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    上海地區(qū)健康豬群中副豬嗜血桿菌的分離鑒定

    2019-02-16 06:49:40沈莉萍
    中國豬業(yè) 2019年1期
    關(guān)鍵詞:嗜血血清型金黃色

    寧 昆 沈莉萍 徐 鋒

    (上海市動物疫病預(yù)防控制中心, 上海 201103)

    副豬嗜血桿菌病又稱豬革拉斯病,是由副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPS) 引起豬的一種以高熱、呼吸道紊亂、關(guān)節(jié)腫脹、中樞神經(jīng)癥狀及高死亡率為特征的疾病。該病在臨床上以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和漿膜炎為主要病變特征,又稱多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎。HPS 血清型眾多,可分為15 個(gè)血清型,命名為1~15 型,另有約20%分離株尚不能分型。HPS 屬于典型的“機(jī)會主義”病原,在機(jī)體遭受應(yīng)激或感染病毒性疾?。ㄈ绺咧虏⌒载i藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒感染、豬瘟)導(dǎo)致免疫力下降時(shí),可以侵入機(jī)體引起發(fā)病[1]。本菌可使2周齡到4 月齡的豬感染發(fā)病,尤其以5 周齡至8 周齡斷奶前后和保育階段的豬比較常見,發(fā)病率10%~15%,病死率可達(dá)50%[2],給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重威脅著全世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

    本研究通過對上海地區(qū)健康豬群進(jìn)行監(jiān)測,以期了解副豬嗜血桿菌在健康豬群中的攜帶情況,為上海地區(qū)副豬嗜血桿菌病的防控提供技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品來源

    2018 年在上海2 個(gè)規(guī)?;i場采集豬唾液20 份、豬鼻拭子60 份。所采集的樣品經(jīng)保溫箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,當(dāng)天進(jìn)行檢測。

    1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

    胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、Columbia 血瓊脂基礎(chǔ)購自BD 公司,輔酶I(NAD)購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;無菌脫纖維羊血購自杭州新銳生物工程有限公司;小牛血清購自Thermo 公司;Premix 購自TaKaRa 公司;引物由上海桑尼生物科技有限公司合成;質(zhì)譜樣品處理基質(zhì)液(VITEK MS-CHCA)購自生物梅里埃公司;微量生化鑒定管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

    1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

    副豬嗜血桿菌HP80 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈,金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸埃希菌ATCC 8739 購自ATCC。

    1.1.4 儀器

    全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(VITEK MS)購自生物梅里埃公司;PCR 儀(PTC-200)購自伯樂公司;恒溫箱購自Thermo 公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

    在生物安全柜中用接種環(huán)蘸取樣品,劃線接種于含5%小牛血清和0.1 g/mL 的TSA 平板上,于37℃培養(yǎng)48 h;挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色;挑取可疑菌落,接種于含5%小牛血清和0.1 g/mL 的TSA 平板進(jìn)行純培養(yǎng)。

    無菌挑取純培養(yǎng)后的菌落,平行劃線于無NAD 的綿羊血平板上,再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線接種,于37℃培養(yǎng)24~48 h,觀察菌落生長情況。

    1.2.2 細(xì)菌的生化、PCR 和質(zhì)譜鑒定

    挑取可疑菌落分別接種于葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露醇和木糖微量生化鑒定管中,鑒定管中每管按10 μg/mL 終濃度的NAD,于37℃培養(yǎng)24 h。同時(shí),對可疑菌落進(jìn)行硝酸鹽還原試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)和氧化酶試驗(yàn)。

    挑取3~5 個(gè)可疑菌落于含100 μL 去離子水的離心管中,100℃水浴10 min,8 000 r/min 離心5 min,吸取上清作為模板。使用筆者團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的副豬嗜血桿菌16s rRNA 引物(見表1)進(jìn)行擴(kuò)增。副豬嗜血桿菌反應(yīng)體系如下:premix 12.5 μL,DEPC 水8.5 μL,上下游引物各1 μL,模板2 μL;反應(yīng)條件為:95℃2 min;94℃30 s,58℃1 min,72℃1.5 min,擴(kuò)增33 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

    于鑒定前一天接種副豬嗜血桿菌HP80 和質(zhì)控株ATCC 8739,使用全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(VITEK MS) 按照操作步驟對HP80、ATCC8739 和可疑菌落進(jìn)行鑒定,讀取鑒定結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 分離培養(yǎng)

    經(jīng)48 h 培養(yǎng),TSA 平板上生長出的可疑菌落直徑約1~2 mm,不溶血、半透明、圓形隆起、邊緣整齊、光滑濕潤。經(jīng)革蘭氏染色,可疑菌落呈革蘭氏陰性短桿狀,大小約0.5 μm×(1.5~2.0) μm。將可疑菌落純培養(yǎng),24 h 后出現(xiàn)上述菌落形態(tài)。

    可疑菌落和金黃色葡萄球菌一起培養(yǎng)后出現(xiàn)“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”,即在金黃色葡萄球菌旁邊的可疑菌落較大,遠(yuǎn)離金黃色葡萄球菌的可疑菌落較小。

    2.2 鑒定

    可疑菌落的生化試驗(yàn)結(jié)果見表2,可以看到,所分離的細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖、半乳糖,不發(fā)酵乳糖、甘露醇和木糖。觸酶試驗(yàn)陰性,硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性,尿素酶試驗(yàn)陰性,氧化酶試驗(yàn)陰性。

    表2 細(xì)菌的生化反應(yīng)結(jié)果

    PCR 檢測結(jié)果見圖1,可疑菌落出現(xiàn)275 bp 的目的條帶,20 份豬唾液中檢測出1 份陽性,60 份豬鼻拭子中檢測出5 份陽性。

    使用VITEK MS 對可疑菌落進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定,見圖2,結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的副豬嗜血桿菌同源性達(dá)到75%以上。綜合上述分離鑒定結(jié)果,判定為副豬嗜血桿菌。

    圖1 副豬嗜血桿菌的PCR 鑒定結(jié)果

    圖2 副豬嗜血桿菌的質(zhì)譜鑒定圖

    3 討論

    副豬嗜血桿菌病相對于其他疾病較難防控的原因有:一是目前該菌已確定的血清型有15 種,各血清型之間的交叉保護(hù)力較弱或者沒有。有研究表明,已經(jīng)接種過滅活菌苗的豬群也會因缺乏交叉保護(hù)而致免疫失敗。二是該菌屬于機(jī)會性致病菌,在豬群整體狀態(tài)較好時(shí)不發(fā)病,容易被豬場管理者忽視,但是在豬群存在豬藍(lán)耳病或圓環(huán)病毒病時(shí),HPS 易繼發(fā)感染,該菌的分離率會增加[3];或者在豬群遇到氣溫驟降、運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激條件下,也會增加感染的風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此,防治本病的前提是做好飼養(yǎng)管理,提高豬群免疫力,采取疫苗加抗生素相結(jié)合的綜合防控措施。具體來講,需要做到如下幾點(diǎn)。

    一是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,改善飼養(yǎng)條件。保育階段是豬發(fā)生副豬嗜血桿菌病的高發(fā)年齡段,在仔豬斷奶后到保育舍時(shí),由于保育舍溫度較低,仔豬受到寒冷應(yīng)激之后抵抗力下降,此時(shí)容易感染副豬嗜血桿菌這類條件致病菌。所以在轉(zhuǎn)舍時(shí),將保育舍的溫度提高到同產(chǎn)房的溫度,而后每天緩慢降低。

    二是做好免疫抑制性疾病的預(yù)防。副豬嗜血桿菌常繼發(fā)于圓環(huán)病毒病、藍(lán)耳病和支原體肺炎等免疫抑制性疾病,所以對于本病的預(yù)防應(yīng)該從這幾種病入手,做到及時(shí)免疫。

    三是合理使用藥物。副豬嗜血桿菌對恩諾沙星、頭孢噻呋等比較敏感。對于本病的治療應(yīng)該盡早,如果在發(fā)病后期則治愈率較低。同時(shí),在治療時(shí)一定要找到病因,找到原發(fā)病,然后配合該菌的敏感藥物就可以較好地治愈本病。

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