PCR技術(shù)在食源性微生物檢測(cè)中的應(yīng)用與發(fā)展研究

孫吉浩

（寧波市北侖區(qū)疾病預(yù)防與控制中心，浙江寧波315000）

PCR技術(shù)在食源性微生物檢測(cè)中的應(yīng)用與發(fā)展研究

孫吉浩

（寧波市北侖區(qū)疾病預(yù)防與控制中心，浙江寧波315000）

食源性微生物檢測(cè)技術(shù)在引入聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)后得以迅速發(fā)展，經(jīng)歷了常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)、多重PCR檢測(cè)技術(shù)、熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)等3個(gè)變化階段。本文基于PCR技術(shù)的發(fā)展階段和現(xiàn)狀，闡述常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)、多重PCR檢測(cè)技術(shù)、熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)3種檢測(cè)技術(shù)的原理，并對(duì)3種PCR技術(shù)在食源性微生物檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)分析，提出將PCR技術(shù)應(yīng)用于食源性微生物檢測(cè)存在的問(wèn)題及展望。

PCR技術(shù)；食源性微生物檢測(cè)；應(yīng)用；發(fā)展

食品安全事關(guān)生命健康和社會(huì)穩(wěn)定。維護(hù)食品安全，對(duì)食品安全進(jìn)行有效快速的監(jiān)測(cè)是檢疫機(jī)構(gòu)的重要責(zé)任和主要工作。食源性致病微生物是導(dǎo)致食品安全風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)主要來(lái)源，對(duì)于食源性致病微生物的控制近年來(lái)日益受到關(guān)注。食源性致病微生物的檢測(cè)方法一直在革新推進(jìn)，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在周期冗長(zhǎng)、繁瑣復(fù)雜的缺點(diǎn)，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)克服了這些缺點(diǎn)，具有快速、簡(jiǎn)潔等優(yōu)點(diǎn)，因此受到專(zhuān)家學(xué)者的青睞。

食源性微生物檢測(cè)技術(shù)在引入PCR技術(shù)后得以迅速發(fā)展，經(jīng)歷了以下的變更過(guò)程：常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)、多重PCR檢測(cè)技術(shù)、熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)等3個(gè)變化階段，每一階段的技術(shù)革新都產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)性的突破[1]。本文基于PCR技術(shù)的發(fā)展階段和現(xiàn)狀，闡述常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)、多重PCR檢測(cè)技術(shù)、熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)3種檢測(cè)技術(shù)的原理，對(duì)3種PCR技術(shù)在食源性微生物檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)分析，最后提出將PCR技術(shù)應(yīng)用于食源性微生物檢測(cè)存在的問(wèn)題，并對(duì)其進(jìn)行展望。

1 PCR技術(shù)在食源性微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

1.1 PCR技術(shù)的原理與發(fā)展綜述

PCR檢測(cè)技術(shù)根據(jù)發(fā)展情況主要可以分為三類(lèi)：常規(guī)PCR檢測(cè)、多重PCR檢測(cè)、熒光定量PCR檢測(cè)。3種檢測(cè)技術(shù)的原理存在一定差異，應(yīng)用時(shí)所用到的特點(diǎn)也各不一樣，導(dǎo)致PCR檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用性能具有一定的差異化。下面將結(jié)合3種檢測(cè)技術(shù)各自的原理對(duì)其予以解析。

1.1.1 常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)

常規(guī)PCR檢測(cè)又稱(chēng)為傳統(tǒng)PCR檢測(cè)技術(shù)，其主要原理是：以熱穩(wěn)定DNA聚合酶作為催化劑，以引物、DNA模板、dNTP、適當(dāng)緩沖液與MgCl2溶液作為反應(yīng)混合物，對(duì)1對(duì)寡核苷酸引物所界定的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增[2]。常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)可以衍生出多重PCR技術(shù)及熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)。

1.1.2 多重PCR檢測(cè)技術(shù)

多重PCR的檢測(cè)原理與傳統(tǒng)PCR基本類(lèi)似，其區(qū)別在于：如果存在與各引物對(duì)特異性互補(bǔ)的模板，只不過(guò)是在同一反應(yīng)體系中加入1對(duì)以上的特異性引物，那么就可以同時(shí)在同一個(gè)反應(yīng)管中擴(kuò)增出1條以上的目的DNA片段。使用這一方法可以同時(shí)檢測(cè)1個(gè)以上目的基因或者借助其交叉限制進(jìn)行確認(rèn)。

多重PCR檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn)包括高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性[3]。多重PCR檢測(cè)技術(shù)執(zhí)行快速，具有完備的檢疫系統(tǒng)，花費(fèi)成本低，操作簡(jiǎn)易，可以作為食源性微生物檢測(cè)較為理想的檢測(cè)技術(shù)。

1.1.3 熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)

熒光定量PCR是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。熒光定量的主要原理是利用傳統(tǒng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀應(yīng)用熒光能量傳遞技術(shù)，通過(guò)某種化學(xué)相互作用（主要是受體發(fā)色團(tuán)之間偶極-偶極相互作用）來(lái)產(chǎn)生效果。靶序列初始濃度從檢測(cè)PCR的過(guò)程得知，能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán)，受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號(hào)強(qiáng)度與DNA產(chǎn)量成正比，從而達(dá)到定量目的。相較于常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)、多重PCR檢測(cè)技術(shù)，熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的化學(xué)原理有了一定程度的創(chuàng)新和改進(jìn)。

熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)通過(guò)電腦軟件實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線檢測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程，進(jìn)而得到最終檢測(cè)結(jié)果，而無(wú)需再次檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，從而避免了污染。因此，熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)具有環(huán)保、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。另外，熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)還可以實(shí)現(xiàn)“一管多檢”。這些不可替代的優(yōu)點(diǎn)和性能使得熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)在食源性微生物檢測(cè)中具有舉足輕重的地位，并成為具有創(chuàng)新性的一種檢測(cè)手段。

1.2 PCR技術(shù)在食源性微生物檢測(cè)中的應(yīng)用分析

PCR技術(shù)在食源性微生物的檢測(cè)中具有重要的作用，隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，食源性微生物的檢測(cè)也不斷取得新的進(jìn)展，常規(guī)PCR檢測(cè)、多重PCR檢測(cè)、熒光定量PCR檢測(cè)3種檢測(cè)技術(shù)在食源性微生物的檢測(cè)中具有不同的作用和功能?，F(xiàn)將結(jié)合3種技術(shù)的原理分別介紹其應(yīng)用。

1.2.1 常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)在食源性微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

PCR技術(shù)最早被應(yīng)用于分子生物學(xué)研究與醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，并發(fā)揮了重要作用。20世紀(jì)80年代中期開(kāi)始，PCR技術(shù)被逐漸應(yīng)用于食品微生物的研究與檢測(cè)。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了“在生物體外對(duì)特定核酸片段的擴(kuò)增”的功能。傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)循環(huán)包括以下3個(gè)過(guò)程：1）高溫下雙鏈DNA分子的變性；2）對(duì)人工合成的引物在特定溫度下與變性的單鏈DNA退火；3）堿基在DNA聚合酶的作用下以靶序列為模版延伸。在經(jīng)歷反復(fù)循環(huán)之后，即可獲得呈指數(shù)增長(zhǎng)的特定DNA序列片段拷貝。特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物可以經(jīng)由DNA熒光染料處理，通過(guò)凝膠電泳等方法進(jìn)行觀察。PCR檢測(cè)方法中，DNA樣品的準(zhǔn)備、PCR反應(yīng)、反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定可在前增菌后的1d內(nèi)完成，而傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢驗(yàn)方法大概需要消耗4～10d的檢驗(yàn)時(shí)間，多管發(fā)酵、梯度增菌以及選擇性培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)接等操作過(guò)程繁冗，相較之下，PCR法有著明顯的快速優(yōu)勢(shì)。PCR反應(yīng)對(duì)于特異性目的片段的擴(kuò)增相比于選擇性培養(yǎng)、單克隆挑選等方法，產(chǎn)生假陽(yáng)性的概率降低，檢測(cè)的準(zhǔn)確性強(qiáng)。在靈敏度方面，大多數(shù)PCR體系對(duì)于食源性微生物的檢出限可以達(dá)到10～104CFU/mL，而傳統(tǒng)微生物學(xué)的檢出限約為104CFU/mL。多方面的優(yōu)點(diǎn)使PCR技術(shù)迅速被諸多的食源性微生物研究所采用，到20世紀(jì)90年代中期，包括空腸彎曲桿菌、大腸菌群、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、沙門(mén)氏菌屬等多種常見(jiàn)食源性微生物的PCR檢測(cè)方法已得到初步建立和發(fā)表。在研究應(yīng)用過(guò)程中，PCR檢測(cè)的一些缺點(diǎn)和局限性也得以體現(xiàn)并受到關(guān)注。一方面，PCR產(chǎn)物中的陽(yáng)性結(jié)果是通過(guò)擴(kuò)增條帶的大小來(lái)判斷，而引物設(shè)計(jì)的缺陷有可能會(huì)導(dǎo)致非特異性條帶的產(chǎn)生，對(duì)結(jié)果判斷產(chǎn)生干擾甚至產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果；另一方面，食品中存在的某些成分如鈣、鎂離子螯合劑、DNA酶或DNA聚合酶抑制物等可能對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，使檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)假陰性。此外，普通PCR技術(shù)本身無(wú)法區(qū)分食源性微生物是否為活體。

1.2.2 多重PCR檢測(cè)技術(shù)在食源性微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

近年來(lái)，許多與致病相關(guān)的基因在對(duì)食品病原細(xì)菌致病機(jī)理的研究中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，這些基因絕大部分都是該菌所特有的。根據(jù)這些特異性的基因設(shè)計(jì)合適的引物，擴(kuò)增其高度保守區(qū)成為了應(yīng)用多重PCR方法檢測(cè)食品病原細(xì)菌的關(guān)鍵[4]。目前，在食品病原細(xì)菌檢測(cè)中對(duì)于多重PCR技術(shù)的應(yīng)用主要包括2個(gè)方面：?jiǎn)我徊≡?xì)菌的檢測(cè)和多種病原細(xì)菌的同時(shí)檢測(cè)。

對(duì)如沙門(mén)氏菌、致病性大腸桿菌這類(lèi)血清型較復(fù)雜的病原細(xì)菌，常規(guī)的單一PCR檢測(cè)由于其特異性差，具有一定的局限性因而容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。若想提高特異性，減少假陽(yáng)性，就需要再多重PCR選擇目的病原細(xì)菌多個(gè)高度保守的基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。

若想快速實(shí)現(xiàn)多種病原細(xì)菌的同時(shí)檢測(cè)和分析，可以在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加入多種病原細(xì)菌的特異性引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。目前大多數(shù)病原菌對(duì)人感染劑量很低，1～10CFU的菌體細(xì)胞就足以對(duì)人致病。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)在食源性微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)主要靠形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)和血清學(xué)凝集等實(shí)驗(yàn)手段，檢測(cè)周期長(zhǎng)，操作繁瑣，易受主觀判斷影響，在一定程度上會(huì)造成漏檢。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)作為近幾年興起的一種核酸定量分子生物學(xué)檢測(cè)新技術(shù)，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測(cè)手段中的不足。實(shí)驗(yàn)研究表明，實(shí)時(shí)熒光PCR法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：操作便捷，節(jié)省時(shí)間，特異性強(qiáng)，較為靈敏。

由于PCR技術(shù)主要針對(duì)生物因子核酸片段，檢測(cè)結(jié)果不能判斷病原菌的死活狀態(tài)，也得不到可以進(jìn)行活體保存的病原體，從而無(wú)法確定檢測(cè)到的核酸片段是否來(lái)源于具有生物學(xué)活性和感染力的病原菌，對(duì)于證實(shí)感染食源性致病微生物引發(fā)食源性疾病不能直接舉證。因此，檢驗(yàn)結(jié)果有時(shí)不能作為公共衛(wèi)生突發(fā)事件的病原學(xué)診斷依據(jù)。鑒于上述情況，建議在實(shí)際工作中不妨將實(shí)時(shí)熒光PCR法和傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法結(jié)合起來(lái)使用，以便優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。將熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于食源性致病微生物的檢測(cè)是一種理想的檢測(cè)方法，有著很好的應(yīng)用前景和研究?jī)r(jià)值。

1.3 將PCR技術(shù)應(yīng)用于食源性微生物檢測(cè)存在的問(wèn)題及展望

食源性微生物的檢測(cè)仍然是一門(mén)很關(guān)鍵的食品安全檢疫技術(shù)，對(duì)于維護(hù)人民生命健康、社會(huì)穩(wěn)定具有重要的決定作用。如何利用新技術(shù)、新手段盡量消除或減少由于人為因素引起的誤差，提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀性，同時(shí)達(dá)到良好的檢測(cè)效果，依然是食源性微生物監(jiān)測(cè)工作中的一個(gè)重要課題。

1.3.1 PCR技術(shù)應(yīng)用于食源性微生物檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

PCR檢測(cè)技術(shù)目前已經(jīng)在國(guó)際上獲得廣泛的認(rèn)可，在很大程度上可消除或減少生化鑒定和血清學(xué)試驗(yàn)，許多步驟依靠操作者的主觀判斷等主觀因素造成誤差，并且具有節(jié)約時(shí)間、簡(jiǎn)化工作量的優(yōu)點(diǎn)，有益于在今后致病微生物檢測(cè)中使用。

1.3.2 3種檢測(cè)技術(shù)各自的優(yōu)劣綜述

1.3.2.1 常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)

常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)的一些缺點(diǎn)和局限性越來(lái)越受到人們的關(guān)注。第一，PCR產(chǎn)物對(duì)結(jié)果判斷產(chǎn)生干擾甚至產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果；第二，食品中存在的某些成分可能對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，使檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)假陰性；第三，普通PCR技術(shù)本身無(wú)法區(qū)分食源性微生物是否為活體，因此經(jīng)過(guò)滅菌后的食品中殘存的DNA物質(zhì)仍有可能被擴(kuò)增產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[5]。

1.3.2.2 多重PCR檢測(cè)技術(shù)

多重PCR檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn)包括高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性。多重PCR檢測(cè)技術(shù)執(zhí)行快速，具有完備的檢疫系統(tǒng)，花費(fèi)成本低，操作簡(jiǎn)易，可以作為食源性微生物檢測(cè)較為理想的檢測(cè)技術(shù)。多重PCR檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中也存在不少問(wèn)題，污染問(wèn)題就是其中之一。一旦有極少量外源性DNA污染,就可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增，各種實(shí)驗(yàn)條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或非特異性產(chǎn)物；引物的設(shè)計(jì)及靶序列的選擇不當(dāng)?shù)榷伎赡芙档推潇`敏度和特異性。

1.3.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)

多重PCR檢測(cè)技術(shù)在對(duì)食品樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，增菌培養(yǎng)基選擇不當(dāng)易使有的細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢或被抑制，導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)可以避免以上問(wèn)題的產(chǎn)生，熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)具有環(huán)保、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。另外，熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)還可以實(shí)現(xiàn)“一管多檢”[6]。這些不可替代的優(yōu)點(diǎn)和性能使得熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)在食源性微生物檢測(cè)中具有舉足輕重的地位，而成為具有創(chuàng)新性的一種檢測(cè)手段。

1.3.3 PCR檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展新方向

PCR檢測(cè)技術(shù)今后的發(fā)展方向主要集中在以下幾個(gè)方面：1）不斷增加反應(yīng)體系中引物對(duì)的數(shù)量，提高一次擴(kuò)增反應(yīng)所能檢測(cè)的范圍；2）優(yōu)化反應(yīng)條件，提高擴(kuò)增效率；3）研究篩選能同時(shí)富集多種病原細(xì)菌的培養(yǎng)基；4）與其他技術(shù)結(jié)合，如熒光PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR，提高檢測(cè)敏感性和特異性，縮短檢測(cè)時(shí)間。

2 結(jié)語(yǔ)

食品安全事關(guān)生命健康和社會(huì)穩(wěn)定，維護(hù)食品安全，對(duì)食品安全進(jìn)行有效快速的監(jiān)測(cè)是檢疫機(jī)構(gòu)的重要責(zé)任和主要工作。食源性致病微生物是導(dǎo)致食品安全風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)主要來(lái)源，對(duì)于食源性致病微生物的控制近年來(lái)日益受到關(guān)注。食源性微生物檢測(cè)技術(shù)在引入PCR技術(shù)后得以迅速發(fā)展，經(jīng)歷了以下的變更過(guò)程：常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)、多重PCR檢測(cè)技術(shù)、熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)等3個(gè)變化階段，每一階段的技術(shù)革新都產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)性的突破。本文的研究和展望基于當(dāng)前食源性微生物的檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀，希望可以對(duì)PCR技術(shù)應(yīng)用于食源性微生物的情況具有一定的借鑒和參考價(jià)值。

[1]方平.PCR技術(shù)在食源性致病微生物快速檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)食品工業(yè),2006,21(11):44-46.

[2]張然,董海強(qiáng),張廷文.食源性微生物PCR檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展及標(biāo)準(zhǔn)化討論[J].山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,24(4):8-12.

[3]楊衛(wèi)軍,張小軍,張坤朋,等.PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J].安陽(yáng)工學(xué)院學(xué)報(bào),2008,7(4):16-18.

[4]胡金強(qiáng),雷俊婷,詹麗娟,等.免疫學(xué)技術(shù)在食源性微生物檢測(cè)中的應(yīng)用綜述[J].鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014,15(3):7-11.

[5]鄧紫筠.多重PCR檢測(cè)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)世界,2013,7(1):69-70.

[6]左慧彬.食源性致病微生物PCR檢測(cè)策略的建立和優(yōu)化[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2015.

Application and Development of PCR in the Detection of Food-borne Microorganism

Sun Ji-hao
(Ningbo Beilun District Center for Disease Control and Prevention, Zhejiang Ningbo 315000)

Foodborne microbial detection technology develop rapidly after the introduction of PCR technology, through the following change process: the three stages of change conventional PCR detection technology, multiplex PCR, quantitative PCR technology, every stage of the technology innovations have had a substantial breakthrough. Based on the development stage of PCR technology and the status quo, this paper described conventional PCR detection technology, the principle of multiplex PCR, quantitative PCR technique three detection technology, the three PCR technique in the detection of food-borne microbes were detailed analyzed, the problems and prospects of PCR technology for detecting the presence of food-borne microbes were putted forward.

PCR technique; Foodborne microbial detection; Applications; Development

TS207.5

A

2096-0387（2016）02-0056-03

孫吉浩（1987-），男，浙江寧波人，助理工程師，研究方向：PCR技術(shù)。