fā)現的磷酸化程度最高的蛋白質［32］。PV具有與上述磷蛋白非常相似的結構特點，都是水溶性蛋白，其一級結構中含有大量負電性氨基酸［33］，且大量氨基酸被磷酸化，相比這些磷蛋白，PV的磷酸化程度更高［34］，并且也有研究證明PV可誘導形成羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）。所以，從構效關系來說，有明確的證據證明PV對生物礦化有重要作用。

1.4 磷蛋白調控礦化研究的模型

磷蛋白調控生物礦化的實驗模型主要分為體內模型和體外礦化模型兩種［35］。在體外實驗中，磷蛋白對礦物的沉積速率和晶體形貌具有重要影響［36-37］，而在體內實驗中，磷蛋白功能的失調將導致體內受損礦化［38-39］。體內模型主要包括探究與礦化相關的磷蛋白在體內的分布狀況以及基因敲除實驗兩種方法，但磷蛋白如骨橋蛋白在體內分布廣泛，作用不止調控礦化這一種，所以只能給一些很寬泛的關于礦化的認識，并不能給出其具體的作用。另外，基因敲除實驗如基質γ-羧基谷氨酸蛋白（matrix glg protein，MGP）的基因敲除實驗，雖然能說明一定的問題，但基因敲除的小鼠存在除骨骼問題外的多種病患，限制了信息的獲得。所以，更多的還是利用體外模型進行實驗，體外模型有均相模型［40］（礦化溶液中進行礦化實驗）和異相模型［41］（礦化基質上進行礦化實驗）。其中異相實驗體系有：利用瓊脂膠體系進行礦化實驗；利用合成高聚物或肽段模仿非膠原蛋白質進行礦化實驗［42］；用提取的非膠原蛋白質進行礦化實驗［43-44］；利用去礦化組織模型進行礦化實驗［45］；利用小鼠骨骼組織進行骨吸收及骨形成模型等，目前還有部分細胞實驗［46］。這些實驗模型各有特點，分別從不同方面論證磷蛋白的調控礦化作用［47］。

2 卵黃高磷蛋白參與生物礦化推測

2.1 基于生物進化關系和遺傳信息推測卵黃高磷蛋白參與生物礦化

早期Byrne等［48］假設認為PV只存在于脊椎動物中，故基于長期的進化關系提出了磷和Ca2+被PV運輸并作為骨形成的概念。Hiramatsu等［49］將這一概念在文獻中進行了很好的闡述。隨后發(fā)現部分非脊椎物種也含有與脊椎動物大小相當PV區(qū)域［50-51］，從而這一概念受到了挑戰(zhàn)。Huq等［52］表明絲氨酸密碼子使用的模式揭示出基因中與礦化相關的牙本質涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、牙本質基質蛋白（dentin matrix protein，DMP）1、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）均有使用AGT和AGC密碼子編碼多磷酸化絲氨酸的偏好性，PV基因編碼也有這種編碼偏好性，并且這種基因編碼的偏好性與生物礦化密切相關。

2.2 PV為卵生動物骨骼發(fā)育提供磷

骨組織的細胞間質由有機質和無機質構成，有機質由骨細胞分泌產生，約占骨質量的1/3，其中約95%是膠原纖維，其余是無定形基質，即中性或弱酸性的糖胺多糖組成的凝膠。無機質主要是鈣鹽，約占骨質量的2/3，主要成分為羥基磷灰石結晶，是一種不溶性的中性鹽，呈細針狀，沿膠原纖維的長軸排列［53］。由此可見，磷是骨組織的重要組成元素。對卵生動物而言，骨骼在礦化過程中所需的大量磷必然由卵中含磷物質提供。以雞蛋為例，PV是蛋黃中的主要磷蛋白，占蛋黃干質量的2%，含磷9.7%，占蛋黃總磷量的80%。雞胚胎發(fā)育過程中的幾乎全部營養(yǎng)物質都由雞蛋提供，因此不難推斷，組成雞胚骨骼的重要礦物羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）中的磷大部分由PV提供，所以有理由認為PV在生物礦化中起著重要作用。

Finn等［54］發(fā)現PV在浮游產卵硬骨魚類中表達，隨后在卵母細胞成熟過程中去磷酸化，釋放磷調節(jié)卵母細胞的滲透壓。Moran等［55］稱PV有可能在胚胎發(fā)育過程中通過釋放磷結合鈣而提供連續(xù)的骨礦化。Finn［56］也提出假設認為PV可能參與骨骼的形成。李春艷［34］研究了雞胚胎發(fā)育過程中PV的變化，證實了PV與雞胚骨骼發(fā)育密切相關，并且是通過脫磷酸化提供雞胚骨骼形成需要的磷。

2.3 PV替代VC促進膠原合成與骨礦化

研究表明VC在膠原合成及維持其穩(wěn)定性、新陳代謝、免疫力方面有重要作用，但吃驚的是許多物種喪失了合成VC的能力，故而只能從外界攝取VC以維持自身的需要，研究顯示生物體缺乏合成VC的原因是因為進化壓力導致的催化VC合成所需的最后一步的古洛糖酸內酯氧化酶（L-gulono-γ-lactone oxidase，GLO）基因的喪失。在礦化誘導過程中VC作為抗氧化劑/還原劑，是合成膠原的必需物質，從而進一步形成和維持結締組織、器官和骨骼系統(tǒng)［57］?？茖W家進一步研究發(fā)現，一些需要進行體外胚胎發(fā)育的物種可以在VC缺失的情況下很好地進行組織骨骼連接，究其原因，是由于這些物種都含有PV，并且PV像VC一樣具有強烈的抗氧化性，可以促進膠原合成并維持其穩(wěn)定性，于是部分科學家將目光鎖定在PV上，并開展了一系列研究。他們假設PV能在VC缺失的情況下促進膠原形成，骨骼發(fā)育。Jess等［58］于2013年基于這個假設設計了一系列實驗（基于小鼠顱骨去礦化組織的再礦化模型），有力地證明了PV在體外骨組織礦化過程中的生物作用。

2.4 生物信息學分析推測PV可能具有調控生物礦化的功能

張曉維［59］利用生物質譜技術結合生物信息學預測分析表明PV含有87 個磷酸化位點（83 個磷酸絲氨酸和4 個磷酸蘇氨酸）。利用生物信息學分析9 個物種來源的11 種PV以及來源于人體的5 種磷酸化蛋白質，進行氨基酸組成、多序列比對和進化樹分析，顯示均含有高絲氨酸，且富含酸性氨基酸。氨基酸組成上的特點決定了這些蛋白質在結構和功能上的相似性，如高級結構均為高度靈活的無規(guī)卷曲結構；均具有結合多價金屬離子的能力［60］；均有使用AGC和AGT密碼子編碼多磷酸化絲氨酸的偏好性［52］；磷酸化位點不均一性。分析發(fā)現雞的PV與牙本質磷蛋白的結構及特性相似，進化關系較近，意味著PV可能具有與牙本質磷蛋白相似的生物功能，即在生物礦化過程中發(fā)揮重要的調控作用。

3 PV調控生物礦化研究

3.1 PV調控礦化的體外研究

大量的體外研究表明PV具有調控礦化的作用，許多體外研究是基于將PV吸附或共價結合到某種基質上的模型開展研究的。Linde等［61］將PV共價交聯固定在瓊脂糖珠上，置于礦化溶液中培養(yǎng)，表明PV可以誘導礦化物的形成，而去磷酸化后的PV誘導效果明顯減弱。Saito等［62］研究發(fā)現當PV吸附到膠原蛋白上時，置于礦化液中后會從膠原蛋白上解析下來，且不能誘導礦物形成；而當PV共價交聯到膠原蛋白上時，會誘導磷灰石沉積于膠原蛋白表面，且去磷酸化后誘導礦物形成所需時間大大延長，表明PV的磷酸基團在礦化中起到重要作用。Kobayashi等［63］也做了類似的實驗，同樣發(fā)現PV可以促進磷灰石的形成。Onuma等［64］發(fā)現當PV處于游離態(tài)時抑制無定型磷酸鈣轉化為羥基磷灰石，而當PV固定在膠原蛋白上時，HA不是直接由無定型磷酸鈣（amorphous calcium phosphate，ACP）內部重建形成，而是在ACP上異相成核得到。Abdelkebir等［65］也有相關研究表明PV可以促進礦化。Abdelkebir等［65］采用仿生膜礦化體系，研究了羧酸鹽、硫酸鹽和磷酸化蛋白質對礦化的調控作用，其中，以PV為代表的磷蛋白促進礦化的效果最好。Ito等［66］將PV用二乙烯砜固定在瓊脂糖珠上，發(fā)現PV可以顯著促進礦化，并指出其可能有助于促進軟化的牙本質再礦化。William等［67］還利用二氧化硅納米粒子上的磷酸鈣仿生礦化模型研究了PV在不同pH值條件下的表面電荷等生化特性對礦化的影響，對骨組織工程生物醫(yī)學材料的應用有相應的借鑒意義。

PV強大的鈣結合能力與它的礦化作用密切相關，許多體外實驗研究了PV與鈣離子的相互作用。PV的磷酸絲氨酸區(qū)域是負電荷的高度聚集區(qū)，提供了鈣離子和鐵離子等金屬離子的螯合區(qū)域［68］。Osaki等［69］研究發(fā)現PV與鈣在pH 6.5時，每摩爾PV可以結合160 mol鈣離子。Belhomme等［70］研究發(fā)現，在氣-水界面中，磷酸絲氨酸殘基之間形成分子間磷酸鈣橋可以形成PV-Ca聚集物，并進一步在PV分子之間構成橫向交互的巨型網絡。張曉維［59］利用鈣離子濃度計、等溫滴定量熱儀、圓二色譜和熒光光譜方法，分別從化學、熱力學以及結構信息方面，較為全面地研究了PV與鈣離子的相互作用，表明PV與鈣離子存在多位點相互作用，在不同環(huán)境下作用方式不一樣。PV磷酸肽也具有很強的螯合礦物離子的能力和促進鈣吸收的能力［71-73］。Choi等［71］證實了PV磷酸肽能提高鈣的生物利用度及鈣在骨骼中的聚集。

最新的研究表明磷酸化是生物礦化的關鍵［74-75］。Salih［76］和Gericke［77］等都有研究發(fā)現磷蛋白的磷酸化程度對其參與礦化調控具有極為重要的作用。磷蛋白的磷酸化程度還可以調控其與HAP的相互作用，進而對HAP的成核和生長產生不同的影響［1］。Zhang Xiaowei等［78］系統(tǒng)研究了仿生礦化體系中PV對磷酸鈣礦物晶相轉化的影響。體外均相礦化溶液礦化實驗表明PV促進磷酸鈣礦物形成是一個動態(tài)過程，即在起始階段參與到礦化反應中，礦物形成后，PV又從晶體中緩慢釋放出來。張曉維［59］進一步將PV酶解處理，研究了磷酸化程度、特征肽段組成及大小等結構對其誘導礦化的影響，尋找其誘導礦化的作用位點，揭示其誘導礦化的構效關系，發(fā)現磷酸化在礦化反應中起到很重要的作用，經質譜鑒定可知促進礦化的活性區(qū)域為D1165R1258，即PV核心的磷酸化絲氨酸簇區(qū)域。

3.2 PV調控礦化的細胞學研究

結合細胞學進行體外細胞實驗，利用骨形成、骨吸收中的一系列生化指標（堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）、相關基因mRAN測定、相關蛋白測定、鈣釋放與攝取功能、骨吸收坑、礦化結節(jié)形成等）研究PV對礦化的影響也是一個重要手段［79-80］。李春艷［34］研究了PV對雞胚胎骨骼發(fā)育的影響，結合體內外實驗初探其機制。通過比較分析孵化期間PV磷酸根含量、二級結構、雞胚腔骨ALP活力、體長增長率這些指標的變化，發(fā)現了PV通過脫磷酸化提供雞胚骨骼形成需要的磷。隨后采用細胞實驗建立模型初探了PV促進MC3T3-E1細胞礦化的可能機制，推測在誘導礦化的過程中PV替代了VC的作用，作為強抗氧化劑/還原劑參與合成膠原，進而促進成骨活動，PV通過上調I型膠原蛋白Col-I mRNA和骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）mRNA的表達，促使其下游產物ALP表達水平增加，進而誘導礦化活動增強。但是PV對成骨細胞影響詳細的細胞學和分子學機制仍需進一步研究確定。Jess［58］基于小鼠顱骨去礦化組織的再礦化模型設計了一系列實驗，分別模擬成骨過程和破骨過程，有力地證明了PV在體外骨組織礦化過程中的生物作用，即促進成骨過程，抑制破骨過程。

3.3 PV調控礦化的其他研究

以上體系都是PV對磷酸鈣礦化體系的調控，Fan Jiadong等［81］最近研究了PV對碳酸鈣礦化體系的調控作用，研究PV對碳酸鈣結晶納米結構的影響，動力學實驗表明PV抑制高濃度過飽和溶液納米晶體的組裝而促進低濃度過飽和溶液中定向納米晶的組裝。Khalil等［82］將PV固定在層層自組裝（layer-by-layer self-assembly，LBL）涂料上，制成LBL仿生架構研究PV對碳酸鈣晶體礦化的影響。結果也證實PV促進碳酸鈣的結晶礦化?？傊?，PV對生物礦化的調控作用的研究涉及基因、分子、細胞層次，包括體內體外模型，相關研究分別從不同方面論證了PV的礦化調控作用。

4 結 語

目前雖然對PV調控礦化的能力進行了許多研究，但其活性位點及具體的礦化機制尚未明確。應進一步分離制備高純度的PV，對其結構進行表征，鑒定其磷酸化位點。作為生物活性大分子，還需要進一步從細胞分子水平以及體內實驗進行研究和驗證。同時，作為潛在的仿生礦化材料，還需開展其應用研究，如生物相容性、材料硬度等。研究PV在礦化中的作用成為一個重要方向，尋找其誘導礦化的活性位點，揭示其誘導礦化的構效關系，為繼續(xù)闡明PV在雞胚骨骼發(fā)育中的生物學作用［83-84］，同時也為利用PV誘導生物礦化、合成仿生骨骼材料等應用研究提供相應的理論基礎。

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Research Progress on Phosvitin in the Regulation of Biomineralization

JIE Yilin， CHEN Chan， LIU Qingli， MA Meihu， HUANG Xi*
（National & Local Joint Engineering Research Center for Egg Processing Technology， College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Recent studies have found that phosphoprotein plays a very important role in biomineralization， and phosvitins possess the highest phosphorylation level among all known proteins in eggs. Phosvitin was speculated to possess regulatory effects on biological mineralization according to some previous studies， but the mechanism and active sites for regulation of mineralization are still unclear. This paper gives a brief overview of where， how and why biomineralization occurs and the way biomineralization is regulated. Recent hypotheses regarding the regulation of biomineralization by phosvitin are also discussed.

phosvitin； biomineralization； regulation mechanism； egg

10.7506/spkx1002-6630-201609041

Q512

A

1002-6630（2016）09-0220-07

介怡琳， 陳嬋， 劉晴麗， 等. 卵黃高磷蛋白調控生物礦化的研究進展［J］. 食品科學， 2016， 37（9）： 220-226. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201609041. http：//www.spkx.net.cn

JIE Yilin， CHEN Chan， LIU Qingli， et al. Research progress on phosvitin in the regulation of biomineralization［J］. Food Science，2016， 37（9）： 220-226. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609041. http：//www.spkx.net.cn

2015-09-07

國家自然科學基金面上項目（31471602）；公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201303084）

介怡琳（1990—），女，碩士研究生，研究方向為蛋品科學與技術。E-mail：1562167354@qq.com

*通信作者：黃茜（1984—），女，副教授，博士，研究方向為畜產食品科學與技術。E-mail：huangxi@mail.hzau.edu.cn